Name: 분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T21:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 학습하세요 C57BL/6 마우스의 CD4+ CD25- T 세포를 분리하여 Th17 세포로 분화시키는 방법을. Q-PCR, ELISA, 유세포분석으로 IL-17A 발현을 평가하여 자가면역 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 플로리다 TL1 TR000066 및 UL1 TR000064, 건강의 국립 연구소, BD Biosciences는 시약 부여에서 부모 그랜트 R01AI056152에서 다양성 보충 대학에 NIH / NCATS 임상과 번역 상 과학 포상 및 대학에 의해 부분적으로 지원됩니다 플로리다.

모든 동물의 사용은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 검토를 실시하였습니다. 1. 믹스 미디어의 준비 <ol><li> 멸균 PBS 산도 : 7.3 (1 L) 0.23 g의의 NaH 2 PO 4 1.15 g 나 2 HPO 4 9.0 g의 NaCl DI 물과 볼륨을 차지합니다. 오토 클레이브로 멸균. </li><li> 세포 배양 배지 (100 ㎖) 89 ML의 RPMI 10 ㎖의 10 % FBS 1 ㎖ 항생제 항진균 (ABAM) 100 μg하는 50 mM 2 - 머 캅토 에탄올 (96.5 μg PBS에 3.5 μg 주식 2 - 머 캅토 에탄올) </li><li> 멸균 PBS에 FACS 버퍼 (형광 활성화 셀 정렬) (유동 세포 계측법 동안 사용되는) 2 % FBS </li><li> iTh17 믹스 (샘플 수에 따라 모든 믹스 및 미디어에 필요한 양을 결정) 1.5 ㎍ / ㎖의 항-CD28 20 NG / ML IL-6 5 NG / MLTGF-β </li></ol> 2. 세포는 이하의 조건 중으로 도금 될 것인가 <ol><li> 항-CD3 바인딩 플레이트는, 항-CD28 (이것은 활성화 제어 혼합이다). </li><li> iTH17 : 플레이트 항 CD3 결합, 항 CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. 플레이트 바인딩 항 CD3 (10 ㎍ / ㎖) 그것은 플레이트 바인딩 항 CD3 판의 준비는 이전에 세포가 플레이트에 추가 할 시간을 적어도 4 시간을 수행하는 것이 좋습니다. <ol><li> 웰에 30 ㎕의 항 CD3 추가 새 96 잘 U 바닥 MICROTEST 조직 배양 플레이트 (항 CD3 멸균 PBS에 희석), 그리고 우물의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 판의 측면을 누릅니다. 이 판에 믹스 및 셀을 추가하는 시간이 될 때까지 냉장 후 4 시간 동안 37 ° C에서 부화합니다. </li></ol> 4. 마우스 해부 <ol><li> 이 프로토콜은 C57BL / 6 MIC의 사용에 기초전자, 3-8 세의 월, 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입. </li><li> CO 2 질식을 사용하여 마우스를 희생하고, 이후의 자궁 경부 탈구 죽음을 확인합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 쥐 해부 도구와 절개 영역을 소독하고 해부를 시작합니다. </li><li> 복부보기에서 요도구에 앞쪽에 피부를 잡아 턱의 영역에 도달 할 때까지 가위로 복부 중간 선을 절단 시작합니다. 주의 눈물이나 복막 벽의 안감으로 절단하지보십시오. </li><li> 피부에 당겨 제거하는 동안 림프절에 편안하게 액세스 할 수 있도록 아래로 핀. </li><li> 수집 된 림프절과 비장은 모든 집게로 제거하고, 버퍼 (림프절, 비장 제거 다이어그램 그림 2와 그림 3 참조)있는 Miltenyi Biotec은에서 구입 한 실행 autoMACS 5 ㎖를 포함하는 멸균 페트리 접시에 배치됩니다. <ol><li> 있는 액와 림프절을 제거각 마우스의 가슴 근육 뒤에 겨드랑이 (겨드랑이) 근처에서 발견. </li><li> 각각의 겨드랑이 근처에있는 결합 조직에있는 상완 림프절을 제거합니다. </li><li> 각 마우스의 목에서 발견 된 표면 경부 림프절을 제거합니다. </li><li> 3 혈관의 결합에 엉덩이 지역에 위치한 서혜부 림프절을 제거합니다. </li><li> 복막 안감까지 복부 정중선을 극복 장간막 림프절을 액세스 할 수 있습니다. 장간막 림프절은 내장을 함께 보유하고있는 결합 조직에서 발견된다. 그들은 일반적으로 4-8 노드의 문자열에서 발견되고, &quot;진주의 문자열&quot;로 나타날 수 있습니다. 전체 문자열을 당겨해야합니다. </li><li> 비장은 위장 뒤에 복부 지역에 위치하고 있습니다. 