생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

본 절차의 전반적인 목표는 해양 후지 허혈 모델을 사용하여 줄기세포 내 치료 유전자의 과발현을 위한 고분자 나노입자의 활용법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 2단계 미세 유화 반응을 통해 생분해성 고분자를 합성한 후, 치료 유전자가 인코딩된 고분자 나노입자를 제조함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 인간 지방 유래 줄기세포를 in vitro에서 형질전환하여 혈관 내피 성장 인자를 과발현시키는 것입니다.

다음으로, 치료 인자의 생성을 위해 프로그래밍된 줄기세포를 허혈성 뒷다리 근육 내에 주입합니다. 마지막 단계는 생물 발광 이미징과 레이저 도플러 이미징을 사용하여 시간이 경과함에 따라 허혈성 다리 내의 세포 생존과 혈류 재관류를 모니터링하는 것입니다. 최종적으로, 치료 인자의 국소적 발현과 조직 재생 효능을 입증하기 위해 정량적 유전자 발현 분석 및 조직학적 검사를 수행할 수 있습니다.

혈관 신생을 위한 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 장점은 약물 전달체로서 줄기세포를 사용한다는 점입니다. 이러한 전략을 통해 허혈 부위로 이동하는 줄기세포의 자연적인 호밍(homing) 능력을 이용할 수 있으며, 미세환경 신호에 대한 역동적인 반응 또한 가능해집니다. 플라스마 DNA 전달에 사용되는 나노입자는 효율이 매우 높고 생분해성여서 세포 독성을 낮추고 더 많은 수의 DNA 복제본을 세포 내로 전달할 수 있게 합니다.

이 기술은 생분해성 비바이러스성 벡터를 사용하여 자가 세포에 유전자를 삽입하므로, 임상적으로 유의미한 많은 세포 기반 치료제에 적용될 수 있습니다. 흄 후드 내에서 butane dial DLI의 무게를 측정한 후, 교반 바가 들어 있는 유리 흡입 바이알로 물질을 옮깁니다. 다음으로, 미리 가열한 five amino one pentol을 동일한 바이알에 추가합니다. 즉시 바이알을 교반판 위에 올리고 속도를 600 RPM으로 설정합니다.

바이알을 90 °C로 설정된 오븐으로 옮기고 교반 속도를 1000 RPM으로 높입니다. 4시간 후, 속도를 300 RPM으로 낮추고 12~16시간 동안 추가로 교반합니다. 준비가 되면, 마그네틱 바가 들어 있는 유리 바이알에 5 g의 C 32와 10 mL의 무수 tetra hydro uran을 넣습니다. 알루미늄 호일로 감싼 후, 완전히 용해될 때까지 고속으로 볼텍싱합니다. 마그네틱 바가 들어 있는 별도의 유리 바이알에 10 mM의 tetra ethylene glycol diamine을 추가합니다.

이 바이알에 THF 40 milliliters를 추가하고, 두 바이알을 모두 교반기에 올려 5분 동안 둔 후 하나로 합칩니다. 생성물을 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 24시간 동안 교반합니다. 최종 생성물은 C 32 1 22로 명명합니다.

다음으로 50 mL 팰컨 튜브 5개에 무수 다이에틸 에테르를 각각 30 mL씩 옮깁니다. 무수 다이에틸 에테르에 C 32 1 22를 첨가하면 흰색의 탁한 용액이 형성되는데, 튜브를 볼텍싱한 후 원심분리합니다. 추출된 폴리머가 튜브 바닥에 모이면 상층액을 버리고 이 과정을 두 번 더 반복합니다.

추출이 완료되면, 개방된 튜브를 데시케이터에 넣고 하룻밤 동안 진공 상태로 유지하며, 이때 튜브가 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오. 다음 날 C 32 1 22가 포함된 튜브의 무게를 측정하여 최종 질량을 결정합니다. 마지막으로, 추출된 폴리머를 무수 DMSO에 100 mg/mL 농도로 용해합니다.

나노입자 제조를 위한 과정입니다. 먼저, 두 번째 튜브에서 플라스마 DNA를 sodium acetate로 희석하여 최종 농도가 120 µg/mL가 되게 합니다. 이어서 C 32 1 22를 sodium acetate로 희석하여 최종 농도가 3.6 mg/mL가 되게 합니다. 각 튜브의 내용물을 하나의 15 mL Falcon 튜브에 합친 후, 즉시 고속으로 10초 동안 vortexing 합니다.

나노입자가 형성되는 동안 튜브를 실온에서 10분 동안 방치하십시오. 이전에 준비해 둔 조직 배양 플라스크의 배지를 7.8 milliliters의 완전 보충 DMEM으로 교체하십시오.

