Name: 의 내부 기관 관리 헤모필루스 인플루엔자 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 마우스 하기도 내 Haemophilus influenzae 기관내 접종 기술로 세균 감염 시 폐 면역 반응과 염증 조절 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 폐 염증성 질환 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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원고를 비판적으로 읽어주신 Carson Harrod 박사님께 감사드립니다. 또한 Minghui Zeng 씨와 Mahesh Kathania 박사, Prashant Khare의 기여에 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 학회(American Cancer Society, Research Scholar 보조금, 122713-RSG-12-260-01-LIB) 및 Sammons Cancer Center(파일럿 프로젝트 보조금)의 지원을 받았습니다.

모든 실험은 베일러 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다. 1. 배양 비 typeable 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)과 접종 준비 <ol><li> 초콜릿 한천 플레이트 접시 NTHi를 37 ° C, 5 % CO 2에서 하룻밤 가습 CO 2 배양기에서 거꾸로 판을 유지한다. 다음 날, 문화 뇌 심장 주입 국물에 박테리아. 그런 다음, 멸균 1.5 ML 튜브로 국물 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 4000 × g으로 원심 분리기. 그 다음, 상층 액을 제거하고 멸균 1X PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 분광 광도계로 파장 600nm에서의 희석 배양 흡광도 1X PBS 900 μL에 재현 탁 용액 100 μl를 전송하고 측정한다. </li><li> 생존 및 집락 형성 단위를 결정초콜렛 아가 플레이트에 1시 10분 연속 희석을 배양 CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양하고 5 % 접종 S (CFUs). </li><li> 이전 단계에서 결정된 가능성에 기초하고 CFUs, 20 × 106 CFU / ml의 최종 농도로 접종을 조정한다. </li></ol> 2. 인트라 기관 (IT) 점적 <ol><li> 150 ㎎ / ㎖ + 케타민 20 ㎎ / ㎖ 용액과 자일 라진 마우스 0.1 ml / 10 g 체중으로 마우스의 복강 (IP)을 주입한다. 절차는 동물을 따뜻하게 유지하는 광원과 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하기 위해 마우스의 인터 공간을 꼬집어. </li><li> 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 목 복부 영역을 면도 클로르헥시딘, 70 % 에틸 알코올로 소독. </li><li> 쥐 치아 집게를 사용 넥 부의 상부 복부 피부를 리프트. 메스를 이용하여 흉선 상기 작은 절개 (0.5-1.0 cm)를 만들기조심스럽게 기관을 노출 근육을 해부하다. <ol><li> 27 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여 서서히 다른 0.05 ㎖의 공기 다음 컨트롤과 같은 제 1 염에서 얻어진 용액 0.05 NTHi 다음 0.05 ml의 공기를, 주사. 약 1 분 동안 수직 동물을 유지합니다. </li></ol></li><li> 수술 접착제와 절개를 닫습니다. 약 10 분 동안 옆으로 누운 따뜻한 마우스를 유지합니다. </li></ol> 3. BALF 컬렉션 <ol><li> 감염 후 자궁 전위 24 시간으로 마우스를 희생. </li><li> 해부 가위와 마우스의 복강을 열고 출혈 복부 대동맥을 잘라. 폐의 복부 부분을 노출. </li><li> 기관을 노출하고 20 게이지 카테터를 삽관. BALF 버퍼의 0.8 ㎖ (1X PBS, 0.1 % 덱 스트로스, 10 U / ㎖ 헤파린)를 주입하고 부드러운 흡입에 의한 세척를 수집합니다. 이 과정을 세 번 반복합니다. </li><li> hemocyto BALF를 사용하여 현탁액 100 ㎕의 세포의 총 수를 카운트트리 판 블루 염색으로 10 배 배율 아래 미터. </li><li> 수정 김사 염색 슬라이드를 준비합니다. 5 분 500 XG에 cytospin 원심 분리기의 적절한 우물에 폐포 세척액의 나누어지는 100 μL. 10 분 동안 슬라이드를 건조 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 수정 김사 염색을 사용하여 세포를 얼룩. </li><li> 이러한 개화 (FACS) 정렬 활성화 세포, 공 초점 현미경, 유전자 발현 및 웨스턴 블롯 11-13 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 사용합니다. </li></ol> 4. 조직 병리학 준비 <ol><li> 단계 2.4에 설명 된대로 조직 병리학 분석을 위해, NTHi와 마우스를 감염. 감염 24 시간 후 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 폐와 앞서 언급 한 바와 같이 기관을 노출 해부 가위로 흉강을 열고 잘라. 그리고, 기관에 20 게이지 카테터를 삽입합니다. </li><li> 4 % 포르말린에서 제조 된 2 % 따뜻한 아가로 오스 용액으로 폐를 입력합니다. 