췌장에서 당겨 분리하여 제거합니다. </li></ol></li><li> 2 젖빛 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 기관을 갈기. 림프절이나 비장에 배치해체 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면이 하나의 현미경 슬라이드, 문지의 프로스트 쪽. 모든 림프절, 비장 접지 될 때까지 반복합니다. </li></ol> 참고 : 혈액이 어려운 autoMACs 버퍼에 남아있는 림프절을 볼 것 같은 그것은, 림프절로 시작하고 비장 마무리하는 것이 좋습니다. <ol start="9"><li> 단일 세포 현탁액으로 접지 장기를 필터링하기 위해 40 ㎛의 나일론 조각 위에 재료를 여러 번 접어, 및 15 ㎖의 원심 관의 상부에 위치시킴으로써 시작된다. 나일론 소재는 약 3 × 3인치해야 </li><li> 버퍼와 지상 장기 실행 autoMACs의 5 ㎖를 흡인하는 5 ML의 주사기와 21 G 바늘을 사용합니다. 접힌 나일론 소재로 천천히 분배. 바늘과 재료를 천공 않도록주의하십시오. </li></ol> 참고 : 하나의 세포 현탁액이 달성되면,이 솔루션은 visib없이 함께 창백한, 일관된 솔루션으로 나타납니다단단한 조직의 르 조각. 고체, 다시 대기음을 유지하고 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 넣고 나일론의 새로운 접힌 부분을 분배합니다. <ol start="11"><li> 사용하지 않을 때는 항상 얼음에 세포를 유지. </li></ol> 5. 세포 분리 <ol><li> 최적의 결과를 MACS CD4 + CD25 + 조절 T 세포 격리 키트, 마우스를 사용 autoMACS 프로 셀 구분을 통해 80 %의 순수한 CD4 + CD25-세포 집단을 구하십시오. CD4 + CD25-세포 집단의 네거티브 유지를위한 프로토콜이있는 Miltenyi Biotec 사를 통해 얻을 수있다. </li></ol> 6. TH17 차별화 <ol><li> autoMACS 프로 전지 세퍼레이터로 분리 한 후 CD4 + CD25-세포 인구를 수집합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 트리 판 블루 1:1000 비율로 희석하여 세포를 계산합니다. </li><li> 농도 세포 수로부터 결정되면, 세포 배양 배지에서 1 × 106 세포 / ml로 세포 현탁액을 희석. </li><li> 4 시간 후 항 CD3 바인딩 플레이트 96 웰 플레이트를 꺼내. </li><li> PBS 200 μL와 항 CD3 코팅 우물을 씻으십시오. 2 회 반복한다. <ol><li> 세척하는 것은 항 CD3 코팅 우물에 멸균 PBS 200 ㎕를 추가하고 폐기물 용기에 PBS를 제거합니다. </li></ol></li><li> 세중 우물에 iTh17 혼합 또는 활성화 제어 믹스 100 μL (포인트 # 2 참조)를 추가합니다. </li><li> 각 웰 TH17 혼합 또는 활성화 제어 혼합 하나가 배치 된에에 세포 100 μl를 추가합니다. </li><li> 최소 72 시간 동안 5 일까지 세포를 품어 (TH17 분화는 72 시간 후 5 일 이후에 얻을 수있다.) </li><li> TH17 분화 세포 내 염색과 유세포 분석, ELISA, 또는 qPCR에 의해 평가 될 수있다 </li></ol> 7. 세포 활성화 (필요시에만 세포 내 염색 용) <ol><li> 72 시간 5 일 중 하나의 끝에 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거 <ol><li> 그 리콜 TH17의 differentiatio여기서 n은 72 시간 5 일 중 하나 후에 달성 할 수있다. </li></ol></li><li> 각 조건 (예를 들어 활성화 제어 또는 iTh17)의 경우, 24 웰 세포 배양 플레이트 잘 하나에 세중의에 세포를 전송합니다. 96 잘 U 바닥 배양 접시에 회 반복되는 반대로 하나의 조건에 대한 세포는 지금 24 잘 문화 판의 한 우물에 풀링되었습니다. </li><li> 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰의 총 부피는 지금 600 μL이다. 물론 세포 배양 배지 1 ml로 각각의 볼륨을 높이고. </li><li> (1 μM)을 이오 노마 이신, PMA (포르 미리 스테이트 아세테이트) (50 NG / ML)를 추가하고, BFA (Brefeldin-A) (10 ㎍ / ml)에 나와있는 농도에서 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰. </li><li> 4 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol> 8. 