성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

이 실험의 전반적인 목표는 흥분성 시냅스(excitatory synapses)에서 방출된 후 성상세포막(astrocytic membranes)에서 글루타메이트가 제거되는 시간 경과를 추정하는 것입니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 광범위한 글루타메이트 수송체 길항제인 TBOA의 subs 포화 농도가 없거나 존재하는 경우 급성 뇌 절편의 성상세포에서 시냅스로 활성화된 글루타메이트 수송 발생을 기록하는 것입니다. 두 번째 단계는 시냅스로 활성화된 글루타메이트 수송 전류를 유발된 반응의 다른 모든 구성 요소로부터 분리하기 위해 기록을 분석하는 것입니다.

다음으로, 통제된 조건에서 기록된 수송 발생의 필터를 관련시켜 TBOA의 존재 하에 기록된 수송 전류를 분석하여 필터 시간 경과를 추정합니다. 성상세포막(astrocytic membranes)에서 글루타메이트 제거의 시간 경과를 구합니다. 그 결과, 쥐에서 해마 성상세포가 세포외 공간 기저에서 시냅스로 방출된 글루타메이트를 제거하는 데 몇 밀리초 밖에 걸리지 않는다는 것을 보여줍니다.

이 접근법은 생리학적, 병리학적 조건 동안 다른 뇌 영역에서 성상세포 흡수 능력의 변화를 감지할 수 있는 민감한 도구를 제공합니다. 예를 들어, 형광 글루타메이트 지표에서 빠르게 해리되는 글루타메이트 수용체 길항제의 치환 분석 또는 확산 반응 컴퓨터 시뮬레이션에 기반한 다른 방법에 비해 이 접근 방식의 주요 장점은 성상세포의 글루타메이트 제거에 대한 높은 시간 해상도, 직접적인 실험적 판독을 제공한다는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 뇌에서 시냅스 전달의 공간적, 시간적 역학을 이해할 수 있습니다.

알츠하이머병과 같은 특정 신경 질환에서 발생할 수 있는 글루타메이트, 확산 및 흡수의 병태생리학적 변화를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 메스로 절개된 쥐의 뇌를 다섯 번 자르는 것으로 이 절차를 시작합니다. 먼저 후각구와 전두엽 피질을 제거합니다.

둘째, 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 왼쪽 및 오른쪽 측두엽을 제거합니다. 그런 다음 두 개의 뇌 반구를 시상 절단으로 분리합니다.

다음으로, 각 뇌 섹션의 측면 표면을 차가운 비브람 베이스 플레이트에 붙입니다. 뇌의 등쪽은 비브람 블레이드를 향해야 하고 뇌의 배쪽은 비브라토 블레이드에서 떨어진 한천 블록과 접촉해야 합니다. 그런 다음 비브라토 베이스 플레이트를 해부 챔버에 고정합니다.

슬라이스 두께를 250마이크로미터로 설정하고 자르기 전에 칼날의 너비를 조정하십시오. 칼날이 피질과 해마를 통과하면 메스를 사용하여 중뇌에서 피질 해마를 잘라냅니다. 그런 다음 슬라이스를 섭씨 34도에서 30분 동안 유지한 후 섭씨 34도의 침수실에 슬라이스를 놓습니다.

전기생리학 기록에 사용하기 전에 30분 동안 실온으로 식히십시오.이 절차에서 슬라이스를 기록 챔버로 옮깁니다. 도트 조명 또는 I-R-D-I-C 아래의 슬라이스를 육안으로 검사합니다. 성상세포(astrocyte)는 시냅스 자극을 위한 작은 세포체(small cell body)와 두드러진 핵(nucleus)으로 확인할 수 있습니다.

패치하려는 성상세포에서 약 100마이크로미터 떨어진 곳에 양극성 스테인리스강 전극을 놓습니다. 성상세포를 패치하고 매우 부드러운 흡입을 가하여 전체 세포 구성을 끊습니다. 그런 다음 10-20초마다 단일 및 쌍 자극을 번갈아 가며 시냅스로 활성화된 수송 발생의 촉진된 부분을 분리합니다.

