Name: Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-15T20:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: 학습하세요 비인간 영장류 폐의 전 장기 탈세포화 및 생물반응기를 이용한 재세포화 방법을 통해 폐 조직 공학을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 재생의학 분야에서 환자 맞춤형 폐 이식을 위한 새로운 가능성을 제시합니다.

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저자는 이 보고서에서 이전 출판물의 이미지를 사용할 수 있도록 허락해 준 Tissue Engineering의 편집자들에게 감사의 뜻을 전합니다.

1. 전체 장기 원숭이 폐 탈세포화
<ol>
	<li>용액 준비
	<ol>
		<li>10-15L의 탈이온수(dH2O)를 1-2L 병에 오토클레이브합니다.</li>
		<li>자석 교반기에서 교반하면서 1ml의 트리톤 X-100을 999ml의 dH2O에 혼합하여 "트리톤 용액"(0.1% 트리톤 X-100 in dH2O)을 준비합니다. 0.22μm 필터 장치를 통해 용액을 여과합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>교반하면서 ~900ml dH2O에 20g의 디옥시콜레이트(SDC)를 천천히 첨가하여 "SDC 용액"(dH2O의 2% SDC)을 준비합니다. SDC가 용해되면 용액을 눈금이 매겨진 실린더로 옮기고 dH2O를 사용하여 부피를 1ml로 가져옵니다. 0.22μm 필터 장치를 통해 용액을 여과합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>~ 900ml의 dH2O에 58g의 NaCl을 첨가하여 "NaCl 용액"을 준비하고 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다. 최종 부피 1L에 dH2O를 추가하고 여과한 다음 실온에서 보관합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>장기 준비
	<ol>
		원숭이 <li>조직으로 작업할 때 감염 노출 사고를 방지하기 위해 최대한의 주의를 기울여야 합니다. 비인간 영장류 조직을 다루기 전에 수술용 마스크, 안면 보호대, 수술용 장갑, 일회용 가운 및 두 번째 수술용 장갑과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.</li>
		<li>외부 혈액의 응고를 방지하기 위해 50U/ml 헤파린을 함유한 PBS에서 동물 부검에서 온전한 심장-폐 블록을 수집합니다.</li>
		<li>폐를 해부 트레이에 평평하게 놓은 상태에서 적절한 크기의 미늘이 있는 암컷 Luer 커넥터를 사용하여 폐동맥을 캐뉼레이션합니다. 알코올 살균 지퍼 타이로 캐뉼라를 제자리에 고정합니다.</li>
		<li>멸균 지퍼 타이를 기관 주위에 끼우고, 0.250인치 암 Luer 커넥터를 기관 개구부에 삽입하고, 커넥터의 미늘 주위에 지퍼 타이를 조여 미늘 주위의 기관을 제자리에 고정합니다.</li>
		<li>30U/ml 헤파린과 5μg/ml 니트로프루시드나트륨(SNP)이 함유된 PBS를 주입하여 폐에 갇힌 공기를 제거합니다. 용액이 자연 반동에 의해 배출되도록 하고 주입을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 점안 후, 기관 Luer 캐뉼라를 Luer 플러그로 덮어 용액을 폐에 고정합니다.</li>
		<li>심장의 정점을 잘라내고 내심실에 PBS-헤파린-SNP를 세척하여 잔여 혈액을 제거합니다. 관류 시 폐 회로의 배출을 용이하게 하기 위해 양쪽 심방을 절열합니다.</li>
		<li>심장-폐 블록을 dH2O에 담그고 60ml 주사기에 PBS-헤파린-SNP 용액을 채웁니다. 겸자를 사용하여 동맥 캐뉼라를 잠궈 모든 기포가 혈관 입구에서 빠져나오도록 합니다. 주사기를 부착하고 플런저를 조심스럽게 제거하고 액체가 혈관 구조로 흐르도록 합니다.</li>
		<li>기관 캐뉼러에서 플러그를 제거하고 기도의 액체가 자연스러운 반동에 의해 배출되도록 합니다. 동맥 위로 ~15-20cm H2O 압력을 유지하기 위해 혈관 캐뉼라에 연결된 주사기에 PBS-heparin-SNP 용액을 계속 추가합니다. 폐 혈관 조직에서 가능한 한 많은 혈액이 제거될 때까지 관류를 계속하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>탈세포화(Decellularization)
	<ol>
		<li>1일차: 심장-폐 블록을 dH2O에 담그고 침수된 기관과 동맥 캐뉼라에 각각 부착된 60ml 주사기를 사용하여 폐를 dH2O로 팽창시키고 관류합니다. 기도와 혈관 세척을 dH2O 4x 이상으로 반복하여 총 5회 헹굽니다.</li>
		<li>물에서 폐를 제거하고 블록을 Triton 용액에 담그십시오. 이전과 같이 Triton 용액으로 폐를 팽창시키고 관류시킵니다. 두 번째 점안을 반복하고 4°C에서 밤새 Triton 용액에 잠긴 장기를 배양합니다.</li>
		<li>2일차: 하룻밤 배양 후, 트리톤 용액에서 폐 블록을 제거하고 dH2O로 외부를 세척한 다음 블록을 신선한 dH2O에 담그십시오. 1.3.1 단계에서와 같이 dH2O 세척을 5번 반복합니다.</li>
