생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 해양 뒷다리 허혈 모델을 사용하여 줄기세포에서 치료 유전자의 과발현을 위한 고분자 나노 입자의 사용을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 2단계 마이크 에디션 반응을 통해 생분해성 폴리머를 합성한 다음 치료 유전자를 암호화하는 고분자 나노 입자를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 체외에서 인간 지방 유래 줄기세포를 과발현된 혈관 내피 성장 인자에 transfection하는 것입니다.

다음으로, 프로그래밍된 줄기세포를 허혈성 뒷다리에 근육 주사하여 두 가지 치료 인자를 생산합니다. 마지막 단계는 생물 발광 이미징 및 레이저 도플러 이미징을 사용하여 시간 경과에 따른 허혈 사지의 세포 생존 및 혈액 재관류를 모니터링하는 것입니다. 궁극적으로, 정량적 유전자 발현 및 조직학을 수행하여 치료 인자의 국소적 발현과 조직 재생의 효능을 보여줄 수 있습니다.

혈관 신생을 위한 기존 방법에 비해 이 기술의 장점은 줄기세포를 약물 전달을 위한 매개체로 사용한다는 것입니다. 이 전략을 통해 줄기세포의 자연적인 호잉 능력을 사용하여 허혈로 이동할 수 있으며 미세환경 신호에 대한 동적 반응도 할 수 있습니다. 혈장 DNA 전달에 사용되는 나노 입자는 매우 효율적이고 생분해성으로 세포 독성이 낮고 세포 내 전달되는 DNA 사본 수가 더 많습니다.

이 기술은 생분해성 비바이러스 벡터를 사용하여 자가 세포에 유전자를 삽입하기 때문에 임상적으로 관련된 많은 세포 기반 치료제에 적용할 수 있습니다.흄 후드에서 작업하면서 부탄 다이얼 DLI의 무게를 측정하고 재료를 교반 막대가 들어 있는 유리 흡입 바이알로 옮깁니다. 다음으로, 예열된 5개의 아미노 원 펜톨을 동일한 바이알에 추가합니다. 즉시 바이알을 교반 플레이트에 놓고 속도를 600RPM으로 설정합니다.

바이알을 섭씨 90도로 설정된 오븐에 옮기고 4시간 후에 교반 속도를 1000RPM으로 높이고 300RPM으로 낮추고 추가로 12-16시간 동안 저어줍니다. 준비가 되면 교반 막대가 들어 있는 유리 바이알에 C 32 5g에 무수 테트라 하이드로 우란 10ml를 추가합니다. 교반 막대가 들어있는 별도의 유리 바이알에 완전히 용해 될 때까지 호일 소용돌이로 감싼 후 10 밀리 몰의 테트라 에틸렌 글리콜 디아민을 첨가합니다.

이 바이알에 THF 40ml를 넣고 두 바이알을 5분 동안 교반 접시에 올려 놓고 함께 결합하십시오. 결과물을 호일로 덮고 24시간 동안 실온을 응시하도록 둡니다. 최종 결과물은 C 32 1 22라고 합니다.

다음으로 30 밀리리터의 무수 다틸 에테르를 5개의 50 밀리리터 팔콘 튜브 각각에 전달합니다. 무수 딜 에테르에 C 32 1 22를 첨가 한 후, 백색의 탁한 용액이 튜브를 와류로 형성 한 다음 원심 분리합니다. 추출된 폴리머는 튜브 바닥에 모여 상부 용액을 버리고 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

추출이 완료되면 열린 튜브를 건조제에 넣고 밤새 진공 청소기로 청소하고 튜브가 빛으로부터 보호되는지 확인하십시오. 다음 날 C 32 1 22가 들어 있는 튜브의 무게를 측정하여 최종 질량을 결정합니다. 마지막으로 추출 된 중합체를 밀리리터 당 100 밀리그램의 농도로 무수 DMSO에 용해시킨다.

나노 입자 준비용. 먼저 혈장 DNA를 아세트산나트륨 중 밀리리터당 120마이크로그램의 최종 농도로 희석한 다음 두 번째 튜브에서 C 32 1 22를 밀리리터당 3.6밀리그램의 최종 농도로 희석합니다. 아세트산나트륨에서 각 튜브의 내용물을 단일 15ml Falcon 튜브에 결합하고 즉시 10초 동안 고온에서 소용돌이칩니다.

