성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

본 실험의 전반적인 목표는 흥분성 시냅스에서 글루타메이트가 방출된 후, 성상교세포 막에서 글루타메이트가 제거되는 시간 경과를 추정하는 것입니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 광범위 글루타메이트 수송체 길항제인 TBOA를 포화 미만 농도로 처리했을 때와 처리하지 않았을 때, 급성 뇌 절편 내 성상교세포에서 시냅스 활성형 글루타메이트 수송이 발생하는지 기록하는 것입니다. 두 번째 단계는 기록된 데이터를 분석하여 유발된 반응의 다른 모든 성분으로부터 시냅스 활성형 글루타메이트 수송체 전류만을 분리해내는 것입니다.

다음으로, 대조 조건에서 기록된 수송 발생 과정에서 필터 부분을 제외함으로써, TBOA 존재 하에 기록된 수송 전류를 분석하여 필터 시간 경과를 추정합니다. 이를 통해 성상교세포 막으로부터 글루타메이트가 제거되는 시간 경과를 얻습니다. 결과에 따르면, 생쥐 해마의 성상교세포는 시냅스에서 방출된 글루타메이트를 세포 외 공간 기저부에서 제거하는 데 단 몇 밀리초만이 필요함을 보여줍니다.

이 접근 방식은 생리적 및 병리적 조건에서 뇌의 서로 다른 영역에 따른 성상교세포의 흡수 능력 변화를 감지할 수 있는 민감한 도구를 제공합니다. 형광 글루타메이트 지시약에서 빠르게 해리되는 글루타메이트 수용체 길항제의 치환 분석이나 확산 반응 컴퓨터 시뮬레이션에 기반한 다른 방법들에 비해 이 방식이 갖는 주요 장점은, 성상교세포의 글루타메이트 제거에 대한 직접적인 실험적 판독값과 높은 시간 해상도를 제공한다는 점입니다. 이 방법을 통해 우리는 뇌 내 시냅스 전달의 공간적 및 시간적 역동성을 이해할 수 있습니다.

이는 알츠하이머병과 같은 특정 신경계 질환에서 발생할 수 있는 글루타메이트, 확산 및 흡수의 병태생리학적 변화를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 메스로 해부된 마우스 뇌를 다섯 번 절개하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저 후각구와 전두엽 피질을 제거합니다.

둘째로, 소뇌를 제거합니다. 다음으로, 좌우 측두엽을 제거합니다. 그런 다음 정중 시상 절개를 통해 두 뇌 반구를 분리합니다.

다음으로, 각 뇌 절편의 측면을 저온 바이브람 베이스 플레이트에 접착합니다. 뇌의 등쪽(dorsal side)이 바이브람 블레이드를 향하게 하고, 뇌의 배쪽(ventral side)은 바이브라토 블레이드에서 떨어진 아가 블록에 닿게 해야 합니다. 그런 다음 바이브라토 베이스 플레이트를 해부 챔버에 고정합니다.

절편 두께를 250 micrometers로 설정하고, 절편 제작 전 칼날의 너비를 조정합니다. 칼날이 피질과 해마를 통과하면, 메스를 사용하여 중뇌로부터 피질과 해마 부위를 절단합니다. 이후, 절편을 34 °C에서 30분 동안 유지시킨 다음 34 °C의 침지 챔버에 넣습니다.

본 절차의 전기생리학적 기록에 사용하기 전, 30분 동안 상온으로 식힌 후 슬라이스를 기록 챔버로 옮깁니다. 점 조명 또는 I-R-D-I-C 하에서 슬라이스를 육안으로 검사합니다. 성상교세포는 작은 세포체와 뚜렷한 핵을 통해 식별할 수 있으며, 이를 시냅스 자극에 활용합니다.

패치 계획 중인 성상세포로부터 약 100 µm 떨어진 곳에 양극 스테인리스강 전극을 배치합니다. 성상세포를 패치하고 매우 부드러운 흡입을 적용하여 whole-cell 구성으로 전환합니다. 그런 다음 10~20초마다 단일 자극과 쌍 자극을 교대로 가하여 시냅스 활성화 운송 발생의 촉진된 부분을 분리합니다.