		<li>dH2O에서 폐를 제거하고 SDC 용액에 담그십시오. 1.3.2단계와 동일한 방식으로 SDC 용액으로 팽창 및 관류합니다. SDC 용액에 4 ° C에서 밤새 담근 배양하십시오.</li>
		<li>3일차: 1.3.1과 같이 dH2O로 조직을 다시 씻습니다.</li>
		<li>dH2O에서 조직을 제거하고 NaCl 용액에 담그십시오. 1.3.2단계와 동일한 방식으로 NaCl 용액으로 팽창 및 관류합니다. 실온에서 1 시간 동안 NaCl 용액에 담근 상태에서 배양합니다.</li>
		<li>1.3.1 단계와 같이 dH2O로 NaCl 용액의 폐를 깨끗하게 씻습니다.</li>
		<li>새로운 "DNase 용액"(30 μg/ml DNase, 1.3 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl2 in dH2O)을 준비합니다.이 용액으로 폐를 목욕시키고 1.3.2 단계와 같이 기도와 혈관 구조에 주입합니다. DNase 용액에 폐를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>새로운 "PBS 용액"(PBS 1개 + 항생제/항진균제 5개)을 준비합니다. DNase 용액에서 폐를 제거하고 PBS 용액으로 외부를 세척합니다. 폐를 PBS 용액에 담그고 이 용액으로 1.3.1단계와 같이 5회 세척합니다.</li>
		<li>PBS 용액에 담긴 폐를 밀봉된 용기에 담아 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날(4일차)에 1.3.1단계와 같이 신선하고 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 폐를 5회 세척하고 PBS 용액에 넣어 4°C의 멸균 밀봉 용기에 넣어 사용할 때까지 보관합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 대형 장기 생물 반응기
<ol>
	<li>Assembly and Tissue Installation (조립 및 티슈 설치)
	<ol>
		<li>호흡 루프 및 혈관 루프 구조뿐만 아니라 기관 및 혈관 캐뉼라 어댑터를 미리 조립하십시오(그림 1). 멸균 포장된 공기 필터와 주사기 포트를 제외하고 모든 바이오리액터 구성 요소를 오토클레이브합니다.</li>
		<li>그림 2의 회로도에 따라 층류 후드 아래에 생물반응기 구성 요소를 조립합니다. 생물반응기에서 사용하기 직전에 세포 배양 인큐베이터의 5%CO2 분위기와 평형을 이룬 배양 배지로 메인 챔버를 채웁니다.</li>
		<li>기관 및 혈관 캐뉼라 어댑터를 폐 캐뉼라에 적용하고 폐를 배양 배지로 목욕시키고 캐뉼라 어댑터를 수정된 뚜껑의 적절한 포트에 부착하여 주 생물 반응기 챔버에 장기를 설치합니다. 연결되면 뚜껑을 단단히 단단히 고정하십시오. 재세포화가 진행되는 동안 챔버가 다시 열리지 않습니다.</li>
		<li>기관 저장소를 배양 배지로 약 절반 정도 채우고 수정된 캡을 부착합니다.</li>
		<li>멸균 0.22μm 주사기 필터, Luer 플러그 및 주사기 포트를 표시된 대로 모든 챔버에 적용합니다.</li>
		<li>호흡 루프 장치를 통해 기관 저장소를 메인 챔버에 연결합니다. 표시된 대로 호흡 루프 튜브를 부착합니다.</li>
		<li>주사기 포트와 18G 바늘이 장착된 60ml 주사기를 사용하여 튜브에서 공기를 흡입하고 3방향 스톱콕의 방향을 이동하여 액체가 주사기로 흐르도록 합니다.</li>
		<li>설치된 장기와 함께 밀봉되고 인접하게 연결된 생물반응기 챔버를 조직 배양 인큐베이터로 이동하여 온도와 가스를 평형화합니다. 메인 챔버에 부착된 주사기 펌프를 사용하여 2분마다 ~1회 완전한 "호흡"으로 폐를 환기시키고 연동 펌프를 통해 약 10ml/분으로 총 ~30분 동안 혈관 구조를 관류합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>기도 파종
	<ol>
		<li>원하는 세포 밀도로 기도에 파종할 세포의 현탁액을 준비합니다(부피는 장기 크기에 따라 다름).</li>
		<li>호흡 루프의 3방향 스톱콕에 부착된 주사기 포트를 통해 부드럽게 주입하여 세포 현탁액으로 폐를 팽창시킵니다.</li>
		<li>기도 또는 혈관 관류 없이 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 폐를 정적으로 유지하여 세포가 탈세포화된 폐 기질에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>하룻밤 배양 후 표준 기도 환기 프로그램을 다시 시작하고 3-7일(또는 기타 원하는 기간) 동안 장기를 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>혈관 파종(vascular seeding)
	<ol>
		<li>기도 세포 파종을 위해 위와 같이 내피 세포 배양의 현탁액을 준비합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 작은 자기 교반 막대가 포함된 내피 시딩 저장소로 이동합니다.</li>
		<li>이 두 구획을 연결하는 튜브에 위치한 스톱콕의 밸브를 회전시켜 메인 챔버에서 내피 시딩 저장소로 가는 유로의 방향을 변경하고, 연동 펌프를 사용하여 부드럽게 교반하면서 내피 세포를 서서히 시딩합니다.</li>
