Name: 준비 및 체외 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 내피 세포에 microRNA를 비바이럴로 전달하고 PEI/MNP 벡터로 자화하는 방법을. 이 기술은 재생의학에서 세포 유지와 MRI 검출 가능성을 향상시켜 세포 치료 효율을 높입니다.

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우리는 필터링 된 초상 자성 나노 입자의 TEM 이미지를 획득과 자신의 X 선 분석을 수행하기에 기술 지원을위한 G. 풀다 (전자 현미경 센터, 로스 토크 대학, 독일)에 감사드립니다. RTC 로스 토크에서 수행 작업은 연방 교육 연구부 독일 (FKZ 0312138A, FKZ 316159 및 VIP + 03VP00241) 및 EU 구조 기금과 국가 메 클렌 부르크 - 서쪽 포메 라니아 (ESF / IV-WM-B34-에 의해 지원되었다 0030/10와 ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) 및 DFG (DA 1296-1), 축축한 재단 및 독일 심장 재단 (F는 / 01 / 12)에 의해. 프랭크 위호스트 EU FP7 연구 프로그램 &quot;Nanomag&quot;FP7-NMP-2013-LARGE-7에 의해 지원되었다.

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상기 자기 자신의 제어 지침 상자성 나노로드 유 전적으로 조작 된 세포의 제조는 현재의 프로토콜에 제공된다. 이 전략의 성공적인 응용 프로그램은 이식에 대한 타겟팅 전지 제품을 제공함으로써, 같은 부상 영역 2, 3, 4, 낮은 유지와 가난한 생착 등 세포 치료의 어려움의 해결을 위해 수 있습니다. 또한, 적절히 선택 유전 물질의 동시 도입은 전지 특성을 촉진 할 수있어 기능적 이득 (41)을 증가 할 수있다. 현재의 프로토콜은 모델로 된 HUVECs에 개발되었다. 이러한 세포 독성 영향이 18, 19, <sup class="...

