준비 및 체외 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 microRNA를 사용한 세포 변형과 병렬 세포 자화를 보장하는 기술을 도입하는 것입니다. 이 방법은 재생 의학 분야의 주요 과제를 해결할 수 있습니다. 이식 전 세포의 유전 공학과 같은.

microRNA를 이용한 효율적인 세포 변형 외에도, 그들은 산화철로 이를 가능하게 했다. 이것은 자기장 적용에 의해 관심 측면의 세포 유지를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 세포 요법은 심장 질환 치료, 저세포 보유 및 세포 생존 개선이 시급히 필요한 경우 매우 유망합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 transfection complex를 준비하기 위해 인간 제대 정맥 내피 세포 배양으로 이 절차를 시작합니다. transfection 48시간 전에 적절한 크기의 플라스틱 세포 배양 웰 플레이트에 HUVEC을 seed합니다. 대략 13의 시작 세포 조밀도로, 성장 표면의 평방 센티미터 당 000의 세포.

다음으로, 새로운 miR/폴리에틸렌이멘/초상자성 산화철 나노 입자를 준비합니다. 먼저 세포 성장 표면의 제곱센티미터당 2.5피코몰의 microRNA와 5% 포도당 용액을 희석하여 마이크로리터당 0.125피코몰의 microRNA의 최종 농도를 얻습니다. 다음으로, PEI를 5% 포도당 용액과 같은 부피로 희석합니다.

희석된 PEI를 microRNA 용액에 첨가하고 얻어진 혼합물을 30초 동안 와류시킵니다. 그런 다음 miR/PEI 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 실온의 초음파 처리 수조에서 MNP를 최소 20분 동안 초음파 처리합니다.

그런 다음 준비된 miR/PEI 혼합물에 적절한 양의 MNP 용액을 추가합니다. 30초 동안 소용돌이친 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 준비된 miR/PEI/MNP 혼합물을 세포의 배양 배지에 직접 적하 첨가합니다.

transfection 6시간 후에 이 혼합물을 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 벡터 안전성을 분석한 후, 공초점 및 초해상도 구조화 조명 현미경을 통해 transfection complex의 세포 내 국소화를 확인하고 특성화합니다. 그렇게 하려면 이전과 같이 24웰 배양 플레이트의 웰에 배치된 젤라틴 코팅 유리 커버 슬립에 HUVEC을 파종합니다.

3가지 색상으로 표시된 miR/PEI/MNP로 세포를 transfection하고 5%의 이산화탄소를 함유한 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 먼저 2% 소 혈청 알부민과 인산염 완충 식염수로 커버 슬립을 씻은 다음 PBS로 씻습니다. 4% 파라포름알데히드 또는 PFA를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.

PBS로 세척한 다음 표준 프로토콜에 따라 DAPI로 핵을 염색합니다. 그런 다음 셰이커에서 PBS로 세포를 3회 15분 동안 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. 준비된 커버 슬립을 적절한 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 놓고 현미경 검사에 사용하기 전에 슬라이드를 최소 1시간 동안 건조시킵니다.

텍스트 프로토콜에 있는 SIM 설정에서 63배 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득합니다. 세포 표적화 및 in vitro 동적 조건 시뮬레이션을 위해 먼저 이전과 같이 HUVEC을 24-well plate에 transfection합니다. 24시간 동안 배양한 후 세포를 씻는다.

그런 다음 PBS에 희석된 EDTA를 1회 추가하고 세포를 수집하기 전에 섭씨 37도에서 4분 동안 세포를 배양합니다. 수집된 세포를 300배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 한 웰에서 얻은 세포 펠릿을 1ml의 신선한 배양 배지와 혼합합니다.

그리고 세포를 12웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 테이프를 사용하여 작은 자석을 국부적으로 고정합니다. 배양 플레이트를 셰이커에 놓고 150RPM에서 12시간 동안 세포 현탁액을 배양하여 동적 조건을 시뮬레이션합니다.