일단폐는 완전히 아가로 오스 솔루션을 응고 폐의 상단에 장소 얼음, 팽창된다. </li><li> 그런 다음, 조심스럽게 흉부 플러그를 제거하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 부분에 대한 처리 될 때까지 1X PBS에서 4 % 포르말린 50 ㎖ 용액에 넣어. </li></ol> BALF에서 세포를 염색 5. FACS <ol><li> 96 웰 V 바닥 마이크로 타이 터 플레이트에 BALF 유체 1 × 10 5 세포를 넣습니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 300 차가운 1X PBS의 μL 및 스핀 세포를 씻으십시오. </li><li> (1 : 1000 희석) 1X PBS 100 ㎕를 세포 염색 용액으로 세포를 염색하고 15 분 동안 실온에서 유지한다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 차가운 1X PBS 300 μL와 세포를 씻으십시오. </li><li> 하나를 포함 FACS 세척 완충액 [세척 완충액 (1X PBS, 2 % FBS, 1 mM의 EDTA, 0.1 % 나트륨 아 지드] 100 ㎕에 세포를 유지 : 100 희석 된 Fc 블록을 4 ℃에서 15 분 동안. </li><li> 4,000 XG에 원심 분리기 세포 3 분 및 저녁을 먹다 폐기ernatant. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 FACS 세척 버퍼 (100 희석 1) 100 ㎕의 표면 얼룩 칵테일 얼룩 세포. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 4,000 XG에 FACS 세척 버퍼 300 μL로 세 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕에 세포를 고정한다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 400 XG에서 PBS 1 배 300 μL로 두 번 세포를 씻고 FACS 세척 버퍼 300 μL에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 비드 유동 세포 계측법을 사용하여 단색 오염 제어를 만든다. <ol><li> 96 웰 V 바닥 마이크로 리터 판에 구슬 한 방울을 추가하고 PBS 1 배 200 μL 세척. </li><li> PBS와 구슬 1 배 100 μL에 염색 항체의 1 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. </li><li> PBS 1 배 300 μL로 두 번 구슬을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 14 유동 세포 계측법에 의해 단일 염색 컨트롤과 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> RNA를 분리하기 위해 폐 조직의 균질화 6. <ol><li> 감염 후 폐 (20 ~ 40 mg)의 작은 조각을 수집하고 밤새 4 ° C에서 시약을 안정화 RNA에 보관합니다. 그리고, 다음 단계까지 -80 ℃에서 보관. </li><li> RNA 안정화 시약 없애 차가운 1X PBS의 폐 조직을 씻으십시오. </li><li> 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브 포함 용해 버퍼 (1 ml의 용해 버퍼 + 10 μL의 β-머 캅토 에탄올)로 조직을 놓습니다. </li><li> 뾰족한 가위를 사용하여 작은 조각으로 조직을 잘라 및 20 ~ 40 초 동안 무선 모터 펠렛 유봉을 사용하여 균질화. </li><li> 5 분 동안 얼음에 해물을 유지하고 단계 7.1를 진행합니다. </li></ol> 폐 7. RNA 분리 <ol><li> 3 분 동안 18,000 XG에 해물을 원심 분리기. 피펫으로 상층 액을 제거하고 조심스럽게 새로운 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 해물을 70 % 에탄올 1 볼륨을 추가합니다. 피펫 즉시 혼합하고 2-4 분 동안 기다립니다. </li><li> 배치 스핀 컬럼에 해물의 700 μL까지 이동2 ml의 포집 관에서. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 원심 분리기와 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 350 μL에게 엄격한 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> I 직접 스핀 컬럼 막에 80 μL의 DNase를 추가하고 실온에서 15 분 동안 유지. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl의 엄격한 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 15 초 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 2 분 동안 9,600 XG에 500 ㎕의 RNA 세척 버퍼와 스핀을 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 9,600 XG에 새로운 2 ㎖의 수집 튜브와 원심 분리기에 스핀 열을 놓습니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 9,600 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기에 직접 30 ~ 50 μL의 RNase없는 물을 추가합니다. -80 ° C에서 보관 RNA. </li><li> RNAseq 분석 (14)을 수행합니다. </li></ol>

