Name: 성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 글루타민산 운송업자 전류의 디컨볼루션 분석을 통해 성상 세포 막에서 글루타민산 정리의 시간 과정을 추정하는 방법을. 이 기술은 시냅스 기능과 신경생리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 교내 연구 프로그램 (NS002986)의 국립 연구소에 의해 지원되었다. AS 원고를 쓴 디컨 볼 루션 분석을 구현했습니다. JSD는 디컨 볼 루션 분석의 초기 버전을 개발하고 텍스트에 댓글을 달았습니다.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
<li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+synapse+independence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li>
<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

여기에 우리가 성상 세포의 전기 생리학 녹음을 얻기 위해 실험 방법을 설명 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분리하는 분석 프로토콜에 대한 수학적 방법은 성상 세포 수송 전류에서 글루타민산 정리의 시간 코스를 파생시킵니다. 분석의 성공은 성상 세포에서 고품질의 패치 클램프 녹음을 취득 할 수있는 능력과 수송 전류를 설명하는 데 사용되는 피팅 알고리즘의 정확성에 의존합니다. 디컨 볼 루션 분석은 다음과 같은 두 가지 가정에 의존한다. (1) 실험적 기록 운송업자 현재에 글루타민산 정리의 시간 과정을 왜곡 여러 프로세스가 선형 시스템으로 표현 될 수있다. 절대 측면에서 비록 모양 운송업자 전류가 비선형 시스템 (원리 글루타민산 바인딩 및 전송에 모두 채도를 치룰 수있다), 실험적 증거 indica의 것을 요인의 많은그들의 선형 정권이 넓은 것을 TES. 따라서, 수송 전류와 글루타민산 정리의 시간 과정은 자극 강도, 방출 확률과 글루타메이트 농도 13...

성상 세포는 별 모양의 형태와 neuropil를 통해 확장하고 이웃 시냅스 연락처 1,2에 도달 미세 막 돌기 두뇌에있는 가장 풍부한 세포 유형 중 하나입니다. 성상 &#39;세포막 밀도가 글루타민산 염 수송 분자 3로 포장된다. 생리적 조건, 글루타민산 염 수송 빠르게 막 세포 측면에서 글루타민산 염을 바인딩하고 세포의 세포질에 전송할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 수송은 세포 공간 4 글루타민산 낮은 기저 농도를 유지한다. 시냅스를 흥분성에 인접 좋은 성상 과정에서 글루타민산 염 수송은 이상적으로는 멀리 시냅스에서의 확산으로 시냅스 이벤트 기간 동안 출시 된 글루타메이트를 바인딩 할 수있는 좋은 위치에 있습니다. 이렇게하면, 전송기는 흥분성 신호의 공간적 확산을 감소 요정 여분의 시냅스 지역을 향해와 인근 시냅스 위에 글루타민산 유출을 제한5-7 뇌의. 글루타민산 염 수송 화학 양 론적 3의 움직임에 결합 electrogenic 과정 나 + 1 H의 자신의 전기 화학적 구배에 따라 + 1 K + 8 반 수송. (안산)&gt; NO 3 - - (질산) ≈ CLO 4 - (과염소산)&gt; I -&gt; 대교 -&gt; 염소 -&gt; F -하지 글루타민산 염 수송은 SCN 투과 (그러나 화학 양 론적으로 결합되지 않음) 음이온 전도성과 연관되어 (메탄 설포 네이트)와 C 6 H 11 O - 7 - (글루 콘 산염) 9-11 CH 3 SO 3. 두 전류 (화학 양론 비 화학 양론) 시각 acut에 Dodt 조명이나 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 확인 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음을 획득하여 기록 할 수 있습니다전자 뇌 조각 12. 막에 걸쳐 글루타민산 염 수송과 관련된 현재의 화학 양 론적 구성 요소가 CH 3 SO 3를 사용하여 분리 할 수 있습니다 - 또는 C 6 H 11 O 7 - 기반의 세포 내 솔루션과 성상 세포 13,14에 플래시 uncaging 글루타메이트에 의해 유발 될 수있다, 또는 인접 시냅스에서 글루타메이트 방출을 활성화하여, 하나 전기 12 대상 optogenetic 제어. 운송업자 현재의 화학 양 론적 구성 요소의 시간 과정은 성상 세포 멤브레인 (즉, 글루타민산 통관)에서 글루타메이트 농도 프로파일의 수명에 의해 형성되고, 글루타민산 염 수송, 성상 세포의 수동 막 속성의 동역학, 그리고에 의해 시냅스 자극,시 활성화 된 시냅스 13을 통해 글루타메이트 방출의 동시성. 여기에서 우리는 전체 상세 설명 : (1) 실험 APPR예를 들어 실험 준비로 급성 마우스 해마 슬라이스를 사용하여 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음에서 글루타민산 염 수송 전류의 화학 양 론적 구성 요소를 분리하는 oach (2) 분석 방법은 이러한 기록 13에서 글루타민산 정리의 시간 경과를 파생 14. 이 방법은 기록하고 중추 신경계의 지역에서 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr> <tr><td>(R, S) -CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr>, <tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 disodium salt</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX disodium salt</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D, L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-글루타메이트</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>선택적</td></tr><tr><td>매트릭스 전극</td><td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 스테이지 유리 마이크로 피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 순간 접착제</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Xe 램프</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