유전자 및 세포 치료는 CVD 처리에 현재의 문제를 해결할 가능성이있는 강력한 도구입니다. 이러한 접근 방법 모두 현재 임상 실험에서 테스트되고 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 아직 다양한 임상 적 적용 일에 대한 준비가되지 않습니다. 특히, 유전자 및 세포 치료의 과제를 해결하는 일반적인 접근 방식은 임상 적 적용에 적합한 다기능 유전자 전달 벡터를 개발하는 것입니다. 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템의 부족은 유전자 치료의 주요 관심사입니다. 동시에, 세포 제품의 유전 공학 낮은 효율 (예를 들어, 심장 분야에서 기능 개선 만 ~ 5 % 달성 후 줄기 세포 이식 1과 세포 치료의 심각한 도전을 극복 할 수 이식에 앞서 시간 포 분 이내에 10 % -)와 가난한 유지 / 상해의 사이트에 생착이 (즉, 세포의 유지는 아래 5 방울세인트 애플리케이션, 투여 경로에 관계없이 2, 3, 4). 현재까지, 바이러스 벡터가 크게 임상 시험에서의 넓은 응용 가져왔다 효율의 관점에서 비 바이러스 시스템 (~ 67 %)를 초과 5. 그러나 바이러스 차량은 실시 유전 물질 (6)의 크기에 심각한 (심각한 합병증 및 후속 염증 반응) 등의 면역 원성 등의 위험, 관련한 종양 및 제한을 실시한다. 이러한 안전 문제 및 바이러스 벡터 생산의 높은 비용으로 인해, 비 바이러스 시스템의 사용은 어떤 경우 7, 8 바람직하다. 여기에는 (CVD 처리에 대한 예)를 제어 혈관 성장 인자의 발현 유전자로서 과도 보정을 필요 이상, 또는 대인 수수에 특히 적합백신의 스피. 우리 그룹에서, 전달 시스템은 지형 25 kDa의 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 비오틴 - 스트렙 트 아비딘 상호 작용 (9)에 의해 함께 결합 초상 자성 산화철 나노 입자 (MNP)를 조합하여 설계되었다. 이 벡터는 이전의 이식에 대한 그들의 동시 자화를 허용 세포의 유전 공학에 대한 잠재적 인 도구입니다. 후자는 고급 자기 타겟팅 기술이 성공적으로 10을 개발하고 있습니다로, 요즘 특히 유망 자기 안내 / 보존을위한 기초를 제공한다. 또, 얻어진 자기 응답 세포가 될 가능성이있는 비 침습적으로 자기 공명 영상 (MRI) 또는 자기 입자 이미지 (11) (12)에 의해 모니터링. PEI는 / MNP 벡터의 경우에, 폴리아민은 분해 인자로부터 핵산 축합 따라서 보호를 보장<html> 의, 세포에서 벡터의 국제화 및 엔도 좀은 5 탈출. MNPS 자기 유도의 관점에서뿐만 아니라, 공지 된 PEI 중독 7, 13, 14을 감소시킴으로써뿐만 아니라, PEI의 특성을 보완. 이전 PEI / MNP 벡터 성질은 섬유 아세포와 인간 중간 엽 줄기 세포 (15, 16)를 사용하여 전달 효율 (즉,과의 pDNA의 miRNA) 및 안전성의 관점에서 조정 하였다. 이 논문에서 miRNA의 변성 세포의 발생에 대한 PEI / MNPS의 애플리케이션에 대한 상세한 프로토콜은 17을 설명한다. 이를 위해, HUVECs를 사용하고 체외 혈관 신생에 대한 확립 된 모델을 나타내고있다. 그들은 형질에 도전하고 독성 영향 (18), (19)에 취약엉덩이 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 20. 또한, 우리는 그들의 타겟팅, 세포 간 통신 및 MRI 탐지를 포함하여 체외에서 이러한 세포를 평가하는 알고리즘을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>Sephadex G-25 매체</td></tr><tr><td>닌히드린 시약 용액 2%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Biotin 정량 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Microplate 리더 모델 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere 상자성 입자</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF 필터</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &micro; m</td></tr><tr><td>Libra 120 투과 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>가속 전압 120&nbsp; kV</td></tr><tr><td>사파이어 X-선 검출기</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스틱</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA 라벨 IT 키트</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 IV Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>내피 성장 배지, EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 & CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>써모 사이언티픽</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>anti-PECAM-1 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 염료 라벨링 Pre-miR 음성 대조군</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td>"<td>Cy3-miR" 또는 "Cyanine-miR3" 원고</td></tr><tr><td>내 Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td> <td>원고에 "scr-miR"로</td><td>AM17110</td></tr> <tr><td>Anti-has-miR92a-3p 합성 억제제&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 시스템</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>PBS</td></tr><tr><td>DAPI 핵 염색</td> 내 4% 용액 <td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA 분리 키트</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 분리 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR 시스템</td><td>응용 바이오시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-92a TaqMan 어세이</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>Mature miRNA 염기서열: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan 어세이</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan 어세이</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA 내인성 제어</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7.1 Tesla 동물 MRI 시스템</td><td>Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td></td>, <td>NIH(AngiogenesisAnalyzer)로 업그레이드</td></tr><tr><td>MPS 장치</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab 소프트웨어</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>링 네오딤 자석&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 mm; 잔열성은 ~ 1.3&nbsp; T, 보자력 &ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 이미징 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 시약</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>초음파 수조</td><td>Bandelin 전자</td><td>유형: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