나노 입자가 형성되는 동안 나노 입자가 형성될 수 있도록 튜브를 실온에서 10분 동안 두십시오. 이전에 장착된 조직 배양 플라스크의 배지를 7.8ml로 교체합니다. 완전히 보충된 DMEM.

나노 입자 용액을 조직 배양 플라스크로 옮기고 인큐베이터에 넣기 전에 고르게 펴 바릅니다. 2시간 후 나노 입자가 포함된 매체를 DMEM으로 교체합니다. 4시간 후, 세포는 생체 내 주입 준비가 됩니다.

형질주입된 세포가 준비되면 PBS에서 밀리리터당 6개 세포의 10배10 곱하기 밀도로 세포를 계수하여 각 마우스가 동일한 양을 받도록 합니다. 세포 현탁액을 110마이크로리터 부피의 einor 튜브로 분리합니다. 다음으로, 이전에 뒷다리 허혈을 겪은 쥐를 마취합니다.

발가락 핀치로 마취를 확인한 후 27 게이지 주사기로 주입 부위를 청소합니다. 세포를 다시 현탁시키고 현탁액 100마이크로리터를 끌어냅니다. 세포 현탁액의 절반을 내전근 부위에 주입한 다음 나머지 절반을 종아리 근육 부위에 주입합니다.

주입 후에는 누출을 방지하기 위해 최소 15-30초 동안 주사기를 제자리에 두십시오. 주사가 완료되면 완전히 회복될 때까지 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 생물 발광 영상의 경우 발가락 꼬집기로 마취를 확인한 다음 앞서 표시된 대로 주사 부위를 청소합니다.

인슐린 주사기에 100마이크로리터의 루시퍼를 채우고 복강내에 주사합니다. 동물을 ivus Luciferase 이미징 챔버에 넣기 전에 1분의 노출 시간으로 마우스를 이미지화합니다. 이미지가 획득되면 관심 영역을 표시합니다.

이 경우, 세포 주입 부위의 허혈성 사지(ischemic limb)는 신호가 최고점에 도달하고 감소하기 시작할 때까지 3-5분마다 루시페라아제 신호를 계속 측정합니다. 이것은 마우스 간 및 시간 지점별 비교에 사용되는 값으로, 완료되면 챔버에서 마우스를 제거하고 완전히 회복될 때까지 동물을 따뜻하게 유지합니다. 조직은 선택한 시간에 수확됩니다.

안락사 후 형질주입 후 점, 뒷다리 주변의 피부를 원위 복부 부위에서 둘레로, 뒷다리 근위부로 절단합니다. 피부를 뒤로 당긴 후 골반과 대퇴골 관절 사이의 팔다리를 절단합니다. 마지막으로, 내측 내전근과 비복근이 분리됩니다.

추가 분석을 위해 이 이미지는 C 32 1 22의 합성을 묘사합니다. 여기서, ACR 관련 종단 C32 AC는 DAL 말단기를 갖는 단량체와 1차 am 평균 말단기를 갖는 단량체 사이의 마이크 에디션 반응에 의해 형성되었다. 이 예에서 변형된 PBAE 폴리머는 transfection 효율 향상을 위해 평균 종단 단량체를 추가하여 형성할 수 있습니다.

성공적인 transfection은 여기에서 볼 수 있는 녹색 형광 단백질의 과발현에 의해 명백합니다. 이 생물 발광 이미징 데이터는 0일차와 14일차에 있는 쥐를 보여줍니다. GFP 루시페라아제 양성 지방 유래 줄기세포를 뒷다리에 주입한 후, 대표적인 도플러 영상은 0일차에 거울 뒷다리의 한쪽에서 허혈 유도와 성공적인 혈액 재관류를 보여줍니다.

지방 유래 줄기 세포를 발현하는 것에 VEGF를 주입한 후 14일. R-T-P-C-R은 세포 주입 4일 후 치료군에서 암호화된 치료 단백질인 vgf의 성공적인 상향 조절을 확인한 반면, PBS 대조군에서는 발현이 감지되지 않았습니다. 조직 재생을 촉진하기 위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 결합된 줄기 세포 및 유전자 전달 접근법을 적용하는 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 비바이러스 유전자 치료를 위한 생분해성 고분자를 합성하고 이러한 고분자를 사용하여 허혈 및 생체 내 치료를 위한 줄기세포를 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될