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여기서, 우리는 박테리아 폐 병원체와 마우스의 폐를 접종 독특하고 최소 침습 절차를 설명합니다. 우리는이 절차 염증성 신호 전달 경로의 유전자 결핍 마우스를 이용하여 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 바이러스 및 진균 감염에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 이러한 비내 에어로졸 또는 흡입 같은 다른 방법을 통해이 절차의 이점 (1)이 절차에서 병원성 접종 직접 하부 호흡기 점적되며 (2) 균액의 크기를 제어 할 수있는 기능; (3) 박테리아 핸들러 노출 위험을 감소시켰다. 수술 박테리아 주입 용 기관의 노출 치료가 주위 조직, 특히 혈관 손상을주지 않도록주의해야 중요한 단계이다. 기관 쉬에 박테리아의 점안에 의한 질식으로 마우스의 사망 가능성을 방지하기 위해주의 깊게 수행 할 수 울드. 접종 (50 μL)을 천천히 출시 및 공기 전과 접종 후 주입하는 것이 좋습니다...

염증은 감염 인자에 대한 방어의 기본 면역 메커니즘입니다. 그것은 병원균 퇴치 및 손상된 조직의 복구를 촉진한다. 또한, 일반 건강 상태 1로 회복을 용이하게한다. 그러나, 조절 이상 염증은 종종 만성 염증성 질환이 리드. 기도 염증은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 및 폐 섬유증과 같은 3 가지 폐 질환의 초기 트리거이다. 비 typeable (봉입) 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi)의 상부 및 하부 만성 폐 염증성 질환 4,5-와 연관된다. 그것은 만성 폐쇄성 폐 질환 4,6,7 어린이와 성인의 하부기도에서 분리 지배적 인 종이다. NTHi 감염 후 염증 반응은 (예컨대 TNF 및 IL-1β와 같은) 염증성 사이토킨의 상향 조절이 특징이며, B를 매개y를 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 수신자와 같은 수용체를 통해 핵 인자 κB (NF-κB) (TLR에) 8. 마우스 모델 때문에 서로 다른 유전자가 결핍 된 라인의 가용성의 폐 염증성 질환의 기본 병리학을 분석하는 매우 유용한 도구입니다. 여러 방법은 비내 점적 및 에어로졸 흡입 9,10- 포함한 실시간 / 감쇠 박테리아와 세균 제품을 접종하는데 사용되었다. 여기, 우리는 내 기관 점안을 보여줍니다. 덜 빈번하게 사용되지만,이 방법은 더욱 효율적이고 때문에 하부 호흡기 접종원 직접 전달 재현성이다.

<table><tbody><tr><td>초콜릿 아가 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로스 무수</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft 빠른 솔루션</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘 20/26G&nbsp;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml 주사기</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>카테터 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>해부 가위, 스트레이트, 10cm 길이의</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>홍채 집게, 톱니형, 10cm 길이의</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 #5 스테인리스 스틸, 11cm 길이</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% 포르말린</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>펠렛 페스티유 모터(조직 균질화기)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로타이터 플레이트 V 하단</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>작업 희석 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>작동 희석 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액 (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 고정성 아쿠아 데드 셀 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs 튜브 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

여기, 우리는 효율적으로 자세한 절차를 설명하고 직접 헤모필루스 인플루엔자를 제공 마우스의 하부 호흡기로. 우리는 H. 제조 과정을 보여 인플루엔자 접종, H.의 내부 기관 점안 폐에 인플루엔자, 차동 유전자 발현 분석을위한 기관지 폐포 세척액 (BALF), 폐포 세척액에서 면역 세포의 분석 및 RNA 분리의 컬렉션입니다. 이 절차는 임의의 박테리아, 바이러스 또는 진균에 폐 염증 반응을 연구하는데 사용될 수있다. 적은 모호성으로보다 효율적으로 하부 호흡기로 세균 접종을 제공하기 때문에 직접 기관 점안은 주로 비강 내 또는 에어로졸 흡입 절차를 통해 바람직하다.

내 기관 점안은 식염수 설치보다 폐포 세척액 (그림 1A, 왼쪽 패널)에서 백혈구의 현저하게 증가 된 수의 결과. 백혈구의 미분 계수 분석 분명히 증가 호중구 침윤 (도 1, 오른쪽 패널)을 보였다. BALF에서 세포의 FACS 분석은 상기 호중구 수의 증가 (도 1b)를 확인했다. 폐 조직을 H &amp; E 염색 섹션의 조직 학적 분석은기도 염증 (도 1C)을 증가 하였다. 이러한 데이터 집합 내 기관 점안은 생쥐의기도 염증을 유도하는 것이 좋습니다. 기도 기전을 조절하는 신호 전달 경로를 연구를 위해이 방법의 사용을 지원하기 위해, 우리는 E3 유비퀴틴 리가 가려움에 대한 결핍 마우스를 사용 하였다. 가려움은 15 염증성 신호 전달 경로를 조절에 관여하는 것으로 알려져있다. 우리는 접종나이와 성별을 일치 야생형 C57BL /...

