Name: 마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: 배우세요 마우스 생식기 림프구 분리법을 효율적으로 익히세요. 효소 소화와 Percoll 그래디언트를 활용한 이 기술은 면역학 연구와 생식 질환 치료에 활용됩니다.

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우리는 기금 보조금 R01-AI026328 (KAK) 및 R01-AI079004 (KAK)에 대한 NIH에 감사드립니다.

1. 성기 기관의 제거 <ol><li> 승인 된 지침을 사용하여 마우스를 안락사시켜야. 낮은 중간 선을 절개하고 피부를 철회. </li><li> 수란관에서 질구까지 전체 성기 기관을 분리하고 제거합니다. </li><li> 가위로 길이 방향 전체 기관을 엽니 다. </li><li> 전체 RPMI-10/EDTA있는 배양 접시에서 훌륭한 조각 (&lt;1mm 정도) (아래의 공식을 참조)로 미세 수술 가위로 성기 기관을 잘라로 설정 자석 교반기에 실온에서 125 ML 플라스크에 조직을 저어 15 분. 이 절차는 두 번 반복되는 다음 상피와 다른 파편을 포함하는 표면에 뜨는는, 삭제됩니다. </li><li> 셀 스트레이너 (40μm)를 통해 플라스크의 내용을 넣어. 전체 매체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 잔류 물을 씻어. 열 inactivated RPMI 500 ML (Gibco), 10 % 태아 소 혈청 (FBS),, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 100 HEPES : 전체 RPMI/10. 전체 RPMI-10/EDTA : 5μM E와 10% RPMI (위 등)DTA </li></ol> 2. 성기 요로 조직을 소화 <ol><li> 20 ML 신선한 RPMI-10/collagenase로 새 플라스크 (아래의 제조법 참조) 조직 조각을 전송하고 적극적으로 조직을 저어하도록 설정 자석 교반기에 1 시간에 37 ° C에서 조직을 소화. 전체 RPMI-10/collagenase : 마우스 오른쪽 사용하기 전에, reconstitute collagenase를 입력 VIII이 (시그마, -20에 저장 ° C 또는 제조업체의 지시에 따라.), 450-500U/ml의 최종 농도에 완벽한 RPMI/10에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 첫 번째 소화 한 후, 100 μm 셀 스트레이너를 통해 supernatants를 수집 얼음에 세포를 유지. </li><li> 새로운 플라스크에 소화되지 않은 조직을 전송, 3 별도의 digestions의 총 신선한 완전한 RPMI-10/collagenase를 사용하여 단계 2.1 두 번 반복합니다. 이 시점에서 눈에 띄는 조직 조각이 솔루션에 할 수 없습니다. </li><li> 수영장 모든 샘플에서 함께 supernatants 100 μm 셀 스트레이너를 통해 수집합니다. C를 스핀아래 ells. 세포 펠릿은 Percoll의 그라디언트를 사용하여 구분됩니다. </li></ol> 3. Percoll 그라디언트를 사용하여 성기 요로 세포를 분리 <ol><li> 사용하기 전에 Percoll의 각 농도 준비 : <ul><li> 백퍼센트 등장 Percoll : 혼합 9시 1분 주식 Percoll (Pharmacia Biotch) 대 10 배 PBS. HCL을 사용하여 7.4으로 산도를. </li><li> 40 % Percoll 솔루션 : 혼합 백퍼센트 등장 Percoll과 완벽한 RPMI 60 ML 40 ML. </li><li> 70 % Percoll 솔루션 : 전체 RPMI의 30 ML과 혼합 백퍼센트 등장 Percoll의 70 ML. </li></ul></li><li> 40 % Percoll 솔루션의 6 단계에서 각 셀 펠렛을 Resuspend. 70 % Percoll의 동일한 볼륨은 그라디언트를 만들기 위해 사용됩니다. 그라데이션 튜브를 설정하는 방법은 두 가지가 있습니다 : <ol><li> 아래 층 : 그럼 조심스럽게 이하 계층 70 %의 Percoll 먼저 그라디언트 관에 40 % Percoll과 세포 현탁액을 추가합니다. </li><li> 이상 층 : 첫 번째 관에 70 % Percoll을 추가 한 다음 조심스럽게 천천히의 세포를 포함하는 40 % Percoll을로드맨. </li></ol></li><li> 그라디언트 샘플은 브레이크를 해제로 20 분을 위해, @ 900 XG, 방 온도를 centrifuged 될 것입니다. </li><li> 림프구는 40 %와 70 % Percoll 레이어 사이의 인터페이스 계층에있을 것입니다. 조심스럽게, 인터페이스 레이어를 수확 RPMI 1시 3분로 씻고 740 XG에서 스핀 다운. 림프구는 세포 펠렛에 추가로 사용할 준비가됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 마우스 성기 요로 및 유동 세포 계측법 (FACS) 분석에서 림프구의 분리의 예는 그림 1에 표시됩니다. 성기 요로 7 일 감염 후 intravaginally 감염 마우스 클라미디아 muridarum에서 제거되었습니다. 두 성기 책자는 FACS에 의해 기능 및 표현형 검사에 충분한 림프구를 위해 함께 풀링되었습니다. 해부 조직은 위에서 설명한대로 소화 및 절연 단계에서 처리되었다. 하나의 세포 현탁액은 다양한 fluorochrome - 복합에 얼룩이되었습니다마우스에는 3 번 CD, CD4 및 CD8에 대한 단클론 항체. 그림 1은 3 번 CD 긍정적 인 T 림프구의 출입을 금지 CD8 양성 T 세포 대 CD4 양성 T 세포의 점 플롯 프리젠 테이션을 보여줍니다. 우리 절차는 마우스 모델에서 다른 질병에 다양한 면역 세포 기능과 phenotypic 특성을 평가하기 위해 다른 질병 모델 성기 책자로부터 격리 림프구을 검사 할 수 있습니다. 이는 수지상 세포, 호중구, 대 식세포 NK, NKT, T 세포 (자세 별 T 세포), B 세포 등 3-10 등 다양한 면역 세포 등이 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> 그림 1. 림프구는 여기에 제시된 방법을 사용하여 클라미디아 muridarum에 감염된 생쥐의 성기 책자에서 고립되었다. 전체 분리 절차 후, 림프구는 fluorochrome - 복합 3 번 CD, CD4와 CD8 물들했다. 분면 데이터는 3 번 CD +의 림프구에 대한 출입을 금지했다CD4를 보여주는 + 대 CD8 +와와 출입을 금지 세포의 비율입니다.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
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<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜에서, 마우스 성기 책자에서 림프구를 준비하는 방법에 표시되며 쉽게 마스터 수 있습니다. 이 과정의 가장 중요한 포인트는 얼음에 세포를 유지하여 세포 생존 능력을 유지하는 것입니다. 이 방법에서 세포 수율은 기술, 마우스의 전염성 상태 (나이브 또는 감염 후 일), 병원체 (세균, 바이러스, 곰팡이)와 손쥐 생식 기관 심사의 절 (수란관, 자궁, 처리, 기술에 따라 달라집니다 질 세그먼트 또는 전체 성기 기관). 우리 그룹과 다른는 5-7 마우스 성기 요로 다른 림프구 인구의 다양한 연구를 발표했습니다. 손에 한 순진한 BALB / C 마우스에서 전체 성기 요로 2를 생성 할 수 있습니다 × 10 6 세포를 90 % 생존과. 많은 경우에서, 림프구는 더 기능적 및 / 또는 흐름 cytometric 분석 3-10에 사용됩니다. 우리의 방법, CE에 의해 일반적으로 사용되는 절연 방법 11에 비해붙인다 수율은 10 배 증가합니다. 이 절차는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 생명 과학 </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE 헬스 케어 바이오 과학 </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> 생명 기술의 Gibco </td><td> 11,875 </td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

