분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

이 절차의 전반적인 목표는 TH 17 세포를 naive CD 4 양성 T 림프구와 구별하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 C 57 black six 마우스에서 림프절과 비장을 채취하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 조직을 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

그런 다음 CD 4개의 양성 CD 25 음성 T 세포를 분리하고 TH 17 유도 또는 활성화 제어 조건에서 배양합니다. 궁극적으로 Q-P-C-R-E-I-S-A 및 유세포 분석법을 사용하여 IL 17 A 발현을 평가할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 CD 4개의 T 림프구가 C 57 검은색 6개 마우스에서 T 8개의 17개 세포로 분화되는 것에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

다른 마우스 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시연은 림프절이 매우 작아 절제 단계를 어렵게 만들기 때문에 매우 중요합니다. 이 방법을 직접 시각화하지 않고, 세포를 추가하기 최소 4 시간 전에 멸균 PBS에 희석 된 30 마이크로 리터의 안티 CD로 새로운 96 웰 UBO 마이크로 테스트 조직 배양 플레이트의 웰을 코팅하고 플레이트의 측면을 두드려 웰의 균일 한 적용 범위를 보장 한 다음 4 시간 후에 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 세포를 추가할 때까지 플레이트를 냉장 보관하십시오.

자궁경부 탈구로 인한 사망을 확인한 후 성인 C 57 블랙 식스 마우스의 절개 부위를 70% 에탄올로 소독합니다. 그런 다음 요도 입구 앞쪽의 피부를 잡고 복막을 방해하지 않도록 주의하면서 복부 정중선에서 턱 부분까지 자릅니다. 그런 다음 림프절과 비장에 접근할 수 있도록 피부를 고정하여 제거합니다.

이제 가슴 근육 뒤에 있는 쥐의 겨드랑이 근처에 있는 겨드랑이 림프절을 제거하고 조직을 5ml의 AutoMax 러닝 버퍼가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 각 겨드랑이 근처의 결합 조직에 위치한 상완 림프절을 제거합니다. 다음으로, 기관(기관) 옆의 동물의 목에서 발견되는 표재성 경추 림프절을 제거한 다음 세 혈관이 연결된 엉덩이 부위에 위치한 서혜부 림프절을 제거합니다.

장간막 림프절에 접근하려면 먼저 복막 내벽을 통해 복부 정중선을 잘라냅니다. 장간막 림프절은 쥐의 장간막 깊숙한 곳에 위치하며, 일반적으로 진주 끈으로 나타날 수 있는 4-8개의 마디로 구성된 끈으로 되어 있습니다. 비장을 제거하고 췌장에서 당기고 분리합니다.

그런 다음 림프절이 있는 페트리 접시에 넣어 장기를 갈아냅니다. 한 현미경 슬라이드의 젖빛 면에 림프절을 놓고 두 번째 슬라이드의 젖빛 면으로 조직을 문지릅니다. 지상 장기를 단일 세포 현탁액으로 여과하려면 먼저 40미크론 나일론 소재의 약 3인치 x 3인치 조각을 여러 번 접고 15ml 원심분리기 튜브 상단에 놓습니다.

21 게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 세포와 완충액을 흡인한 다음 접힌 나일론에 세포 용액을 천천히 분배합니다. 바늘로 재료에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 단일 세포 현탁액이 달성되면 용액은 눈에 보이는 고체 조직 조각이 없는 것처럼 보여야 합니다.

이 용액을 얼음 위에 놓습니다. AutoMax로 세포를 분류한 후 최소 80%CD 4개의 양성 CD 25 음성 세포 순도로 분리합니다. trian blue exclusion에 의해 세포를 계수한 다음 세포 배양 배지에서 세포 현탁액을 10배로 10배로 희석하여 1밀리리터당 6개의 세포

이제 안티 CD 3 코팅 플레이트의 모든 우물을 200 마이크로 리터의 PBS로 헹굽니다. 각각 세척물을 쓰레기통에 버립니다. 그런 다음 100마이크로리터의 TH 17 유도 칵테일 또는 활성화 제어 혼합물을 적절한 웰에 3회 첨가합니다.

마지막으로, 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 추가하고 최소 72시간 또는 최대 5일 동안 세포를 배양하여 Eli SA 및 QPCR에 대한 TH 17 세포 분화를 달성합니다. 배양 기간이 끝나면 각 샘플의 풀을 개별 einor 튜브로 삼중화합니다. 세포를 회전시킨 후 상등액을 별도의 einor 튜브로 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하여 나중에 ELI에 의한 IL 17 A 생산을 측정합니다.

A.To 상등액을 제거한 후 QPCR을 준비하고, 175마이크로리터에 남은 펠릿을 재현탁액, 즉각적인 RNA 추출을 위한 RNA 용해 완충액을 준비하거나 배양 기간 후 절차를 시작할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. IL 17 이전의 세포 활성화를 준비하기 위해, TH 17 유도 또는 활성화 대조 세포 각각은 24 웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰로 3 배의 세포 내 염색 풀입니다. 각 웰에 400마이크로리터의 세포 배양 배지를 추가합니다.

