준비 및

본 절차의 전반적인 목표는 microRNA를 이용한 세포 변형과 세포 자성화를 동시에 수행하는 기술을 도입하는 것입니다. 이 방법은 이식 전 세포의 유전 공학적 변형과 같이 재생 의학 분야의 주요 과제들을 해결할 수 있습니다.

microRNA를 이용한 효율적인 세포 변형뿐만 아니라, 산화철을 이용한 변형도 가능하게 하였습니다. 이는 자기장 적용을 통해 관심 부위에서 세포 보유력을 높이는 데 활용될 수 있습니다. 세포 치료는 심장 질환 치료에 매우 유망하지만, 낮은 세포 보유력과 세포 생존율을 시급히 개선할 필요가 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형질전환 복합체 준비를 위한 인간 제대정맥 내피세포 배양으로 이 절차를 시작하십시오. 형질전환 48시간 전에 적절한 크기의 플라스틱 세포 배양 웰 플레이트에 HUVEC를 분주합니다. 이때 초기 세포 밀도는 성장 표면 cm²당 약 13,000 cells로 설정합니다.

다음으로, 신선한 miR/polyethyleneimene/초상자성 산화철 나노입자를 준비합니다. 먼저 세포 성장 표면 cm²당 2.5 picomoles의 microRNA와 5% 포도당 용액을 희석하여 최종 농도가 0.125 picomoles/µL가 되도록 합니다. 그다음, PEI를 동일한 부피의 5% 포도당 용액으로 희석합니다.

희석된 PEI를 microRNA 용액에 첨가하고 얻은 혼합물을 30초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 miR/PEI 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. MNP를 실온의 초음파 세척기 수조에서 최소 20분 동안 초음파 처리합니다.

그다음 준비된 miR/PEI 혼합물에 적절한 양의 MNP 용액을 첨가합니다. 30초 동안 볼텍싱한 후, 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이어서 준비된 miR/PEI/MNP 혼합물을 세포가 담긴 배양 배지에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.

형질전환 6시간 후에 이 혼합물을 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 본문 프로토콜에 설명된 벡터 안전성 분석 후, 공초점 및 초해상도 구조광 조명 현미경을 통해 형질전환 복합체의 세포 내 위치를 확인하고 특성화하십시오. 이를 위해 이전과 같이 24웰 배양 플레이트의 웰에 배치된 젤라틴 코팅 유리 커버슬립 위에 HUVEC를 파종하십시오.

3색으로 표지된 miR/PEI/MNP를 세포에 트랜스펙션하고, 5% 이산화탄소가 포함된 습윤 분위기의 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 먼저 2% bovine serum albumin과 phosphate buffered saline으로 세척한 후, PBS만으로 다시 세척합니다. 세포를 4% paraformaldehyde 또는 PFA에 넣고 37 °C에서 15분 동안 반응시켜 고정합니다.

PBS로 세척한 후 표준 프로토콜에 따라 DAPI로 핵을 염색합니다. 그런 다음, 과잉 염료를 제거하기 위해 쉐이커에서 15분 동안 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 적절한 봉입제를 사용하여 준비된 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 현미경 관찰에 사용하기 전 최소 1시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다.

텍스트 프로토콜에 명시된 SIM 설정과 63배 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득하십시오. 세포 타겟팅 및 인비트로(in vitro) 모사 동적 조건 설정을 위해, 먼저 이전과 동일하게 HUVEC를 24-웰 플레이트에 트랜스펙션하십시오. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하십시오.

그 다음 PBS로 희석한 EDTA를 1x 첨가하고, 세포를 수집하기 전 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 수집한 세포를 300 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 웰 하나에서 얻은 세포 펠렛을 1 mL의 신선한 배양 배지와 혼합합니다.

그런 다음 세포를 12-well 플레이트의 단일 well로 옮깁니다. 작은 자석을 테이프를 사용하여 국소적으로 고정합니다. 배양 플레이트를 셰이커(shaker) 위에 놓고, 동적 조건을 시뮬레이션하기 위해 세포 현탁액을 150 RPM에서 12시간 동안 배양합니다.