, 위장병 비뇨 생식 및 호흡기 책자에서, 바이러스 및 박테리아 1로 병원균에 대한 항목의 포털을 제공 등의 점막 표면. Mucosae는 창자에있는 Peyers 패치와 호흡기의 코 - 관련 lymphoreticular 조직 등의 병원균에 대한 면역을 생성하는 것도 호스트의 유도 사이트입니다. 이 독특한 기능은 호스트 방어 시스템의 중요한 플레이어로 점막 면역을 제공합니다. 많은 연구 위장병과 호흡기 점막 사이트에 초점을 맞추고있다. 그러나, 생식 점막 사이트의 약간의 조사가되었습니다. 성기 요로 점막은 세균과 바이러스 감염 등의 성병 (STD)의 기본 감염 사이트입니다. 성병은 오늘날 세계적가 직면하고있는 가장 중요한 건강 문제 중 하나입니다. 질병 통제 예방 센터는 미국 19 명의 새로운 전염성 매년있는 것으로 추정하고 있습니다. STDS 매년 2 미국 의료 시스템에서 1백70억달러 비용, 그리고 즉각적이고 평생 건강 결과에 비용 개인보다. 이 문제를 직면하기 위해, 생식 점막 면역의 큰 이해가 필요하고 림프구를 분리하면 이러한 연구의 필수 구성 요소입니다. 여기, 우리는 reproducibly 다른 종에 대한 적응을 위해 수정할 수 있습니다 면역 연구 손쥐 여성 성기 책자에서 림프구를 분리하는 방법을 제시한다. 아래에서 설명하는 방법은 한 마우스에 기반을두고 있습니다.