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

본 실험의 전반적인 목표는 세균 감염 시 폐에서 일어나는 면역 반응을 연구하는 것입니다. 이는 폐 염증을 억제하거나 촉진하는 핵심 조절 기전과 유전자가 무엇인지와 같은 폐 염증 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세균 접종물을 하기도로 직접 전달하기 때문에 매우 효율적이며 재현성이 높다는 점입니다.먼저, chocolate agar 플레이트에 NTHi를 도말합니다. 플레이트를 뒤집어 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, brain-heart infusion broth에서 박테리아를 배양합니다.그 다음, 마이크로원심분리 튜브에 배양액 1 mL를 넣습니다. 상온에서 4,000 g로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠렛을 1 mL의 PBS에 재부유시킵니다.이 세척 단계를 한 번 더 반복하십시오. 다음으로, 재현탁액 100 µL를 PBS 900 µL에 희석하고, 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하십시오. 이 정보를 바탕으로 접종균 농도를 mL당 20 million CFU가 되도록 조정하십시오.다음으로, 접종균의 생존율과 CFU를 측정합니다. 배지를 1단계에서 10단계까지 연속 희석하여 초콜릿 한천 배지에 배양하고, 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취가 적절히 되었는지 확인하는 것으로 시작합니다.그 다음, 마우스를 배면으로 눕히고 목의 복측 부위를 제모합니다. 노출된 피부를 소독합니다. 이제 쥐 치과용 포셉(rat tooth forceps)으로 목의 상부 복측 피부를 들어 올리고, 메스를 사용하여 흉선 위쪽으로 0.5~1cm 길이의 절개를 실시합니다.그 다음, 근육을 조심스럽게 분리하여 기관지를 노출시킵니다. 기관지에 공기 50 µL를 천천히 주입한 후, 준비된 NTHi 50 µL를 주입하고, 이어서 다시 공기 50 µL를 주입합니다. 음성 대조군 실험의 경우, NTHi 대신 식염수를 주입합니다.주입 후, 동물을 약 1분 동안 수직 상태로 유지합니다. 그런 다음 조직 접착제로 절개 부위를 봉합하고, 마우스를 약 10분 동안 측와위 상태로 따뜻하게 유지합니다. 감염 24시간 후, 감염된 동물을 안락사시키고 해부 가위로 복강을 엽니다.그런 다음, 복측 대동맥을 절단하여 동물을 출혈시킵니다. 이어서 기관에 접근하기 위해 폐의 복측 부분을 노출시킵니다. 20 gauge 카테터를 사용하여 기관에 삽관합니다.카테터를 사용하여 0.8 milliliters의 BALF 완충액을 주입하고 치과용 흡입기로 세척액을 수집합니다. 이 과정을 세 번 더 반복하여, 총 네 번의 세척 수집액을 하나의 현탁액으로 모읍니다. 100 microliter의 분취액을 취해 2,000 RPM에서 2분 동안 원심 분리합니다.상층액을 제거하고 RBC 용해 버퍼에 다시 부유시킵니다. 원심 분리 후 펠렛을 1x PBS로 다시 부유시킵니다. 이제 트립판 블루 염색을 거친 현탁액 100 microliters를 취해, 혈구계수기를 사용하여 10배 배율에서 총 세포 수를 측정합니다.그런 다음, 세포 염색을 위한 슬라이드를 준비합니다. BALF 현탁액 100 µL를 사이토스핀 슬라이드의 적절한 웰에 분주하고, 500 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이후 슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시킨 다음, 제조사의 프로토콜에 따라 변형된 Giemsa 염색법을 사용하여 세포를 염색합니다.남은 세포는 FACS, 공초점 현미경 관찰 등의 후속 분석에 사용하십시오. 감염된 폐에서 세척액을 수집한 후, 20-40 mg의 폐 조직 조각을 취해 RNA 안정화 시약에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 다음, -80 °C에서 장기 보관하십시오. 분석 준비가 되면, 냉각된 PBS로 폐 조직 샘플을 세척하여 RNA 안정화 시약을 제거하십시오.그 다음, 조직을 beta mercaptoethanol이 포함된 용해 버퍼가 들어 있는 1.5 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 이어서 작은 가위로 조직을 잘게 자른 후, 전동 페스틀을 사용하여 20-40초 동안 균질화합니다. 용해물을 얼음 위에 5분간 둔 다음, 18, 000 g's에서 3분 동안 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 70% ethanol을 동일한 부피로 첨가하고 혼합물을 분쇄(triturate)합니다. 혼합물을 25 °C에서 2~4분 동안 방치합니다.그 후, 최대 700 µL를 2 mL 컬렉션 튜브가 장착된 스핀 컬럼으로 옮기고, 컬럼을 9600 ×g에서 15초 동안 원심 분리합니다. 통과액은 버리고, 세척 버퍼 350 µL를 추가한 뒤 스핀 과정을 반복합니다. 다음으로, 멤브레인을 DNase I Solution 80 µL와 함께 실온에서 15분 동안 반응시킵니다.그 다음, 컬럼에 세척 버퍼 350 µL를 넣고 원심분리를 반복합니다. 이어서 RNA 세척 버퍼 500 µL를 넣습니다. 짧게 원심분리한 후, 통과액을 제거합니다.RNA 세척 완충액으로 두 번 세척합니다. 마지막으로, 새로운 수집 튜브 위에 컬럼을 놓고 RNase-free water 30-50 µL를 컬럼에 직접 가한 뒤 1분 동안 원심분리하여 통과액으로 RNA 샘플을 수집합니다. 본 절차는 정상 건강한 마우스를 대상으로 기술된 바와 같이 수행되었습니다.식염수 처리 대조군과 비교하여 NTHi를 접종한 마우스의 기관지폐포 세척액(BALF)에서는 백혈구 수가 현저히 증가한 것으로 나타났습니다. 백혈구의 감별 계수 분석 결과, 호중구 침윤이 증가했음이 명확히 드러났습니다. BALF 내 세포의 FACS 분석을 통해 호중구 수의 증가가 추가로 확인되었습니다.HNE 염색된 폐 조직 절편은 기도 염증의 증가를 보여줍니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 기관 내 투여가 마우스에서 기도 염증을 유발함을 시사합니다. 돌연변이 및 대조군 마우스를 이용한 유사한 실험에서, 전장 전사체 시퀀싱을 통해 폐 조직 RNA를 분석하였습니다.야생형 대조군과 비교했을 때, Itch 결핍은 여러 유전자의 차별적 발현을 초래했습니다. Itch는 염증성 신호 전달 경로의 조절자로 생각되므로, 이 결과는 새로운 연구를 촉진하는 데 활용될 수 있습니다. 이 기술은 개발 전 과정에 걸쳐 폐 질환 분야의 연구자들이 폐 감염 및 염증 발생 시 면역 세포 내의 세포 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 실험 과정을 수행할 때는 기관 노출 및 기관 내 세균 주입과 같은 단계에서 각별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 숙련되면 기관 내 주입은 10분 이내에 완료할 수 있으며, 바이알 액체 수집은 10-15분 이내에 가능합니다. 본 절차 이후에는 어떤 유전자가 상향 조절 또는 하향 조절되었는지와 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 RNA sequencing, flow cytometry 및 immunoblocking 등의 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Venuprasad, K., et al. 기도 염증을 연구하기 위한 마우스 모델에서 헤모필루스 인플루엔자의 기관내 투여. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 하기도 감염을 모델링하기 위해 마취된 마우스에 폐 병원성 박테리아 접종물을 기관내 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 기관내 박테리아 전달 수행