현재까지, 심혈관 질환에 사용할 수있는 수술 및 약물 치료 (CVD)는 제한적이며 종종 완화. 동시에, 유전자 및 세포 치료는 CVD 치료에 매우 유망한 대안 적 방법을 제공합니다. 그러나, 유전자 치료의 다양한 임상 적 적용이 매우 적합 유전자 전달 시스템의 부족에 의해 제한된다. 적절한 유전자 전달 벡터의 개발은 세포 치료의 현재 문제점에 대한 해결책을 제공 할 수있다. 등 부상 기관에 제한 효율성과 낮은 세포 유지와 같은 특히, 기존의 단점에서, 적절한 세포 공학에 의해 (즉, 유전) 이전에 이식에 극복 할 수있다. 제시된 프로토콜은 폴리에틸렌 초상 자성 나노 입자 (PEI / MNP) 기반 전달 벡터를 사용하여 내피 세포의 효율적이고 안전한 과도 변형 례를 설명한다. 또한, 알고리즘과 셀 특성화 방법이 정의되어있다. 성공적인 intracellu마이크로 RNA 인간 제대 정맥 내피 세포로 (은 miR) (HUVEC를)의 경 전달 세포 생존, 기능, 또는 간 통신에 영향을주지 않고 달성되었다. 또한,이 방법은 소개 외생은 miR에서 강력한 기능 효과를 일으킬 것으로 입증되었다. 중요한 것은,이 MNP 기반 벡터의인가는 자기 타겟팅 및 비 침습성 MRI 추적 가능성을 수반 셀 자화를 보장한다. 이것은 MRI와 비 침습적 모니터링 할 수있는 자기 유도, 유 전적으로 조작 된 세포 치료제를위한 기초를 제공 할 수있다.

제안 된 프로토콜의 주요 목적은 자기 반응은 miR-수정 세포를 생산하기 위해 자신의 정확한 특성 (그림 1)을 수행하는 것입니다. 따라서, MRI 자기장으로 선택하고 안내 및 검출 응답을 효율적으로 형질 감염된 세포를 수득한다. 먼저, 절연 된 HUVEC의 신원은 내피 세포 마커 CD31 전형적인 염색 (PECAM) (도 2a)에 의해 적절한 기저막 매트릭스 (도 2b)의 튜브를 형성하는 능력에 의해 확인되었다. 얻어진 세포는 미르가 매우 효율적으로 PEI / MNP 도입 채택했다; 현미경 모든 셀은 miR 태그 (Cy3가) 24 시간 후 형질 감염 (도 3a)의 신호에 대해 양성인 것으로 보였다. 중요한 것은, 어떤 세포 사멸은 미처리 ...