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수 있습니다

위장관, 비뇨생식기 및 호흡기를 포함한 점막 표면은 바이러스와 같은 병원체의 진입 경로를 제공하며...

이 절차의 전반적인 목적은 마우스 생식관에서 림프구를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생식관 전체를 제거하고 조직을 작게 다져 조직으로부터 림프구를 유리시킵니다. 잘게 다진 조직을 collagenase eight로 소화시키고 37 °C에서 조직을 강하게 교반합니다.자기 교반을 통해 림프구를 Percoll 밀도 구배 원심분리로 분리합니다. 최종적으로 림프구는 유세포 분석법을 통해 특성을 분석할 수 있습니다. 이 기술의 응용 분야는 생식 질환의 진단 및 치료까지 확장되었습니다. 본 방법은 혈액 순환계에서 분리된 림프구와는 대개 다른 조직 림프구의 거동을 이해할 수 있게 해줍니다.이 방법은 생식기 점막 시스템에 대한 통찰을 제공하지만, 장 및 호흡기 점막 시스템과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 암컷 마우스를 안락사시킨 후, 수술용 가위를 사용하여 하복부 정중앙 절개를 수행하고 피부를 엽니다. 장을 조심스럽게 옆으로 밀어 ucs를 확인한 다음, ucs부터 질 입구까지의 전체 생식관을 분리하여 제거합니다.생식관을 페트리 접시에 놓습니다. 가위를 사용하여 생식관 전체를 세로 방향으로 절개합니다. 그런 다음 해당 조직을 완전 RPMI 10 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.이제 생식관을 잘게 절단한 후, complete RPMI 10 및 EDTA가 포함된 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 자석 교반기 위에 놓고 상온에서 15분씩 2회 조직을 교반합니다. 마지막 교반 단계 후 상층액을 제거하여 상피 세포를 없앤 다음, 조직 조각들을 40 µm 세포 여과기(cell strainer)를 통해 50 mL 원추형 튜브에 붓습니다. complete media로 EDTA 잔류물을 세척합니다.이제 여과된 조직 조각들을 새로운 플라스크에 옮기고 신선한 RPMI 10과 collagenase를 첨가한 후, 37 °C에서 마그네틱 스터러를 사용하여 조직을 격렬하게 교반하며 분해합니다. 1시간 후, 상층액을 100 µm 세포 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 원추형 튜브에 붓고, 여과된 세포 현탁액을 얼음에 보관합니다. 원래의 플라스크에 collagenase가 포함된 신선한 RPMI 10을 추가하고, 매번 신선한 완전 RPMI 10과 collagenase를 사용하여 조직을 두 번 더 교반합니다. 세 번째 분해 후에는 용액 내에 눈에 보이는 조직 조각이 없어야 합니다.이제 세 번의 소화 과정에서 얻은 상층액을 하나로 모읍니다

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이 비디오에서는 수확된 마우스 Peyer's patch에서 림프구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 림프구는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

배우세요 마우스 생식기 림프구 분리법을 효율적으로 익히세요. 효소 소화와 Percoll 그래디언트를 활용한 이 기술은 면역학 연구와 생식 질환 치료에 활용됩니다.

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

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