세포 내 염색 <ol><li> 유세포 분석을위한 원하는 세포 외 및 세포 내 마커 스테인 세포. 프리젠 O를 검출F IL-17은 세포 내 염색은 항-IL-17A의 항체로 수행됩니다. 추천 세포 표면 마커는 CD4, CD8, 및 CD25 (가) 있습니다. <ol><li> IL-17 세포 내 염색에 BD 바이오 사이언스에서 세포 내 사이토 카인 염색법 스타터 키트 - 마우스를 사용합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 펠렛 세포는, 상층 액을 제거하고, 200 ㎕의 FACS 버퍼 (PBS 2 % FBS)에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> 플레이트 세포 계측법 96 셀 흐름에 재현 탁 세포를 전송합니다. </li><li> 1,200 rpm에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운 및 뜨는 폐기. </li><li> 1,200 rpm에서 5 분 동안 200 ㎕의 PBS FACS 버퍼, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다. </li><li> FACS 100 μL에 재현 탁 세포는 버​​퍼와 세포 항체 100 ㎕를 (AB) 혼합물 (AB 세포 혼합물을 FACS 버퍼 제)를 적용한다. 호일로 덮여 RT에서 15 분, 알을 품다. </li><li> 8.1.4 단계를 반복합니다. </li><li> 단계를 반복 8.1.5 배. </li><li> BD Cytofix / Cytoperm 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend. Incub호일로 덮여 RT에서 20 분, 위해 먹었다. </li><li> 1X BD 파마 / 워시 버퍼 100 μl를 추가, 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 버린다. 반복합니다. </li><li> 세포 내 AB 혼합물의 50 μl를 추가합니다. 호일로 덮여, RT에서 15 분 동안 배양 (세포 내 AB 혼합물 1X BD 파마 / 워시 제). </li><li> 8.1.10 단계를 반복합니다. </li><li> BD 염색 버퍼 200 μL의 세포를 Resuspend. </li><li> 200 ㎕의 BD 염색 버퍼 (최종 부피가 400 ㎕의 경우) 포함 튜브 유동 세포 계측법에 재현 탁 세포를 놓습니다. </li><li> 4 ° C에서 보관 샘플을 읽을 준비가 될 때까지. </li></ol></li></ol> 9. 유세포 분석 <ol><li> 게이트 라이브 세포 인구. </li><li> 라이브 세포 인구에서, CD4 + CD8 인구에 게이트. </li><li> CD4 + CD8 인구에서, IL-17A + 인구에 문입니다. <ol><li> 우리의 이전 실험 결과에 기초하여, IL-17A + 인구의 100 %가 CD25 +의 것이다. </li></ol></li></ol> * 전체 절대 세포 수치는 샘플에서 삼중 풀링 후에 얻었다 ** CD4 + CD25 + IL-17A + 세포의 절대 수는 라이브 게이트 백분율 및 계통 특이 마커, CD4, CD25, 및 IL-17A 베어링 전체 세포의 비율에 의해 셀의 총 개수를 곱으로 결정 하였다 유동 세포 계측법에 의해 결정. 10. qPCR에와 ELISA <ol><li> 장소 세포는 5 ~ 10 분 동안 13,000 rpm에서 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브와 원심 분리기에서 유세포 분석을 위해 사용되지 않습니다. 원심 분리 후 세포 펠렛에있는 세포의 qPCR 분석을 위해 사용될 것이다. 의 qPCR 분석은 PTC-200 펠티에 열 사이 클러 (바이오 래드)를 사용하여 실시 하였다. </li><li> ELISA를위한 원심 분리 관에서 상층 액을 수집합니다. IL-17A ELISA를이 항체 쌍 TC11-18H10 (캡처, 카탈로그 번호 555068)를 사용하여 수행하고 TC11-8H4의 비오틴 (검출, 제품 번호 555067) BD 바이오 사이언스에서 구입했다. IL-17A ELISA 역ndards은의 eBioscience (카탈로그 번호 14-8171-80)으로 하였다. </li><li> 상층 액을 제거한 후, (나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR에, 또는 상점을 즉시 사용) 175 ㎕의 RNA 용해 버퍼에 qPCR에 사용되는 나머지 세포를 재현 탁. <ol><li> IL-17A와 말라 (집 지키는 유전자)에 대한 프라이머 시퀀스 표 2를 참조하십시오 </li></ol></li></ol>

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</ol>

선언 할 수 없음 공개.

