의 내부 기관 관리 헤모필루스 인플루엔자 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

이 실험의 전반적인 목표는 박테리아 감염 중 폐의 면역 반응을 연구하는 것입니다. 이 문제는 폐 염증을 억제하거나 촉진하는 주요 조절 메커니즘 및 유전자가 무엇인지와 같은 폐 염증 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 박테리아 접종물을 하기도로 직접 전달하기 때문에 매우 효율적이고 재현성이 높다는 것입니다.

시작하려면 초콜릿 한천 접시에 NTHi를 접시에 담습니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 밤새 접시를 거꾸로 배양합니다. 다음 날, 뇌-심장 주입 육수에 박테리아를 배양합니다.

그런 다음 마이크로 원심분리기 튜브에 육수 1ml를 넣는다. 믹스를 4, 000g으로 실온에서 5분 동안 돌립니다. 그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 PBS 1ml에 재현탁합니다.

이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 재현 탁 용액을 900 마이크로 리터의 PBS에 희석하고 600 나노 미터에서 배양의 흡광도를 측정한다. 이 정보를 사용하여 접종물을 밀리리터당 2,000만 CFU로 조정합니다.

다음으로, 접종의 생존력과 CFU를 측정합니다. 초콜릿 한천 플레이트에 육수를 1-10 회 연속으로 희석하여 배양하고 밤새 플레이트를 배양합니다. 마우스를 마취하고 발가락 꼬집음을 사용하여 적절하게 마취되었는지 확인하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 마우스를 누운 위치에 놓고 목의 복부 부분을 면도합니다. 노출된 피부를 소독합니다. 이제 쥐 이빨 집게로 목의 상부 복부 피부를 들어 올리고 메스를 사용하여 흉선 위로 1/2에서 1cm 정도 절개합니다.

그런 다음 근육을 조심스럽게 분리하여 기관을 노출시킵니다. 기관에 50 마이크로 리터의 공기를 천천히 주입 한 다음 50 마이크로 리터의 준비된 NTHi, 50 마이크로 리터의 공기를 주입합니다. 음성 제어 절차의 경우 NTHi 대신 식염수를 주입합니다.

주사 후 약 1분 동안 동물을 수직으로 유지하십시오. 그런 다음 조직 접착제로 절개 부위를 닫고 약 10분 동안 마우스를 옆으로 누운 상태로 따뜻하게 유지합니다. 감염 후 24시간이 지나면 감염된 동물을 안락사시키고 해부학적 가위로 복강을 엽니다.

그런 다음 복부 대동맥을 잘라 동물의 출혈을 유발한다. 다음으로, 기관에 접근할 수 있도록 폐의 복부 부분을 노출시킵니다. 20게이지 카테터로 기관을 삽관합니다.

카테터를 사용하여 0.8ml의 BALF 완충액을 주입하고 치아 흡인으로 세척을 수집합니다. 이 절차를 세 번 더 반복하여 4개의 세척 컬렉션을 단일 현탁액으로 풀링합니다. 100마이크로리터 분취액을 2, 000RPM으로 2분 동안 회전시킵니다.

상층액을 제거하고 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 스핀다운하고 1x PBS로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이제 트리판 블루 염색과 함께 10배 배율로 혈구계를 사용하여 현탁액의 100마이크로리터에 있는 총 세포 수를 계산합니다.

그런 다음 세포를 염색하기 위한 슬라이드를 준비합니다. 100마이크로리터의 BALF 현탁액을 사이토스핀 슬라이드의 적절한 웰에 분취하고 500g에서 5분 동안 슬라이드를 회전시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 10분 동안 건조시키고 제조업체의 프로토콜에 따라 변형된 Giemsa 염색을 사용하여 세포를 염색합니다.

나머지 세포는 사실, 컨포칼 현미경 검사 등과 같은 후속 분석을 위해 사용합니다. 감염된 폐에서 세척액을 채취한 후 20-40mg의 폐 조각을 채취하여 섭씨 4도의 RNA 안정화 시약에 하룻밤 동안 배양한 다음 섭씨 80도에서 장기 보관합니다. 준비가 되면 폐 조직 샘플을 차가운 PBS로 세척하여 RNA 안정화 시약을 제거합니다.

그런 다음 베타 메르캅토에탄올이 함유된 용해 완충액이 들어 있는 1.5ml 원심분리 튜브에 조직을 넣습니다. 다음으로, 작은 가위로 조직을 조각으로 자르고 전동 절굿공이를 사용하여 20-40초 동안 조각을 균질화합니다. 얼음에 용해물을 5분 동안 유지한 다음 18, 000g에서 3분 동안 돌립니다.

상등액을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 70 % 에탄올 1 부피를 추가하고 혼합물을 분쇄합니다. 혼합물을 섭씨 25도에서 2-4분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 최대 700마이크로리터를 2밀리리터 수집 튜브의 스핀 컬럼으로 옮기고 9600g에서 15초 동안 컬럼을 원심분리합니다. 플로우 스루를 버리고 350마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 스핀을 반복합니다. 다음으로, 실온에서 15분 동안 80마이크로리터의 DNase I 용액으로 멤브레인을 배양합니다.

그런 다음 350마이크로리터의 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 회전을 반복합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 짧은 회전을 반복하고 플로우 스루를 버립니다.

RNA 세척 버퍼로 두 번 세척합니다. 마지막으로, 새로운 수집 튜브 위에 30-50마이크로리터의 RNase-free 물을 컬럼에 직접 추가하고 1분 동안 회전시켜 플로우 스루에서 RNA 샘플을 수집합니다. 절차는 정상적이고 건강한 마우스에 대해 설명된 대로 수행되었습니다.

기관내 설치는 식염수 처리 대조군에 비해 NTHi를 접종한 마우스의 기관지폐포 세척액에서 백혈구 수를 현저히 증가시켰습니다. 백혈구의 차등 계수 분석은 호중구 침투가 증가했음을 분명히 보여줍니다. BALF에 있는 세포에 대한 사실 분석은 호중구의 수가 증가했음을 추가로 확인합니다.

폐 조직의 HNE 염색 부위는 기도 염증이 증가한 것으로 나타납니다. 총체적으로, 이러한 데이터는 기관내 설치가 마우스에서 기도 염증을 유발한다는 것을 시사합니다. 돌연변이 마우스와 대조 마우스를 사용한 유사한 실험에서 폐 조직 RNA는 전체 전사체 염기서열 분석으로 분석되었습니다.

야생형 대조군과 비교했을 때, 가려움증 결핍은 여러 유전자의 발현을 다르게 만들었습니다. 가려움증은 염증 신호 전달 경로를 조절하는 것으로 생각되므로 이 결과는 새로운 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있습니다. 개발 과정에서 이 기술은 폐 질환 분야의 연구자들이 폐 감염 및 염증 중 면역 세포의 세포 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 기관 노출 및 기관에 박테리아 설치와 같은 절차 중에 추가 예방 조치를 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 마스터하면 10분 이내에 기관 내 설치를 수행할 수 있으며 바이알 액체는 10-15분 이내에 수집할 수 있습니다. 이 절차 후에 RNA 염기서열분석, 유세포 분석 및 면역 차단과 같은 추가 문제를 수행하여 상향 조절 또는 하향 조절되는 유전자와 같은 추가 질문을 해결할 수 있습니다.