마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수 있습니다

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 생식관에서 림프구를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 전체 생식기를 제거하고 조직을 작은 조각으로 다져 조직에서 림프구를 분리함으로써 이루어집니다. 미세하게 다진 조직은 콜라겐 분해 효소 8과 섭씨 37도에서 조직을 격렬하게 교반하여 소화됩니다.

자기 교반을 통해 림프구는 호출 당 구배에 의해 격리됩니다. 궁극적으로, 림프구는 유세포 분석에 의해 특성화될 수 있으며, 이 기술의 함의는 생식 질환의 진단 및 치료로 확장되었습니다. 이 방법을 통해 조직 림프구의 거동을 이해할 수 있기 때문에 순환계에서 분리된 림프구와 다른 경우가 많습니다.

이 방법은 생식 점막 시스템에 대한 통찰력을 제공하지만 장 및 호흡기 점막 시스템과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 암컷 쥐를 안락사시킨 후 수술용 가위를 사용하여 낮은 정중선 절개를 한 다음 피부를 엽니다. 장을 부드럽게 옆으로 옮기고 ucs를 확인한 다음 ucs에서 질 개방까지 전체 생식기를 분리하고 제거합니다.

생식기를 페트리 접시에 넣는다. 가위를 사용하여 전체 관을 세로로 엽니다. 그런 다음 조직을 완전한 RPMI 10 배지가 있는 페트리 접시로 옮깁니다.

이제 생식기를 미세한 조각으로 자른 다음 그 조각을 완전한 RPMI 10 및 EDTA가 들어 있는 플라스크에 옮깁니다. 플라스크를 자기 교반에 놓고 조직을 실온에서 15분 동안 두 번 저어주어 마지막 교반 기간 후에 상피 세포를 제거하고 상등액을 버린 다음 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 조직 조각을 50ml 원추형 튜브에 붓습니다. 완전한 매체로 EDTA 잔류물을 씻어냅니다.

이제 여과된 조직 조각을 새로운 RPMI 10 및 콜라겐 분해 효소가 있는 새 플라스크로 옮기고 섭씨 37도에서 조각을 소화하여 한 시간 후에 조직을 격렬하게 저어주는 자기 교반 세트에서 조각을 소화하고, 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 상등액을 새로운 50ml 원뿔형 튜브에 붓고 여과된 세포 현탁액을 얼음 위에 유지합니다. 콜라겐 분해 효소가 포함된 새로운 RPMI 10을 원래 플라스크에 넣고 매번 새로운 완전 RPMI 10과 콜라겐 분해 효소를 사용하여 조직을 두 번 더 저어줍니다. 세 번째 분해 후에는 용액에 눈에 보이는 조직 조각이 없어야 합니다.

이제 세 가지 소화액의 상등액을 함께 모으십시오. 410Gs와 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 회전시킨 다음 상등액을 버립니다. 세포 펠릿을 새로운 40%per call 용액에 현탁시키는 것으로 시작합니다.

40%per call를 가진 세포 현탁액을 기온변화도 관으로 추가하고, 그 후에 조심스럽게 밑받침 그리고 갓 준비된 동일한 양을 추가하십시오. 70%당 외침. 이제 분리된 상태로 실온에서 20분 동안 그래디언트 샘플을 원심분리합니다.

원심분리 후 perol gradients 사이의 계면층에서 림프구를 조심스럽게 수확합니다. 그런 다음 회수된 세포를 RPMI 1-3으로 실온에서 10분 동안 세척합니다. 마지막으로, sup natant를 폐기한 후, 원하는 실험 절차에 따라 적절한 용액에 림프구를 다시 현탁시킵니다.

이 점도표는 질내 감염된 클라미디아 요관 마우스의 생식기에서 분리된 림프구 집단의 예입니다. 감염 7일 후, 단세포 현탁액을 CD 3개의 양성 림프구에 게이팅하고, 발달 후 CD 4 및 CD 8 발현 세포를 분석했습니다. 이 기술은 연구자가 인간 질병을 모방한 바이러스 마우스 질병 모델의 생식 림프구 기능과 세포 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.