여기에서 우리는 체외 TH17 차별화를 달성하기 위해 프로토콜을 설명했다. T의 분화가 인간의 병원균 (13)의 효과적인 제거를위한 중요 TH17 하위 집합으로 림프구로 TH17 분화 연구는 중요하다. 반대로, IL17의 생산은자가 면역 질환의 진행 (13)와 연결되어 있습니다. 이 면역 조절 및자가 면역의 수많은 별개의 뮤린 모델에 적용 할 수 TH17 분화의 방법은 많은 연구의 설정에 적용 가능하다. 이 방법은 면역 반응을 조절하는 IL-17A의 생산 및 전사 인자 RORγT의 표현으로이 프로토콜에 표시 TH17 세포로 분화하는 T 림프구의 기능,,,에 대한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다. 또한, TH17 세포도 IL17F, Il22 및 GM-CSF 08 (12)의 생산에 의해 식별 될 수있는 다른 사람에 의해 밝혀졌다. 이 프로토콜은 서로에 대한 중요더 나은 T 림프구의 이펙터 기능이 면역 시스템 운영에 관한 방법을 이해하기 위해 이러한 프로토콜...

CD4 + T 림프구 (T 세포) 전염성 미생물에 대한 면역 체계가 중재 방어에 중요한 역할을한다. 역으로, T 세포들은 속속들이 예컨대 제 1 형 당뇨병, 전신성 홍 반성 루푸스, 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환의 발병 및 진행과 연관된다. CD4 + T 림프구는 T 세포 수용체 동족 항원 / 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 분자 (TCR)의 상호 작용의 결합을 통해 활성화되고, B7.1/B7.2와 CD28 수용체의 상호 작용은 15 리간드. TCR 자극 및 CD28 동시 자극의 제공뿐만 아니라, 항원 제시 세포는 또한 이에 관련 항원에 T 림프구의 응답을 연출, T 림프구의 분화 상태를 결정 사이토킨 환경을 제공한다. 고유 병원체 / 항원 제시 세포 상호 작용은 T는 엘리에 초점을 맞춘 독특한 경로를 림프구 왜곡 별개의 사이토 카인 환경을 만들고,시작 병원체의 mination. 불행하게도, 원래 병원균을 침해 근절하기 위해 디자인 된 T 림프구의 음향 경로는 잘못 자기 조직 (15)에 대항 할 수 있습니다. 따라서, 각 별개의 CD4 + T 세포의 부분 집합의 분화 상태를 더 잘 이해 병원균의 제거 및 자기 내성 사이의 균형을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요합니다. TH1, TH2, 및 유도 성 조절 T 세포 분화 경로 이외에, 나이브 T 림프구는 TH17 통로 다운 사이토킨에 의해 구동 될 수있다. Th1 세포 전투 세포 내 병원체 반면에, TH2 세포는 세포 외 병원균을 제거하고, 규제 T 세포 (Tregs가)는 염증 반응 하나, (16)을 최소화; TH17 세포는 세포 외 박테리아 및 곰팡이의 제거에 중요한 역할을한다. TH17 세포는 일반적 계보 특정 전사 인자 및 IL RORγT 생산의 식으로 표시된다대식 세포와 호중구 1, 7의 활성화를 촉진-17A. TH17 세포는 여러 가지자가 면역 질환에 연루 및 관련 설치류 모델이되었다. 예를 들어,이 IL-23 (TH17 표현형을 유지하는데 요구되는) 것으로 증명되었다 아니지만 IL-12, 실험자가 면역성 뇌염 (EAE)의 중심 범인, MS를위한 설치류 질환 모델. 그것은 이후 IL-17의 생산 감소가 EAE 방지 2, 6, 17에 상관 관계가 있음을 보였다. 더욱이, TH17 세포 관절염 및 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) (10), (16)을 포함하는 다른 자기 면역 질환과 관련되었다. IL-23 결핍 P19 - / - 생쥐는 TH17 세포의 매우 낮은 숫자를 가지고 표시하고, EAE뿐만 아니라 개발에 저항했지만, 콜라겐 유도 관절염, 류마티스 관절염 10, 18 모델. 또, 마우스 후미 IL-17A의 중화 항체로 처리ER 콜라겐 - 유도 관절염의 발병은 또한 관절 손상 (18)의 해상도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 최근의 연구는 또한, 제 1 형 당뇨병으로 15, 11, 장내 염증 14 TH17 세포의 보호 역할을 나타낸 것처럼 면역 질환의 진행에 TH17 세포의 역할은 특성화 될 남아 있음을 주목해야한다. 이러한 연구는자가 면역에 TH17 차별화의 중요성을 확인합니다. 1) 정확히 어떻게 IL-6는 Treg의와 TH17 분화 사이의 균형을 조절 않으며, 2) 정확한 메커니즘은 무엇입니까 : 추가 조사가 필요 적어도 두 곤혹 질문이 있기 때문에 체외 TH17의 분화 T 세포 연구에 필요한 방법은 IL-17에 의한 염증성 질환 뒤에? 우리의 방법은 C57BL / 6 마​​우스의 비장 및 림프절에서 CD4 + CD25-T 세포를 이용한다. 