뇌의 글루타메이트 수송의 가장 높은 밀도는 성상 세포에서 발견된다. 3 나 + 1 H의 공동 수송 + 1 K의 반대 교통과 막에 걸쳐 글루타민산 글루타민산 염 수송 커플 운동 +. 전송 프로세스에 의해 생성 된 화학 양론 현재는 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음으로 모니터링 할 수 있습니다. 기록 된 현재의 시간 코스는 성상 세포가 노출하는 글루타메이트 농도 프로파일, 글루타민산 염 수송의 동역학, 그리고 성상 세포 세포막의 수동 electrotonic 속성의 시간 경과에 의해 형성된다. 여기에서 우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 기록하고 성상 세포 수송 전류의 파형을 형성하는 다른 모든 요인 글루타민산 정리의 시간 과정을 분리하는 데 사용할 수있는 실험 및 분석 방법에 대해 설명합니다. 여기에 설명 된 방법은 수명 (을)를 추정하는 데 사용할 수 있습니다F 플래시 uncaged 건강과 질병 동안 중추 신경계의 지역에서 성상 세포 막에 글루타민산 시냅스 발표.

분석 방법의 성공은 매우 중추 신경계의 지역에서 성상 세포에서 수송 전류 고품질의 전기 생리학 녹음을 얻기에 따라 여기에 설명. 급성 마우스 해마 슬라이스, 성상 세포는 쉽게 때문에 그들의 작은 세포 기관 (Ø = 10 ㎛)와 저명한 핵 (그림 1)의 Dodt 조명이나 IR-DIC에서 확인할 수 있습니다. 세포 솔루션 (그림 1)에 알렉사 594 (50 μM)과 같은 형광 물질을 추가 할 때 자신의 독특한 별 모양의 형태는 공 촛점 epifluorescence에, 또는 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 감상 할 수 있습니다. 전기 생리학 수준에서 성상 세포는 낮은 입력 저항, 과분극 막 전위 (~ -90 MV)와 활동 전위를 생성하는 무능력에 의해 특징입니다. 성상 세포는 이웃 뉴런의 전기 또는 optogenetic 자극과 CA의 UV 광분해에 대한 응답으로 전류를 생성MNI-L-글루타민산 같은 GED 화합물. ...

우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류의 전기 생리학 녹음에서 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 추정하는 분석 방법을 설명합니다.