		<li>시딩이 완료되면(즉, 내피 세포 현탁액의 부피가 내피 시딩 저장소에서 고갈됨) 관류를 중지하고 ~4-6시간 동안 정적으로 배양합니다. ~10ml/분(또는 모니터링되는 경우 원하는 압력)의 속도로 메인 챔버 배지로 혈관 관류를 다시 시작합니다.</li>
		<li>지속적인 혈관 관류로 3-7일 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 문제 해결 및 대체 방법
<ol>
	<li>기관 캐뉼러: 기관이 너무 작은 경우 Luer 캐뉼라를 제자리에 고정하기 위해 지퍼 타이 대신 봉합사를 사용할 수 있습니다. 1/4 암컷 Luer 연결은 광범위한 기관 직경에 충분한 캐뉼라 역할을 합니다.</li>
	<li>폐동맥 관류를 통한 혈액 제거: 조직은 시체 동물에서 채취하기 때문에 미세혈전이 흔하며 폐 모세혈관 층의 일부 영역에서 잔여 혈액이 완전히 제거되는 것을 방해합니다. 그러나 탈세포화(decellularization) 과정에서 이러한 작은 혈관은 투과성이 되고 탈세포화 시약은 이러한 혈전을 효율적으로 용해하고 분해합니다. 가능한 한 많은 혈액을 제거하기 위해 탈세포화 전 관류를 수행해야 하지만 실질에서 혈액의 흔적을 모두 제거할 필요는 없습니다.</li>
	<li>폐에서 체액 배출: 원숭이 폐는 체액으로 부풀어 있을 때에도 생체 밖에서 강력한 자연 반동을 유지합니다. 그러나 탈세포화(decellularization) 과정에서 세포는 용해되고 주입된 액체의 점도를 증가시키는 물질(DNA 포함)을 방출하여 배출을 더 어렵게 만듭니다. 주입된 액체에 잠긴 상태에서 4°C에서 하룻밤 배양하면 일반적으로 폐가 점성 액체를 완전히 배출할 수 있습니다. 또는 가능한 한 많은 체액이 폐에서 배출되도록 한 다음 후속 용액을 주입하십시오. 세제와 탈이온수 세척제를 첨가하면 일반적으로 점성 액체의 제거를 용이하게 하고 탈세포화가 효율적으로 진행될 수 있습니다.</li>
	<li>세제 용액에 항생제 첨가: 항생제 및 항진균제는 세제 용액뿐만 아니라 탈이온수 세척 용액에 첨가될 수 있습니다. 그러나 페니실린/스트렙토마이신은 데옥시콜산나트륨의 존재 하에 침전되며 이러한 침전물은 탈세포화 및 세척 과정을 방해할 수 있습니다. 또한, 이러한 농도에서 사용되는 세제는 미생물을 용해시키고 죽일 수 있기 때문에 탈세포화 중에는 항생제/항진균제의 존재가 필요하지 않습니다. 탈세포화 후 PBS 용액(5x 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B 함유)으로 헹구고 보관하면 대부분의 오염을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>바이오리액터 튜빙에서 공기 제거: 3방향 스톱콕의 니들 포트에 바늘이 삽입된 주사기를 사용하여 바이오리액터 튜브에서 공기를 효율적으로 흡입합니다. 또는 동일한 방식으로 부착된 주사기를 사용하여 장기를 설치하기 전에 1x PBS 또는 배양 배지를 튜브를 통해 세척할 수 있습니다.</li>
	<li>재세포화 중 및 재세포화 후 폐의 환기 및 관류: 이 보고서에 나열된 유속과 시간은 세포 부착, 기도 액체 환기 및 혈관 관류에 충분했지만 이러한 값은 사용자가 경험적으로 결정해야 합니다. 주입된 세포의 성장 속도에 따라 배양 시간을 조정할 수도 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+function+of+bioartificial+lungs+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo function of bioartificial lungs in rats.</a> Ann. Thorac. Surg. 92, 998-1005 (2011).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Joag, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+models+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Primate models of AIDS.</a> Microbes Infect. 2, 223-229 (2000).</li>
<li>Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+models+for+AIDS+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug.+Targets+Infect.+Disord%22%5BJournal%5D)">Non-human primate models for AIDS vaccine research.</a> Curr. Drug. Targets Infect. Disord. 5, 193-201 (2005).</li>
<li>Borda, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunopathologic+alterations+in+rhesus+macaques+affected+with+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunopathologic alterations in rhesus macaques affected with globoid cell leukodystrophy.</a> Am. J. Pathol. 172, 98-111 (2008).</li>