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

본 절차의 전반적인 목표는 microRNA를 이용한 세포 변형과 세포 자성화를 동시에 수행하는 기술을 도입하는 것입니다. 이 방법은 이식 전 세포의 유전 공학적 변형과 같이 재생 의학 분야의 주요 과제들을 해결할 수 있습니다.microRNA를 이용한 효율적인 세포 변형뿐만 아니라, 산화철을 이용한 변형도 가능하게 하였습니다. 이는 자기장 적용을 통해 관심 부위에서 세포 보유력을 높이는 데 활용될 수 있습니다. 세포 치료는 심장 질환 치료에 매우 유망하지만, 낮은 세포 보유력과 세포 생존율을 시급히 개선할 필요가 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형질전환 복합체 준비를 위한 인간 제대정맥 내피세포 배양으로 이 절차를 시작하십시오. 형질전환 48시간 전에 적절한 크기의 플라스틱 세포 배양 웰 플레이트에 HUVEC를 분주합니다. 이때 초기 세포 밀도는 성장 표면 cm²당 약 13,000 cells로 설정합니다.다음으로, 신선한 miR/polyethyleneimene/초상자성 산화철 나노입자를 준비합니다. 먼저 세포 성장 표면 cm²당 2.5 picomoles의 microRNA와 5% 포도당 용액을 희석하여 최종 농도가 0.125 picomoles/µL가 되도록 합니다. 그다음, PEI를 동일한 부피의 5% 포도당 용액으로 희석합니다.희석된 PEI를 microRNA 용액에 첨가하고 얻은 혼합물을 30초 동안 볼텍싱합니다. 그런 다음 miR/PEI 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. MNP를 실온의 초음파 세척기 수조에서 최소 20분 동안 초음파 처리합니다.그다음 준비된 miR/PEI 혼합물에 적절한 양의 MNP 용액을 첨가합니다. 30초 동안 볼텍싱한 후, 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이어서 준비된 miR/PEI/MNP 혼합물을 세포가 담긴 배양 배지에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.형질전환 6시간 후에 이 혼합물을 신선한 배양 배지로 교체하십시오. 본문 프로토콜에 설명된 벡터 안전성 분석 후, 공초점 및 초해상도 구조광 조명 현미경을 통해 형질전환 복합체의 세포 내 위치를 확인하고 특성화하십시오. 이를 위해 이전과 같이 24웰 배양 플레이트의 웰에 배치된 젤라틴 코팅 유리 커버슬립 위에 HUVEC를 파종하십시오.3색으로 표지된 miR/PEI/MNP를 세포에 트랜스펙션하고, 5% 이산화탄소가 포함된 습윤 분위기의 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 먼저 2% bovine serum albumin과 phosphate buffered saline으로 세척한 후, PBS만으로 다시 세척합니다. 세포를 4% paraformaldehyde 또는 PFA에 넣고 37 °C에서 15분 동안 반응시켜 고정합니다.PBS로 세척한 후 표준 프로토콜에 따라 DAPI로 핵을 염색합니다. 그런 다음, 과잉 염료를 제거하기 위해 쉐이커에서 15분 동안 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 적절한 봉입제를 사용하여 준비된 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 올리고, 현미경 관찰에 사용하기 전 최소 1시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다.텍스트 프로토콜에 명시된 SIM 설정과 63배 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득하십시오. 세포 타겟팅 및 인비트로(in vitro) 모사 동적 조건 설정을 위해, 먼저 이전과 동일하게 HUVEC를 24-웰 플레이트에 트랜스펙션하십시오. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하십시오.그 다음 PBS로 희석한 EDTA를 1x 첨가하고, 세포를 수집하기 전 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 수집한 세포를 300 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 웰 하나에서 얻은 세포 펠렛을 1 mL의 신선한 배양 배지와 혼합합니다.그런 다음 세포를 12-well 플레이트의 단일 well로 옮깁니다. 작은 자석을 테이프를 사용하여 국소적으로 고정합니다. 배양 플레이트를 셰이커(shaker) 위에 놓고, 동적 조건을 시뮬레이션하기 위해 세포 현탁액을 150 RPM에서 12시간 동안 배양합니다.그 다음 세포를 세척하고 4% PFA를 사용하여 고정합니다. DAPI로 핵을 염색합니다. 원시 데이터를 얻기 위해 405 및 504 nm 여기 레이저를 사용한 z-stack 모드의 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포 부착 상태를 기록합니다.분석용 이미지를 생성하기 위해 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 이미지 처리 기법을 사용하십시오. 자기 응답성 세포와 비응답성 세포의 정량적 분석을 위해, 먼저 24-웰 플레이트의 HUVECs를 형질전환합니다. 앞서 설명한 대로 세포를 세척하고 수집하기 전, 세포를 24시간 동안 배양하십시오.각 웰에서 얻은 세포 펠렛을 500 µL의 가온된 멸균 세포 분리 완충액으로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 제공된 자석으로 고정한 자기 분리 컬럼에 적용합니다. 그런 다음 자석에 고정된 컬럼을 신선한 세포 분리 완충액으로 3회 세척합니다.흐름-통과액을 자기 반응성이 없는 분획으로 수집하십시오. 자석에서 컬럼을 제거하고, 플런저를 사용하여 새로운 세포 분리 완충액을 컬럼에 통과시켜 자기 반응성 세포 분획을 즉시 수집하십시오. Mag- 및 Mag+ 분획을 모두 300G에서 10분 동안 원심분리하십시오.세포 펠릿을 PBS에 재현탁한 후, 세포 수를 측정하고 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion assay)으로 세포 생존율을 평가합니다. 탯줄에서 분리된 HUVEC은 혈관 내피 마커인 CD31의 발현과 기저막 매트릭스 상에서의 관 형성 능력이 특징입니다. miR/PEI/MNP가 형질전환된 HUVEC은 모두 표지된 miR을 흡수합니다.그리고 transfection 후 24시간이 지나도 이들의 생존율은 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 초고해상도 현미경 관찰을 통해 3색으로 표지된 transfection 복합체가 핵 주변에 위치함을 확인하였습니다. PEI 독성은 miR/PEI가 transfection된 세포의 기능 저하를 통해 확인됩니다.중요한 점은, MNP가 세포 특성을 회복시킨다는 것입니다. miR/PEI/MNP로 변형된 세포는 관 형성 능력 면에서 처리되지 않은 세포와 차이가 없습니다. 또한, 광퇴색 후 형광 회복 기술을 통해 확인한 결과, 이들 세포는 세포 간 간극 결합 통신을 유지하고 있었습니다.miR/PEI/MNP로 변형된 세포 현탁액을 회전 셰이커 위에 놓인 배양 플레이트의 웰에 분주하면, 세포는 국소적으로 자석이 적용된 영역으로 이동하여 부착되는 경향이 있습니다. 대표 이미지들은 자석이 적용된 영역에서의 세포 성장을 보여줍니다. 자석을 적용하지 않은 경우입니다.그리고 액체의 흐름이 세포를 집중시키는 배양 웰의 중앙 부분입니다. 숙련되면 세포 형질전환은 2시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 자성화를 포함하여 내피세포를 일시적이지만 매우 효율적으로 변형시키는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.또한 세포 생성물을 최종적으로 특성화하는 방법도 다룹니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 파종량, 형질전환 복합체 준비를 위한 구성 성분 수치, 배양 시간 및 형질전환 후 세척 단계를 명시된 대로 따르는 것이 중요합니다. 우리는 이 접근 방식이 다른 영향받은 장기의 치료를 위한 다른 세포 유형에도 잘 전이될 수 있을 것이라고 매우 낙관합니다.이 절차를 통해 수정된 자성 세포를 이용한 인비보(in vivo) 연구를 수행할 수 있습니다. 이를 통해 세포의 철 부하(iron-loading)가 관심 부위 내의 세포 유지력을 보장하는 데 효율적인지 여부를 확인할 수 있으며, 인비보 MRI의 검출 한계를 정의할 수도 있습니다.