그 다음 세포를 세척하고 4% PFA를 사용하여 고정합니다. DAPI로 핵을 염색합니다. 원시 데이터를 얻기 위해 405 및 504 nm 여기 레이저를 사용한 z-stack 모드의 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포 부착 상태를 기록합니다.

분석용 이미지를 생성하기 위해 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 이미지 처리 기법을 사용하십시오. 자기 응답성 세포와 비응답성 세포의 정량적 분석을 위해, 먼저 24-웰 플레이트의 HUVECs를 형질전환합니다. 앞서 설명한 대로 세포를 세척하고 수집하기 전, 세포를 24시간 동안 배양하십시오.

각 웰에서 얻은 세포 펠렛을 500 µL의 가온된 멸균 세포 분리 완충액으로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 제공된 자석으로 고정한 자기 분리 컬럼에 적용합니다. 그런 다음 자석에 고정된 컬럼을 신선한 세포 분리 완충액으로 3회 세척합니다.

흐름-통과액을 자기 반응성이 없는 분획으로 수집하십시오. 자석에서 컬럼을 제거하고, 플런저를 사용하여 새로운 세포 분리 완충액을 컬럼에 통과시켜 자기 반응성 세포 분획을 즉시 수집하십시오. Mag- 및 Mag+ 분획을 모두 300G에서 10분 동안 원심분리하십시오.

세포 펠릿을 PBS에 재현탁한 후, 세포 수를 측정하고 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion assay)으로 세포 생존율을 평가합니다. 탯줄에서 분리된 HUVEC은 혈관 내피 마커인 CD31의 발현과 기저막 매트릭스 상에서의 관 형성 능력이 특징입니다. miR/PEI/MNP가 형질전환된 HUVEC은 모두 표지된 miR을 흡수합니다.

그리고 transfection 후 24시간이 지나도 이들의 생존율은 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 초고해상도 현미경 관찰을 통해 3색으로 표지된 transfection 복합체가 핵 주변에 위치함을 확인하였습니다. PEI 독성은 miR/PEI가 transfection된 세포의 기능 저하를 통해 확인됩니다.

중요한 점은, MNP가 세포 특성을 회복시킨다는 것입니다. miR/PEI/MNP로 변형된 세포는 관 형성 능력 면에서 처리되지 않은 세포와 차이가 없습니다. 또한, 광퇴색 후 형광 회복 기술을 통해 확인한 결과, 이들 세포는 세포 간 간극 결합 통신을 유지하고 있었습니다.

miR/PEI/MNP로 변형된 세포 현탁액을 회전 셰이커 위에 놓인 배양 플레이트의 웰에 분주하면, 세포는 국소적으로 자석이 적용된 영역으로 이동하여 부착되는 경향이 있습니다. 대표 이미지들은 자석이 적용된 영역에서의 세포 성장을 보여줍니다. 자석을 적용하지 않은 경우입니다.

그리고 액체의 흐름이 세포를 집중시키는 배양 웰의 중앙 부분입니다. 숙련되면 세포 형질전환은 2시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 자성화를 포함하여 내피세포를 일시적이지만 매우 효율적으로 변형시키는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

또한 세포 생성물을 최종적으로 특성화하는 방법도 다룹니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 파종량, 형질전환 복합체 준비를 위한 구성 성분 수치, 배양 시간 및 형질전환 후 세척 단계를 명시된 대로 따르는 것이 중요합니다. 우리는 이 접근 방식이 다른 영향받은 장기의 치료를 위한 다른 세포 유형에도 잘 전이될 수 있을 것이라고 매우 낙관합니다.

이 절차를 통해 수정된 자성 세포를 이용한 인비보(in vivo) 연구를 수행할 수 있습니다. 이를 통해 세포의 철 부하(iron-loading)가 관심 부위 내의 세포 유지력을 보장하는 데 효율적인지 여부를 확인할 수 있으며, 인비보 MRI의 검출 한계를 정의할 수도 있습니다.