출처: Venuprasad, K., et al. 기도 염증을 연구하기 위한 마우스 모델에서 헤모필루스 인플루엔자의 기관내 투여. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 다운스트림 분석을 위해 유형화할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자 에 감염된 안락사된 마우스로부터 기관지폐포 세척액을 수집하고 처리하는 방법을 보여줍니다.

유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자에 감염된 마우스 모델의 기관지폐포 세척액 수집

출처: Lenhard, A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 인플루엔자 바이러스가 폐 렴구 균을 정착자에서 병원체로 전환시키는 쥐 공동 감염 모델을 보여줍니다. 박테리아 정착, 바이러스 감염, 질병 진행에 관련된 단계를 개괄합니다.

바이러스 공동 감염 후 폐렴구 균 의 병원성 전이를 연구하기 위한 마우스 모델

우리는 2.0 mm 검경과 이경을 사용하여 직접 후두경을 통해 마우스에서 기관 내 삽관을위한 간단하고 신뢰할 수있는, 그리고 상대적으로 저렴한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 atraumatic이고 만성 실험에서 반복 측정에 사용될 수있다. 우리는 우수한 기관 절개 또는 이전에 비수술 적 방법을보고 찾을 수 있습니다.

마우스의 기관 내 삽관<em&gt;를 통해</em이경 사용&gt; 직접 후두경

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마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

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삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

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