그것은주의하는 것이 중요합니다 그것은 불순한를 사용 TH17 분화를 유도 할 수 있지만인구는 80 %의 순수한 CD4 + CD25-T 세포 인구를 획득하는 것은 오염의 걱정을 부정하고 성공 TH17 분화의 결과를 보장합니다. 적절한 TH17 감별을 달성하기 위하여, CD4 + CD25-T 세포는 각각 항-CD3 및 항-CD28, 활성화 신호를 제공하고, 1 및 2의 존재하에 배양하고, IL-06과 TGF-β. 이 IL-23 단독는 TH17 분화를 달성하는 데 사용될 수 있다고보고되었지만, 나중에 IL-23 TH17 세포군의 안정성 필요하다고 입증되었지만, IL-6, TGF-β는 TH17 분화에 필수적인 3, 18, ​​19. 쥐의 연구는 IL-23 수용체가 IL-6와 TGF-β 13, 18로 자극 된 후에 만 CD4 + T 세포에 발현되는 것으로 나타났습니다. 또한, TH17 세포가 성공적으로 한 IL-6와 TGF-β는 18, 19 존재로 IL-23-차단 항체의 존재에 개발할 것입니다. 이와 같이,이 TH17 분화 프로토콜 prov에성공적으로 TH17의 분화를 유도 할 수있는 적절한 조건을 십오. 자가 면역 질환 13을 목표로 더 나은 치료제의 개발을위한 기회를 제공 TH17 차별화와 IL-17 생산을 기본 메커니즘에 대한 이해의 개발.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</td></tr><tr><td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 현미경 슬라이드,</td><td>Frosted Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td>3" x 1"1 mm</td></tr><tr><td>5 ml 21G1 라텍스 프리 주사기 및 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15ml 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>나일론 40</td>미크론 <td>마이애미 양식</td><td>나일론 40/26</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 조직 배양 플레이트 96 웰 U 바닥 </td><td>BD Biosciences</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CL3524</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>정제 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD3e</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td></td></tr><tr><td>정제 NA/LE 햄스터 안티 마우스 CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-6 재조합 단백질</td><td>eBioscience</td><td>14-8061-62</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션 0.4 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>66H2364</td><td></td></tr><tr><td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>558107</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553035</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugated Anti-mouse CD25</td><td>eBioscience</td><td>E01155-516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td><td>BD Biosciences</td><td>560820</td><td></td></tr><tr><td>세포 내 사이토카인 염색 스타터 키트-마우스</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2041AK (559311)</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD4+CD25+ 조절 T 세포 분리 키트, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ABAM </td><td>Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Cellgro</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>B 2-Mercapt&#8211; 탄올</td><td>MP 생물의학</td><td>194834</td><td>유해</td></tr><tr><td>포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아이오노마이신 