preparation-vitro-characterization-magnetized-mir-modified

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 배양액에서 CD31+ 내피 전구 세포(EPC)를 정제하는 기술을 보여줍니다. 세포 현탁액은 EPC의 CD31에 결합하는 형광단 접합 항체로 처리됩니다. CD31+ EPC의 라벨링을 완료하려면 형광단에 결합하는 항체 복합체와 항체 복합체에 결합하는 폴리머 코팅된 자성 나노입자를 추가해야 합니다. 그런 다음 표지된 세포는 자기장을 사용하여 정제되고 CD31- 세포는 폐기됩니다.

Magnetic-Activated Cell Sorting을 이용한 CD31+ 내피 전구 세포의 정제

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

우리의 목표는 설계, 제조 및 내피 세포 캡처를위한 강자성 스텐트를 테스트했다. 열 스텐트 파괴에 대해 시험하고, 10 이상이 유지 자성 스텐트에 대해 시험 하였다. 마지막으로, 10 스텐트는 시험관 시험하고 8 개의 스텐트는 세포 캡처 및 보존을 보여 4 돼지에 이식했다.

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

우리는 정맥 기형의 뮤린 xenograft 모형을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 본 모델은 하이퍼 활성화 TIE2 및/또는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 포함하는 환자 유래 내피 세포의 피하 주입을 기반으로 한다. Xenograft 병변은 VM 환자 조직의 조직 병리학적 특징을 밀접하게 재구성합니다.

정맥 기형에 대한 환자 유래 제노이식 모델

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

배우세요 내피 세포에 microRNA를 비바이럴로 전달하고 PEI/MNP 벡터로 자화하는 방법을. 이 기술은 재생의학에서 세포 유지와 MRI 검출 가능성을 향상시켜 세포 치료 효율을 높입니다.

준비 및

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