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

본 실험의 전반적인 목표는 흥분성 시냅스에서 글루타메이트가 방출된 후, 성상교세포 막에서 글루타메이트가 제거되는 시간 경과를 추정하는 것입니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 광범위 글루타메이트 수송체 길항제인 TBOA를 포화 미만 농도로 처리했을 때와 처리하지 않았을 때, 급성 뇌 절편 내 성상교세포에서 시냅스 활성형 글루타메이트 수송이 발생하는지 기록하는 것입니다. 두 번째 단계는 기록된 데이터를 분석하여 유발된 반응의 다른 모든 성분으로부터 시냅스 활성형 글루타메이트 수송체 전류만을 분리해내는 것입니다.다음으로, 대조 조건에서 기록된 수송 발생 과정에서 필터 부분을 제외함으로써, TBOA 존재 하에 기록된 수송 전류를 분석하여 필터 시간 경과를 추정합니다. 이를 통해 성상교세포 막으로부터 글루타메이트가 제거되는 시간 경과를 얻습니다. 결과에 따르면, 생쥐 해마의 성상교세포는 시냅스에서 방출된 글루타메이트를 세포 외 공간 기저부에서 제거하는 데 단 몇 밀리초만이 필요함을 보여줍니다.이 접근 방식은 생리적 및 병리적 조건에서 뇌의 서로 다른 영역에 따른 성상교세포의 흡수 능력 변화를 감지할 수 있는 민감한 도구를 제공합니다. 형광 글루타메이트 지시약에서 빠르게 해리되는 글루타메이트 수용체 길항제의 치환 분석이나 확산 반응 컴퓨터 시뮬레이션에 기반한 다른 방법들에 비해 이 방식이 갖는 주요 장점은, 성상교세포의 글루타메이트 제거에 대한 직접적인 실험적 판독값과 높은 시간 해상도를 제공한다는 점입니다. 이 방법을 통해 우리는 뇌 내 시냅스 전달의 공간적 및 시간적 역동성을 이해할 수 있습니다.이는 알츠하이머병과 같은 특정 신경계 질환에서 발생할 수 있는 글루타메이트, 확산 및 흡수의 병태생리학적 변화를 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 메스로 해부된 마우스 뇌를 다섯 번 절개하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저 후각구와 전두엽 피질을 제거합니다.둘째로, 소뇌를 제거합니다. 다음으로, 좌우 측두엽을 제거합니다. 그런 다음 정중 시상 절개를 통해 두 뇌 반구를 분리합니다.다음으로, 각 뇌 절편의 측면을 저온 바이브람 베이스 플레이트에 접착합니다. 뇌의 등쪽(dorsal side)이 바이브람 블레이드를 향하게 하고, 뇌의 배쪽(ventral side)은 바이브라토 블레이드에서 떨어진 아가 블록에 닿게 해야 합니다. 그런 다음 바이브라토 베이스 플레이트를 해부 챔버에 고정합니다.절편 두께를 250 micrometers로 설정하고, 절편 제작 전 칼날의 너비를 조정합니다. 칼날이 피질과 해마를 통과하면, 메스를 사용하여 중뇌로부터 피질과 해마 부위를 절단합니다. 이후, 절편을 34 °C에서 30분 동안 유지시킨 다음 34 °C의 침지 챔버에 넣습니다.본 절차의 전기생리학적 기록에 사용하기 전, 30분 동안 상온으로 식힌 후 슬라이스를 기록 챔버로 옮깁니다. 점 조명 또는 I-R-D-I-C 하에서 슬라이스를 육안으로 검사합니다. 성상교세포는 작은 세포체와 뚜렷한 핵을 통해 식별할 수 있으며, 이를 시냅스 자극에 활용합니다.패치 계획 중인 성상세포로부터 약 100 µm 떨어진 곳에 양극 스테인리스강 전극을 배치합니다. 성상세포를 패치하고 매우 부드러운 흡입을 적용하여 whole-cell 구성으로 전환합니다. 그런 다음 10~20초마다 단일 자극과 쌍 자극을 교대로 가하여 시냅스 활성화 운송 발생의 촉진된 부분을 분리합니다.먼저 10 µM의 광범위 글루타메이트 운반체 길항제인 TBOA가 존재하는 제어 조건에서 쌍 자극(paired stimulations)으로 얻은 최소 20회의 스윕(sweeps)을 평균냅니다. 그런 다음 제어 조건 및 10 µM TBOA 존재 하에서 단일 자극(single stimulations)으로 얻은 동일한 횟수의 스윕을 평균내고, 쌍 자극으로 얻은 평균 트레이스에서 단일 자극으로 얻은 평균 트레이스를 뺍니다. 이 단계는 STO 기하학적 구조와 두 번째 자극에 의해 유도된 지속성 칼륨 전류를 분리하는 것을 가능하게 합니다.다음으로, paired pulses를 전달하는 데 사용된 PUL 간격과 일치하는 시간 간격만큼 단일 자극으로 얻은 평균 trace를 이동시킨 후, 이 시간 이동된 단일 자극의 평균 반응을 앞서 얻은 두 번째 자극에 대한 평균 반응에서 뺍니다. 이 단계는 두 번째 자극에 의해 유발된 transporter current의 촉진된 부분을 분리해 냅니다. 