칼슘염</td><td>시그마-알드리치</td><td>13909-1ML</td><td>유해</td></tr><tr><td>브레펠딘 A(BFA)</td><td>MP 생의학</td><td>159027</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A 캡처 mAb </td><td>BD 생명과학</td><td>555068</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A 검출 mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555067</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A 표준</td><td>eBioscience</td><td>14-8171-80</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ELISA 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>555148</td><td></td></tr><tr><td>TMB 기질 시약 세트 </td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">장비 </td></tr><tr><td>autoMACS Pro 세포 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ 원심분리기</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napco 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTC-200 펠티에 열 순환기</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 나이브 cd4 t 림프구의 th17 분화

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

TH17 세포는 17 (IL-17) 인터루킨 생산하는 것으로 확인 된 T 세포의 서브 세트 별개이며, TH1, TH2, 규제 T 세포를 포함한 다른 T 세포의 서브 세트에서 기능이 다르다. TH17 세포는 많은자가 면역 질환과 관련된 지나치게 염증 면역 반응의 중심 원인으로 등장했습니다. 이 방법에서 우리는 C57BL / 6 마​​우스의 비장과 림프절에서 T 림프구를 정화하고, 제어 및 TH17 유도하는 환경에서 정제 된 CD4 + T 세포를 자극한다. TH17 유발 환경은 항 CD3 및 항 CD28 항체, IL-6와 TGF-β의 존재에 자극을 포함한다. 최소 72 시간 동안 배양 한 후 37 ° C에서 최대 5 일 동안 세포는 이후 세포 계측법, qPCR에, 및 ELISA를 흐름을 통해 IL-17을 생산하는 기능을 분석하고 있습니다. TH17 분화 된 CD4 + CD25-T 세포는 또한 TH17 세포가자가 면역 및 호스트 드의 발병 및 진행에서 재생하는 역할을 규명하기 위해 이용 될 수있다범법. 또한, 별개의 쥐 녹아웃 / 질병 모델에서 CD4 + CD25-림프구의 TH17 분화는 세포의 운명의 가소성에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다.

이 TH17 분화 프로토콜은 비장의 제거와 겨드랑이, 상완, 장간막, 자궁 경부, 서혜부 림프절로 시작합니다. 각각의 위치의 표현은,도 2 및 3에서 찾을 수있다. 그림 1과 5는 모두이 프로토콜에 설명 된 방법의 시각적 표현을 제공합니다. 이 TH17 프로토콜은 CD4 + CD25-T 림프구 인구에서 차별화에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 autoMACS 프로 세포 분리가 풀링 된 총 림프절, 비장 (그림 4)에서 우리의 원하는 CD4 + CD25-인구를 풍요롭게하는 방법을 효율적으로하는 것이 중요하다. 미분 획, 풀링 림프절과 비장 세포 및 autoMACS 분리 분획을 유세포 분석 (그림 4) 다음 antiCD4 및 antiCD25 항체로 염색 하였다. 그림 4a는 CD4 + CD25 +의 ...