총 부피를 최대 1ml까지 끌어올리려면 PMA 이온 마이신과 펠든 A를 각 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양하여 세포 내 염색 및 유세포 분석을 통해 IL 17 A의 존재를 검출합니다. 먼저, 24웰 플레이트의 각 웰에서 세포를 별도의 einor 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 스핀다운합니다.

상층액을 제거하고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 팩스 버퍼에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 96웰 유세포 분석 플레이트로 옮기고 펠릿을 200마이크로리터의 팩스 버퍼로 세척한 후 세포를 다시 스핀다운하고 100마이크로리터의 팩스 버퍼에 세포를 재현탁하고 100마이크로리터의 세포외 항체 염색 혼합물을 첨가합니다. 빛을 피해 실온에서 15분 동안 배양합니다.

세포를 두 번 세척 한 후 100 마이크로 리터의 BD cyto에서 펠릿을 배양합니다. 호일로 덮인 사이토 펌 버퍼를 실온에서 20분 동안 고정합니다. 이제 100 마이크로 리터의 1 X BD perm wash buffer에서 세포를 두 번 세척 한 다음 실온에서 15 분 동안 호일로 덮인 50 마이크로 리터의 세포 내 항체 혼합물에서 세포를 배양합니다.

세포를 다시 세척한 후 200마이크로리터의 BD 염색 완충액에 세포를 현탁시킨 다음 200마이크로리터의 염색 완충액을 포함하는 유세포 분석 튜브로 세포를 옮깁니다. 살아있는 세포 집단의 첫 번째 게이트인 샘플의 유세포 분석을 위해 판독할 준비가 될 때까지 튜브를 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음으로, 살아있는 세포 집단을 사용하여 CD 4개의 양성 CD 8개 음성 집단을 게이트합니다.

마지막으로, TH 17 세포를 분화하기 위해 IL 17 A 양성 집단에서 CD 4 개의 양성 CD 8 음성 집단의 보행, 분획되지 않은 풀링 림프절 및 비장 세포는 CD 4 개의 양성 CD 25 음성 T 세포 집단에 대해 농축되어야합니다. 이 그림에서는 anti CD 4 및 anti CD 25로 염색된 분획되지 않은 풀링 림프절 세포, SP 세포 및 AutoMax의 분리된 TT 세포 분획을 보여줍니다. 이 첫 번째 산점도는 분획되지 않은 풀링 림프절 및 비장 세포에 존재하는 CD 4 양성, CD 25 양성 및 CD 4 양성 CD 25 음성 림프구의 백분율에 대한 대표적인 프로파일을 보여줍니다.

분리 절차는 또한 추가 실험에 사용할 수 있는 농축된 CD 4개의 양성 CD 25 양성 treg 집단을 제공합니다. 이 최종 산점도에서는 84%CD 4개의 양성 CD 25 음성 T 세포인 모집단으로 원하는 세포 농축이 표시됩니다. 이 농축된 CD 4개의 양성 CD 25 음성 T 세포 집단은 이 그림에 설명된 바와 같이 보다 성공적인 TH 17 분화를 보장하는 데 도움이 됩니다.

CD 4 양성 CD 25 음성 T 림프구를 항 CD 3 및 항 CD 28과 함께 5 일 동안 배양하면 CD 25 양성 T 림프구가 생성되는 반면, TH 17 유도 조건 하에서 배양하면 IL 17의 하위 집합이 생성되어 CD 4 개의 양성 CD 25 양성 림프구가 생성됩니다. TH 17 분화 상태는 정량적 PCR을 통해 추가로 평가할 수 있으며, 여기서 농축 CD 4 개의 양성 CD 25 음성 T 림프구의 데이터는 대조군 하에서 배양 된 T 림프구 또는 TH 17 유도 조건의 CD 4 개의 양성으로 표시됩니다. TH 17 조건에서 배양된 CD 25 음성 T 림프구는 IL 17 A를 상향 조절하며, 이는 QPCR 및 ELI SA를 통해 확인할 수 있습니다. TH 17 특이적 전사 인자 ROAR gamma T는 QPCR로 측정할 수 있는 TH 17 유도 조건 하에서 배양된 CD 4개의 positive CD 25 negative T cell에 의해 상향 조절됩니다.

이 절차를 수행하는 동안 TH 17 유도 조건에서 세포를 배양하기 전에 최소 80%CD 4개의 positive CD 25 negative cell 순도를 달성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 C 57 black six 마우스에서 림프절과 비장을 해부하는 방법, T eight 17 또는 활성화 제어 조건에서 세포를 배양하는 방법, 그리고 naive CD four T 림프구가 T eight 17 세포 남쪽으로 분화되는 것을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.