<li>Fabbrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+response+to+high-carbohydrate+and+low-carbohydrate+meals+in+a+non-human+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic response to high-carbohydrate and low-carbohydrate meals in a non-human primate model.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. , (2012).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Lung+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Lung Engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Arold, S. P., Wong, J. Y., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+new+stretching+apparatus+and+the+effects+of+cyclic+strain+and+substratum+on+mouse+lung+epithelial-12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a new stretching apparatus and the effects of cyclic strain and substratum on mouse lung epithelial-12 cells.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1156-1164 (2007).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+embryonic+stem+cells+to+vascular+wall+cells+under+in+vitro+pulsatile+flow+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Differentiation from embryonic stem cells to vascular wall cells under in vitro pulsatile flow loading.</a> J. Artif. Organs. 8, 110-118 (2005).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells+from+the+bone+marrow+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.</a> Stem Cells Dev. 14, 440-451 (2005).</li>
<li>Craig, L. E., Nealen, M. L., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+replication+of+ovine+lentivirus+in+endothelial+cells+cultured+from+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Differential replication of ovine lentivirus in endothelial cells cultured from different tissues.</a> Virology. 238, 316-326 (1006).</li>
<li>Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+diverse+tissues+exhibit+differences+in+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology.</a> Microvasc. Res. 55, 65-76 (1998).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Organ+Tissue+Engineering%3A+Decellularization+and+Recellularization+of+Three-Dimensional+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. , (2010).</li>
</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

조직은 물리적, 화학적, 효소적 제제를 사용하는 여러 가지 방법에 의해 효율적이고 효과적으로 탈세포화될 수 있다12,20. 큰 장기에서 3D 생물학적 매트릭스를 생산하는 데 따른 과제에는 대량의 탈세포화 용액, 고가의 상용 장비(예: 바이오리액터), 최종 조직 유래 제품을 얻는 데 필요한 어지러운 양의 방법론적 교란이 포함됩니다. 우리의 방법은 물리적 조작, 시약 양 및 비용을 최소화하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 붉은털원숭이 폐의 완전한 탈세포화 및 불임에는 3일밖에 걸리지 않습니다. 또한, 당사의 탈세포화 조직은 오염이나 스캐폴드 분해 징후 없이 몇 주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 우리는 최근 탈세포화된 원숭이 폐 스캐폴드의 자세한 특성화를 보고했는데, 여기서 Triton X-100/Deoxycholic acid 방법(Price et al.4) 폐 기질에 미치는 영향을 최소화하면서 세포를 효율적으로 제거했습니다4,19.<...