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 나이브 CD4 양성 T 림프구로부터 Th17 세포를 분화시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 C57BL/6 마우스에서 림프절과 비장을 적출합니다. 두 번째 단계에서는 해당 조직을 마쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.그 다음 CD4 양성 CD25 음성 T 세포를 분리하고 Th17 유도 조건 또는 활성화 대조군 조건에서 배양합니다. 최종적으로 qPCR, ELISA 및 유세포 분석법을 사용하여 IL-17A 발현을 평가할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 C57BL/6 마우스에서 CD4 T 림프구가 Th17 세포로 분화되는 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이 방법은 다른 마우스 모델에도 적용할 수 있습니다. 림프절은 크기가 매우 작아 박리 단계가 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시연이 매우 중요합니다. 직접적인 시각화 과정 없이, 세포를 추가하기 최소 4시간 전에 새로운 96-well UBO micro test 조직 배양 플레이트의 웰에 멸균 PBS로 희석한 anti CD3 30 µL를 코팅하십시오. 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 웰 전체에 균일하게 도포되었는지 확인한 후, 37 °C에서 배양하십시오. 4시간 후, 세포를 추가할 때까지 플레이트를 냉장 보관하십시오.경추 탈골을 통해 사망을 확인한 후, 성체 C 57 black six 마우스의 절개 부위를 70% ethanol로 소독합니다. 그런 다음 요도구 앞쪽의 피부를 잡고 복측 중앙선에서 턱 부위까지 절개하되, 복막이 손상되지 않도록 주의합니다. 다음으로 림프절과 비장을 제거할 수 있도록 피부를 핀으로 고정합니다.이제 흉근 뒤쪽의 마우스 겨드랑이 근처에서 액와 림프절을 제거하여 5 mL의 AutoMax running buffer가 담긴 페트리 접시에 조직을 넣습니다. 그다음 각 겨드랑이 근처의 결합 조직에 위치한 상완 림프절을 제거합니다. 이어서 동물의 목 부위에서 기관 양옆에 있는 표在 경부 림프절을 제거하고, 마지막으로 세 혈관이 만나는 고관절 부위의 서혜 림프절을 제거합니다.장간막 림프절에 접근하려면 먼저 복막층을 통해 복부 정중선을 따라 절개하십시오. 장간막 림프절은 마우스 장간막 깊숙한 곳에 위치하며, 일반적으로 진주 목걸이 모양의 4~8개 노드가 줄지어 나타납니다. 비장을 잡아당겨 췌장에서 분리하여 제거하십시오.그 후, 림프절이 담긴 페트리 접시에 넣고 기관을 분쇄합니다. 림프절을 현미경 슬라이드의 프로스트(frosted) 면에 놓고, 다른 슬라이드의 프로스트 면으로 조직을 문지릅니다. 분쇄된 기관을 단일 세포 현탁액으로 여과하기 위해, 먼저 약 3인치 x 3인치 크기의 40 micron 나일론 소재를 여러 번 접어 15 milliliter 원심분리 튜브 상단에 배치합니다.21 gauge 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 사용하여 세포와 버퍼를 흡입한 후, 접힌 나일론망에 세포 용액을 천천히 분주합니다. 이때 바늘로 재료를 찌르지 않도록 주의하십시오. 단일 세포 현탁액이 형성되면, 가시적인 고체 조직 조각 없이 용액이 균일하게 보여야 합니다.이 용액을 얼음 위에 둡니다. AutoMax 분리를 통해 CD4 양성 CD25 음성 세포 순도가 최소 80%가 되도록 세포를 분류합니다. 트립판 블루 배제법으로 세포 수를 측정한 후, 세포 배양 배지를 사용하여 세포 현탁액을 1 × 10⁶ cells/mL로 희석합니다.이제 anti CD3 코팅 플레이트의 모든 웰을 200 µL의 PBS로 헹굽니다. 각 세척액은 폐기물 용기에 버립니다. 그 후, TH17 유도 칵테일 또는 활성화 대조군 혼합액 100 µL를 해당 웰에 3반복으로 첨가합니다.마지막으로, 각 웰에 100 µL의 세포를 넣고 최소 72시간에서 최대 5일 동안 배양하여 ELISA 및 qPCR 분석을 위한 Th17 세포 분화를 유도합니다. 배양 기간이 지난 후, 각 샘플의 3반복 실험군을 각각의 에펜도르프 튜브에 모읍니다. 세포를 원심 분리한 후, 상층액을 별도의 에펜도르프 튜브로 옮겨 -20 °C에서 보관하여 추후 ELISA로 IL-17A 생성을 측정합니다.A. 상층액을 제거한 후 qPCR을 준비하기 위해, 남은 펠렛을 175 µL의 RNA lysis buffer에 재현탁하여 즉시 RNA를 추출하거나, 배양 기간 이후 실험을 시작할 때까지 -80 °C에 보관하십시오. IL-17 세포 내 염색 전 세포 활성화를 준비하기 위해, TH17 유도군 또는 활성 대조군 세포 삼중 반복군 각각을 24-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 풀링하여 분주하십시오. 각 웰에 400 µL의 세포 배양 배지를 추가하십시오.총 부피를 1 mL로 맞춘 다음, 각 웰에 PMA, ionomycin 및 felden A를 첨가하고 37 °C에서 4시간 동안 세포를 배양하여 세포 내 염색 및 유세포 분석으로 IL 17 A의 존재를 검출합니다. 먼저, 24웰 플레이트의 각 웰에서 세포를 개별 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리합니다.상층액을 제거하고 세포 펠렛을 200 µL의 fax buffer에 다시 부유시킵니다. 