먼저 10 µM의 광범위 글루타메이트 운반체 길항제인 TBOA가 존재하는 제어 조건에서 쌍 자극(paired stimulations)으로 얻은 최소 20회의 스윕(sweeps)을 평균냅니다. 그런 다음 제어 조건 및 10 µM TBOA 존재 하에서 단일 자극(single stimulations)으로 얻은 동일한 횟수의 스윕을 평균내고, 쌍 자극으로 얻은 평균 트레이스에서 단일 자극으로 얻은 평균 트레이스를 뺍니다. 이 단계는 STO 기하학적 구조와 두 번째 자극에 의해 유도된 지속성 칼륨 전류를 분리하는 것을 가능하게 합니다.

다음으로, paired pulses를 전달하는 데 사용된 PUL 간격과 일치하는 시간 간격만큼 단일 자극으로 얻은 평균 trace를 이동시킨 후, 이 시간 이동된 단일 자극의 평균 반응을 앞서 얻은 두 번째 자극에 대한 평균 반응에서 뺍니다. 이 단계는 두 번째 자극에 의해 유발된 transporter current의 촉진된 부분을 분리해 냅니다. 대부분의 경우, 이 단계에서 지속성 칼륨 전류(sustained potassium current)가 완전히 제거됩니다.

이러한 경우라면 FSTC 분리가 완료된 것이며, 디컨볼루션 분석을 진행하여 성상교세포의 글루타메이트 제거 시간 경과를 도출할 수 있습니다. 그러나 일부 사례에서는 소량의 지속성 칼륨 전류가 여전히 남아 있어 추가 분석이 필요할 수 있습니다. 수행 후 남아 있는 지속성 칼륨 전류의 진폭을 측정하십시오.

앞서 설명한 분석에서는 측정된 지속성 칼륨 전류의 진폭을 이 방정식의 a로 설정함으로써, 단일 지수 함수의 진폭을 잔여 지속성 칼륨 전류의 진폭에 맞춥니다. 하지만 상승 시간 상수는 지속성 칼륨 전류가 분리된 별도의 실험에서 추정된 상승의 평균값을 나타냅니다. 고농도의 포화 TBOA를 약리학적으로 사용하여, 결과로 나타나는 단일 지수 함수를 FSTC 및 지속성 칼륨 전류에서 뺍니다.

FSTC의 분리를 완료하려면, 광활성 수송 발생(flash activated transport occurrence)을 분리해야 합니다. 대조군 조건과 10 µM TBOA 조건에서 광경로를 열어둔 상태로 얻은 최소 20회의 스윕을 평균 내고, 대조군 조건과 10 µM TBOA 조건에서 광경로를 닫은 상태로 얻은 동일 횟수의 스윕을 평균 냅니다. 그 후, 광경로를 열어둔 상태에서 얻은 평균 트레이스에서 광경로를 차단한 상태에서 얻은 평균 트레이스를 뺍니다.

이 단계에서는 자극 아티팩트를 제거하고 FTC를 분리할 수 있습니다. 이 단계에서는 대조군 조건 및 10 µM TBOA 조건에서 기록된 운반 전류인 FSTC 또는 FTC를 다중 지수 함수로 피팅합니다. 이 함수에 따라 단일 지수적으로 감쇠하며, 10 µM TBOA에서 기록된 운반 전류의 감쇠 상을 가장 잘 설명하는 즉각적으로 상승하는 함수를 생성합니다. 다음으로, 10 µM TBOA에서 기록된 운반 전류의 피팅 결과로부터 단일 지수 함수를 도출하여 필터를 유도합니다. 그런 다음, 대조군 조건에서의 운반 전류 피팅 결과로부터 필터를 도출합니다.

글루타메이트 제거의 전체적인 시간 경과에 대한 정량적 추정치를 얻으려면, 이 절차를 수행하는 동안 파형의 OID를 계산하십시오. 이때 수송 현상이 필터가 선형 영역에서 작동하고 수송에 대해 선형 왜곡만을 유도하는 실험 조건 하에서 기록되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이는 수송 전류의 크기를 변화시키는 조작들을 확인함으로써 수행할 수 있습니다.

스탬프 코스를 변경하지 마십시오. 이 영상을 시청하고 나면 성상세포 기록을 사용하여 뇌 내의 glutamate, 확산 및 흡수에 관한 정보를 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.