나노입자 용액을 조직 배양 플라스크로 옮기고 고르게 도포한 후 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후에 나노입자가 포함된 배지를 DMEM으로 교체합니다. 4시간이 지나면 세포를 in vivo 주입에 사용할 수 있습니다.

형질전환된 세포가 준비되면, 각 마우스가 동일한 양을 투여받을 수 있도록 PBS 내 세포 밀도를 10 x 10⁶ cells/mL로 계산하여 분주하십시오. 세포 현탁액을 110 µL의 부피로 에펜도르프 튜브에 나누어 담습니다. 그다음, 이전에 뒷다리 허혈증을 유도한 마우스를 마취하십시오.

발가락 꼬집기로 마취 상태를 확인한 후, 27 gauge 주사기로 주사 부위를 세척하십시오. 세포를 재현탁하고 현탁액 100 microliters를 흡입하십시오. 세포 현탁액의 절반을 내전근 부위에 주사하고, 나머지 절반을 종아리 근육 부위에 주사하십시오.

주사 후, 누출을 방지하기 위해 주사기를 최소 15~30초 동안 그대로 둡니다. 주사가 완료되면 동물이 완전히 회복될 때까지 따뜻하게 유지하십시오. 생물발광 이미징의 경우, 발가락 꼬집기로 마취 상태를 확인한 후 앞서 설명한 대로 주사 부위를 세척합니다.

인슐린 주사기에 Lucifer 100 µL를 채워 복강 내로 주사합니다. 동물을 ivus Luciferase 이미지 촬영 챔버에 넣기 전, 노출 시간을 1분으로 설정하여 마우스를 촬영합니다. 이미지가 획득되면 관심 영역(region of interest)을 표시합니다.

이 경우, 세포 주입 부위의 허혈 사지를 대상으로 신호가 정점에 도달하고 감소하기 시작할 때까지 3분에서 5분 간격으로 루시페레이스(luciferase) 신호를 계속 측정합니다. 이 값은 마우스 간 및 시점별 비교에 사용됩니다. 측정이 완료되면 마우스를 챔버에서 꺼내고 동물이 완전히 회복될 때까지 체온을 따뜻하게 유지합니다. 조직은 선택한 시점에 채취합니다.

안락사 후 형질전환 단계가 완료되면, 복부 원위부 및 뒷다리 근위부의 뒷다리 주변 피부를 원형으로 절개합니다. 피부를 젖힌 후, 골반과 대퇴골 관절 사이에서 다리를 절단합니다. 마지막으로, 내전근과 비복근을 분리합니다.

추가 분석을 위해, 이 이미지들은 C 32 1 22의 합성을 보여줍니다. 여기서 ACR 관련 말단 C 32 AC는 DAL 말단 그룹을 가진 단량체와 1차 아민 말단 그룹을 가진 단량체 사이의 마이클 부가 반응(michael addition reaction)을 통해 형성되었습니다. 이 예시에서, 형질전환 효율을 높이기 위해 아민 말단 단량체를 추가하여 변형된 PBAE 폴리머를 형성할 수 있습니다.

성공적인 형질전환은 여기서 보는 바와 같이 녹색 형광 단백질의 과발현으로 확인할 수 있습니다. 이 생물발광 이미징 데이터는 0일째와 14일째의 마우스를 보여줍니다. GFP luciferase 양성 지방 유래 줄기세포를 뒷다리에 주입한 후, 대표적인 도플러 영상을 통해 0일째에 대칭되는 뒷다리 한쪽에서 허혈이 유도된 모습과 성공적인 혈류 재관류를 확인할 수 있습니다.

VEGF를 과발현하는 지방 유래 줄기세포를 주입한 지 14일 후의 모습입니다. R-T-P-C-R 분석 결과, 세포 주입 4일 후 치료군에서 인코딩된 치료 단백질인 vgf의 발현이 성공적으로 상향 조절되었음을 확인한 반면, PBS 대조군에서는 발현이 검출되지 않았습니다. 조직 재생을 촉진하기 위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 줄기세포와 유전자 전달 방식을 결합한 다른 방법들을 적용할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 비바이러스성 유전자 치료를 위한 생분해성 폴리머의 합성 방법과, 이러한 폴리머를 이용하여 허혈 치료를 위한 줄기세포를 프로그래밍하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 치료 인자를 in situ에서 과발현시키기 위해 비바이러스성 방식으로 엔지니어링된 줄기세포를 사용하는 것은 다양한 범위의 퇴행성 질환을 치료하는 데 폭넓게 유용할 수 있습니다.