그런 다음 세포를 씻고 4% PFA를 사용하여 고정합니다. DAPI로 핵을 염색합니다. z-stack 모드에서 405 및 504 10나노미터 여기 레이저를 사용한 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 부착물을 기록하여 원시 데이터를 얻습니다.

최대 강도 프로젝션 이미지 처리를 사용하여 분석용 이미지를 생성합니다. 자기적으로 반응성이 있는 세포와 무반응성 세포의 정량 분석을 위해 먼저 24웰 플레이트에서 HUVEC을 transfection합니다. 앞에서 설명한 대로 세포를 세척하고 수집하기 전에 24시간 동안 세포를 배양합니다.

각 웰에서 얻은 세포 펠릿을 500마이크로리터의 가열된 멸균 세포 분류 완충액으로 다시 현탁시킵니다. 제공된 자석으로 고정된 자기 분류 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 그런 다음 새로운 세포 분류 버퍼로 자석의 컬럼을 세 번 세척합니다.

flow-through를 자기적으로 반응하지 않는 분획으로 수집합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 플런저를 사용하여 컬럼을 생각한 새로운 세포 분류 버퍼를 밀어 자기적으로 반응하는 세포 분획을 즉시 수집합니다. Mag-fractions와 Mag+fractions를 모두 300배 G에서 10분 동안 원심분리기합니다.

PBS에서 세포 펠렛을 다시 현탁시킨 후 세포를 계수하고 트리판 블루 배제 분석으로 세포 생존율을 평가합니다. 탯줄에서 분리된 HUVEC은 내피 마커 CD31의 발현과 기저막 매트릭스에 튜브가 형성되는 것이 특징입니다. miR/PEI/MNP로 transfection된 HUVEC은 모두 태그가 지정된 miR을 차지합니다.

그리고 이들의 생존은 transfection 후 24시간 동안 영향을 받지 않습니다. 또한 초고해상도 현미경 검사는 3색 표지된 형질주입 복합체의 준핵 국소화를 보여줍니다. PEI 독성은 miR/PEI 형질주입된 세포의 기능 감소에 의해 확인됩니다.

중요한 것은 MNP가 세포 특성을 복원한다는 것입니다.miR/PEI/MNP 변형 세포는 튜브 형성 측면에서 처리되지 않은 세포와 다르지 않습니다. 더욱이, 이러한 세포는 광표백 후 형광 회복을 통해 밝혀진 바와 같이 세포 간 간극 연접 통신을 유지합니다.

miR/PEI/MNP 변형 세포의 현탁액이 회전 셰이커에 배치된 배양 플레이트의 웰에 파종되면 세포는 국소 자석 응용 영역에서 이동 및 부착하는 경향이 있습니다. 대표적인 이미지는 자석이 적용된 영역의 세포 성장을 보여줍니다. 자석 응용 프로그램 없이.

그리고 배양 우물의 중앙에는 액체의 흐름이 세포를 집중시키고 있었습니다. 마스터링되면 세포 transfection을 2시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자화를 포함하여 일시적이지만 매우 효율적으로 내피 세포를 수정하는 방법에 대해 매우 좋은 인상을 받았을 것입니다.

또한 세포 산물을 말단적으로 특성화하는 방법도 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 형질주입 복합체의 준비, 배양 시간 및 형질주입 후 세척 단계를 위한 성분의 세포 시딩량에 대해 주어진 수치를 따르는 것이 중요합니다. 우리는 이 접근법이 영향을 받은 다른 장기의 치료를 위해 다른 세포 유형에 잘 전달될 수 있을 것이라고 매우 낙관합니다.

이 절차에 따라 변형된 자화 세포를 사용한 생체 내 연구를 수행할 수 있습니다. 그들은 세포의 철제 로딩이 관심 측면에서 세포의 유지를 보장하는 데 효율적인지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 또한 in vivo MRI를 통한 검출 한계를 정의합니다.