첫 번째는 통제된 조건에서 쌍을 이룬 자극으로 얻은 최소 20회의 스윕과 10마이크로몰의 광범위한 스펙트럼 글루타메이트 수송체 길항제가 존재하는 경우입니다. 그런 다음 TBOA는 대조군 조건에서 단일 자극으로 얻은 동일한 수의 스윕을 평균하고 10마이크로몰에서 TBOA는 쌍을 이룬 자극으로 얻은 평균 트레이스에서 단일 자극으로 얻은 평균 트레이스에서 빼냅니다. 이 단계를 통해 STO 기하학적 전류와 두 번째 자극에 의해 유발된 지속적인 칼륨 전류를 분리할 수 있습니다.

다음 이동, 쌍을 이루는 펄스를 전달하는 데 사용되는 PUL 간격과 일치하는 시간 간격만큼 단일 자극으로 얻은 평균 추적은 이전에 얻은 두 번째 자극에 대한 평균 응답에서 단일 자극으로 얻은 시간 이동된 평균 응답을 뺍니다. 이 단계는 두 번째 자극에 의해 유발된 수송 전류의 촉진된 부분을 분리합니다. 대부분의 경우 이 단계는 지속적인 칼륨 전류를 완전히 제거합니다.

이 경우 FSTC의 분리가 완료되고 디콘볼루션 분석을 진행하여 성상세포에서 글루타메이트 제거의 시간 경과에 도달할 수 있습니다. 그러나 일부 경우에는 소량의 지속적인 칼륨 전류가 여전히 존재하며 추가 분석이 필요합니다. 수행 후 남아 있는 지속적인 칼륨 전류의 진폭을 측정합니다.

앞서 설명한 분석은 측정된 지속 칼륨 전류의 진폭을 이 방정식에서 a로 설정하여 모노 지수 함수의 진폭을 잔류 지속 칼륨 전류의 진폭으로 조정합니다. 그러나 상승 시간 상수는 지속적인 칼륨 전류가 분리되는 별도의 실험에서 추정된 상승의 평균 값을 나타냅니다. 약리학적으로 높은 포화 농도의 TBOA를 사용하여 FSTC 및 지속적인 칼륨 전류에서 생성된 모노 지수 함수를 뺍니다.

FSTC의 분리를 완료합니다. 섬광이 활성화된 운송 발생을 격리합니다. 제어 조건에서 광 경로가 열린 상태에서 얻은 최소 20개의 스윕을 평균하고 10마이크로몰 TBOA에서 제어 조건에서 광 경로가 닫힌 상태에서 얻은 동일한 수의 스윕을 평균하고 10마이크로몰 TBOA에서 광 경로가 열린 상태에서 얻은 평균 트레이스에서 광 경로가 차단된 상태에서 얻은 평균 트레이스를 뺍니다.

이 단계에서는 자극 아티팩트를 제거하고 FTC를 분리할 수 있으며, 이 단계에서 제어 조건 및 10마이크로몰 TBOA에 기록된 FSTC 또는 FTC의 전송 전류를 맞추고 다중 지수 함수로 맞추고, 이 함수에 따라 모노 기하급수적으로 감소하는 순간 상승 함수를 생성하고, 10마이크로몰 TBOA에서 기록된 수송기 전류의 감쇠 단계를 가장 잘 설명합니다. 다음으로, 10마이크로몰 TBOA에 기록된 수송기 전류의 적합도에서 모노 지수 함수를 계승하여 필터를 유도합니다. 그런 다음 제어된 조건에서 트랜스포터 전류의 적합에서 필터를 회전시킵니다.

글루타메이트 제거율의 전체 시간 경과에 대한 정량적 추정치를 얻으려면 이 절차를 시도하는 동안 파형의 OID를 계산하십시오. 필터가 선형 영역에서 작동하고 전송의 선형 왜곡만 발생하는 실험 조건에서 전송 발생이 기록되는지 확인하는 것이 중요합니다. 이들로부터의 전류 파동은 운송 전류의 크기를 변경하는 조작을 확인하여 수행할 수 있습니다.

스탬프 코스를 변경하지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 성상 세포 기록을 사용하여 뇌의 글루타메이트, 확산 및 흡수에 대한 정보를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.