대부분의 경우, 이 단계에서 지속성 칼륨 전류(sustained potassium current)가 완전히 제거됩니다.이러한 경우라면 FSTC 분리가 완료된 것이며, 디컨볼루션 분석을 진행하여 성상교세포의 글루타메이트 제거 시간 경과를 도출할 수 있습니다. 그러나 일부 사례에서는 소량의 지속성 칼륨 전류가 여전히 남아 있어 추가 분석이 필요할 수 있습니다. 수행 후 남아 있는 지속성 칼륨 전류의 진폭을 측정하십시오.앞서 설명한 분석에서는 측정된 지속성 칼륨 전류의 진폭을 이 방정식의 a로 설정함으로써, 단일 지수 함수의 진폭을 잔여 지속성 칼륨 전류의 진폭에 맞춥니다. 하지만 상승 시간 상수는 지속성 칼륨 전류가 분리된 별도의 실험에서 추정된 상승의 평균값을 나타냅니다. 고농도의 포화 TBOA를 약리학적으로 사용하여, 결과로 나타나는 단일 지수 함수를 FSTC 및 지속성 칼륨 전류에서 뺍니다.FSTC의 분리를 완료하려면, 광활성 수송 발생(flash activated transport occurrence)을 분리해야 합니다. 대조군 조건과 10 µM TBOA 조건에서 광경로를 열어둔 상태로 얻은 최소 20회의 스윕을 평균 내고, 대조군 조건과 10 µM TBOA 조건에서 광경로를 닫은 상태로 얻은 동일 횟수의 스윕을 평균 냅니다. 그 후, 광경로를 열어둔 상태에서 얻은 평균 트레이스에서 광경로를 차단한 상태에서 얻은 평균 트레이스를 뺍니다.이 단계에서는 자극 아티팩트를 제거하고 FTC를 분리할 수 있습니다. 이 단계에서는 대조군 조건 및 10 µM TBOA 조건에서 기록된 운반 전류인 FSTC 또는 FTC를 다중 지수 함수로 피팅합니다. 이 함수에 따라 단일 지수적으로 감쇠하며, 10 µM TBOA에서 기록된 운반 전류의 감쇠 상을 가장 잘 설명하는 즉각적으로 상승하는 함수를 생성합니다. 다음으로, 10 µM TBOA에서 기록된 운반 전류의 피팅 결과로부터 단일 지수 함수를 도출하여 필터를 유도합니다. 그런 다음, 대조군 조건에서의 운반 전류 피팅 결과로부터 필터를 도출합니다.글루타메이트 제거의 전체적인 시간 경과에 대한 정량적 추정치를 얻으려면, 이 절차를 수행하는 동안 파형의 OID를 계산하십시오. 이때 수송 현상이 필터가 선형 영역에서 작동하고 수송에 대해 선형 왜곡만을 유도하는 실험 조건 하에서 기록되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이는 수송 전류의 크기를 변화시키는 조작들을 확인함으로써 수행할 수 있습니다.스탬프 코스를 변경하지 마십시오. 이 영상을 시청하고 나면 성상세포 기록을 사용하여 뇌 내의 glutamate, 확산 및 흡수에 관한 정보를 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 단일 피질 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소를 평가하는 방법을 보여줍니다. 전기 자극은 시냅스에서 글루타메이트 방출을 촉진합니다. 방출된 글루타메이트는 시간이 지남에 따라 감소하는 센서 단백질의 형광을 변경하여 방출 및 제거 효율을 나타냅니다.

Analyzing the Glutamate Release and clearance at a single neuroron synapse(마우스 뇌 절편의 단일 뉴런 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소)

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

혈장 막에서 발현 된 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 결정하기 위해 고안된 두 가지의 바이오 티 닐화 기반 방법이이 보고서에 제시되어있다.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

이 프로토콜은 바이러스 전달, 광혈전 이식, 광혈전 유도, 성상교세포 및 신경세포 활동의 동시 기록, 성상교세포의 광유전학적 자극을 포함하는 통합 방법을 제공합니다. 이 통합 방법은 허혈성 뇌졸중의 급성기부터 만성기까지의 성상교세포-뉴런 관계를 동시 조사하는 것을 목표로 합니다.

광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

배우세요 글루타민산 운송업자 전류의 디컨볼루션 분석을 통해 성상 세포 막에서 글루타민산 정리의 시간 과정을 추정하는 방법을. 이 기술은 시냅스 기능과 신경생리학 연구에 활용됩니다.

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

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