Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

활성 형태의 원형질막 관련 Ras 단량체(구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질)는 Ras 결합 도메인을 통해 Ras에 결합하는 비활성 단백질 키나아제인 Raf를 모집합니다.

이 결합은 다운스트림 신호 전달 과정을 유발하는 기능적 Ras-Raf 복합체를 생성합니다.

세포내 Ras-Raf 상호작용을 시각화하려면 챔버가 잘 있는 슬라이드에 유전자 조작 세포를 현탁시키는 것으로 시작합니다. 이 세포는 두 개의 비형광 융합 단백질을 발현하는데, 하나는 N-말단을 통해 광활성화성 형광단의 절반에 연결된 Ras로 구성되고, 다른 하나는 C-말단에서 동일한 형광단의 나머지 절반에 융합된 Raf입니다.

세포 내부에서 Ras 함유 융합 단백질은 원형질막에 도킹하고 Raf 함유 융합 단백질과 상호 작용하여 형광 단백질의 단편을 완전한 광활성화 형광단으로 재구성합니다. Ras 및 Raf 결합이 없기 때문에 두 개의 형광단 반쪽이 분리된 상태로 유지됩니다.

슬라이드에 고정 시약을 추가합니다. 고정 분자는 단백질과 가교를 형성하고 단백질 복합체를 안정화시킵니다.

고정 시약을 제거하고 이미징 완충액을 추가합니다. 슬라이드를 광활성화 국소화 현미경 세트인 PALM용 형광 현미경 아래에 놓습니다. 고강도 레이저로 세포를 비추어 형광 분자의 작은 하위 집합을 활성화합니다.

고해상도 형광 점으로 볼 수 있는 각 나노 크기의 단일 형광단 태그가 지정된 Ras-Raf 복합체에 의해 생성된 무작위로 발생하는 형광을 이미지

이미징을 위한 샘플을 준비하려면 350마이크로리터의 페놀 레드가 없는 DMEM에 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 웰당^약 5.5 x 10 4개의 안정적인 발현 세포를 플레이트합니다. 글루타르알데히드와 함께 신선한 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정하고, 고정액을 PBS 또는 이미징 완충액으로 교체한 후 100나노미터 금 입자를 소용돌이치고 이미징 중 스테이지 드리프트를 추적하기 위해 웰당 35마이크로리터를 추가합니다.

현미경에 접근하여 405 및 561 나노미터 레이저에 전력을 공급하십시오. 이 시점에서 셔터를 닫은 상태로 561나노미터 이색성 거울과 노치 필터가 제자리에 있는지 확인합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다.

EMCCD 카메라를 켜고 식히고 노출 시간을 100밀리초로 설정하고 EMCCD 게인을 적절한 값으로 설정합니다. 대물렌즈에 침지 오일을 추가하고 현미경 스테이지에 샘플을 고정합니다. 다음으로, 명시야 또는 561나노미터 레이저를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다.

Ras 및 기타 막 단백질을 이미징하려면 개구수가 1.49인 60X 아포크로마트 TIRF 대물렌즈를 사용하고 현미경을 TIRF 구성으로 가져옵니다.

TIRF 대물렌즈의 후면 조리개에 부딪힐 때 중심에서 벗어나도록 여기 레이저를 조정하면 커버슬립 버퍼 인터페이스에 도달할 때 레이저가 편향됩니다. 임계각에 도달하고 레이저가 다시 반사될 때까지 레이저 입사 위치를 계속 조정하십시오.

여러 금 입자가 보이는 이미지로 셀을 검색합니다. 그런 다음 셀 또는 셀의 영역과 금 입자를 둘러싸는 관심 영역을 설정합니다.

높은 발현 수준으로 인해 이미 충분한 활성화가 일어나고 있는 경우 405나노미터 레이저를 끄고 561나노미터 레이저를 켠 상태에서 획득을 시작합니다. 그렇지 않으면 공장 출하 시 최저 전력 설정에서 405나노미터 레이저를 켜고 프레임당 수십 개의 분자가 있을 때까지 점진적으로 증가시켜 단일 분자가 잘

데이터 수집이 계속됨에 따라 405나노미터 레이저 출력을 점진적으로 높여 스폿 밀도를 거의 일정하게 유지합니다. 높은 405 전력이 더 이상 활성화 이벤트를 시작하지 않을 때까지 이미지 수집을 계속합니다.