부유된 세포를 96-웰 유세포 분석 플레이트로 옮기고, 200 µL의 fax buffer로 펠렛을 세척한 후 다시 원심 분리합니다. 세포를 100 µL의 fax buffer에 부유시키고 100 µL의 세포외 항체 염색 혼합물을 첨가합니다. 빛이 차단된 실온에서 15분 동안 배양합니다.세포를 두 번 세척한 후, 알루미늄 호일로 감싼 100 µL의 BD cyto. Fix cyto perm buffer에 펠렛을 넣고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 이제 100 µL의 1X BD perm wash buffer로 세포를 두 번 세척한 다음, 알루미늄 호일로 감싼 50 µL의 세포 내 항체 혼합액(intracellular antibody mixture)에 세포를 넣고 상온에서 15분 동안 배양합니다.세포를 다시 세척한 후 200 µL의 BD 염색 완충액에 재현탁하고, 200 µL의 염색 완충액이 들어 있는 유세포 분석 튜브로 세포를 옮깁니다. 샘플의 유세포 분석 준비가 될 때까지 튜브를 4 °C에서 보관하십시오. 분석 시 먼저 생존 세포군을 게이팅합니다. 그다음, 생존 세포군을 사용하여 CD4 양성 CD8 음성 세포군을 게이팅합니다.마지막으로 CD4 양성 CD8 음성 집단에서 IL-17A 양성 집단을 게이팅하여 TH17 세포를 분리하기 위해, 분획되지 않은 풀링된 림프절 및 비장 세포에서 CD4 양성 CD25 음성 T세포 집단을 농축해야 합니다. 이 그림에서는 항-CD4 및 항-CD25로 염색된 분획되지 않은 풀링된 림프절 세포, 비장 세포 및 AutoMax로 분리된 T 세포 분획이 표시되어 있습니다. 이 첫 번째 산점도는 분획되지 않은 풀링된 림프절 및 비장 세포에 존재하는 CD4 양성 CD25 양성 및 CD4 양성 CD25 음성 림프구의 백분율에 대한 대표적인 프로파일을 보여줍니다.이 분리 절차는 또한 추가 실험에 사용할 수 있는 농축된 CD4 양성 CD25 양성 Treg 집단을 제공합니다. 이 마지막 산점도에서는 CD4 양성 CD25 음성 T 세포가 84%인 원하는 세포 농축 결과가 나타나 있습니다. 이 그림에서 설명하는 바와 같이, 이렇게 농축된 CD4 양성 CD25 음성 T 세포 집단은 TH17 분화를 더욱 성공적으로 수행하는 데 도움이 됩니다.CD4 양성 CD25 음성 T 림프구를 anti-CD3 및 anti-CD28과 함께 5일 동안 배양하면 CD25 양성 T 림프구가 생성되는 반면, Th17 유도 조건에서 배양하면 IL-17을 생성하는 CD4 양성 CD25 양성 림프구의 하위 집합이 생성됩니다. Th17 분화 상태는 quantitative PCR 및 ELISA를 통해 추가로 평가할 수 있습니다. 여기서는 대조군 또는 Th17 유도 조건에서 배양된 농축된 CD4 양성 CD25 음성 T 림프구의 데이터가 제시되어 있습니다. Th17 조건에서 배양된 CD4 양성 CD25 음성 T 림프구는 IL-17A의 발현을 상향 조절하며, 이는 qPCR 및 ELISA를 통해 확인할 수 있습니다. Th17 특이적 전사 인자인 RORγt 또한 Th17 유도 조건에서 배양된 CD4 양성 CD25 음성 T 세포에 의해 상향 조절되며, 이는 qPCR로 측정 가능합니다.이 절차를 수행할 때, 세포를 TH 17 유도 조건에서 배양하기 전에 최소 80%의 CD 4 양성 및 CD 25 음성 세포 순도를 확보하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 C 57 black six 마우스에서 림프절과 비장을 적출하는 방법, T 8 17 또는 활성화 대조군 조건에서 세포를 배양하는 방법, 그리고 나이브 CD 4 T 림프구가 T 8 17 세포로 분화되는 것을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을...

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

여기에서는 말초 Vδ1+CD4+ T 세포의 희소한 T 세포 개체, 즉 최근에 보여준 바와 같이 흉선 외 αβ T 세포 전구 세포의 분리 및 복제를 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 체외 배양에서 이러한 세포를 정량적으로 분리, 복제 및 효율적으로 확장할 수 있습니다.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여...

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

학습하세요 C57BL/6 마우스의 CD4+ CD25- T 세포를 분리하여 Th17 세포로 분화시키는 방법을. Q-PCR, ELISA, 유세포분석으로 IL-17A 발현을 평가하여 자가면역 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

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