조직과 장기의 생명 공학은 재생 의학 분야에 매력적인 추가 기능입니다. 병든 장기의 기능을 대체하기 위해 환자에게 이식하기에 적합한 "실험실에서 성장한" 장기를 만드는 것은 이식 요구에 대한 현재와 미래의 수요를 충족시키기 위해 매우 바람직합니다. 조직 공학의 원리는 원하는 세포 유형 또는 그 전구 세포를 파종하는 것을 중심으로 하며, 이는 발달 또는 재생 과정을 모방하는 데 필요한 적절한 성장 인자와 배양 조건을 제공하면서 공학적 조직의 모양을 지지하는 골격에 주입하는 것입니다. 합성 골격은 조직 공학에 사용되어 왔으며 자연 세포외 기질(ECM)은 이러한 목적을 위한 장기 특이적 골격의 가장 좋은 공급원일 수 있습니다. 전체 장기 탈세포화(whole-organ decellularization)는 네이티브 ECM의 화학적, 구조적 측면은 그대로 유지하면서 세포를 제거할 수 있는 과정입니다. 생성된 무세포 매트릭스 스캐폴드는 재생 세포를 파종하고 in vitro1,2를 배양할 수 있는 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
이 기술의 타당성을 연구하기 위해 폐 탈세포화 및 후속 재세포화에 대한 여러 설치류 모델이 개발되었습니다3-6. 설치류 모델은 필수적인 개념 증명을 제공하지만, 인간의 임상적 요구에 직접 적용할 수는 없습니다. 최근 연구에서는 외상성 손상(및 관련 염증)에 대한 게놈 반응이 생쥐와 인간 사이에 좋은 상관관계가 없다고 지적했습니다. 이러한 발견은 인간에서 이러한 복잡한 생화학적 과정에 대한 모델로 쥐를 사용하는 것의 타당성에 대한 의문을 제기합니다7. 비인간 영장류(NHP) 모델은 유전체학적, 해부학적, 생리학적 수준에서 인간의 생물학과 매우 유사하다는 장점을 제공하며, 인간이 사용하는 것에 대한 더 큰 외삽을 위해 보다 유연한 조작을 가능하게 합니다. 붉은털원숭이는 다양한 전임상 응용 분야에서 사용되어 왔으며 조직 공학8-11을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 우리는 최근에 폐 ECM12에 미치는 영향을 최소화하는 절차를 사용하여 붉은털 원숭이(Macacca mulatta) 폐의 성공적인 탈세포화에 대해 설명했습니다. 폐 탈세포화는 세제, 염 및 효소로 구성된 4개의 탈세포화 용액으로 조직을 연속적으로 처리하고 탈이온수(dH2O) 및 PBS를 참조하십시오. 우리는 Price et al.이 원래 설명한 프로토콜을 수정하여 이 절차를 최적화했습니다.4 다양한 조직학 및 단백질 분석 기술을 사용하여 천연 원숭이 폐와 관련된 결과 무세포 매트릭스의 구성 요소를 특성화했습니다.
이 보고서에서는 비인간 영장류 폐의 탈세포화와 Calle 등이 원래 입증한 대형 장기 생물반응기에서 생성된 무세포 폐 골격의 재세포화에 대한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 13 in JoVE. 대형 동물 폐에 대한 크기, 환기 및 관류 요구 사항을 수용하기 위해 원래 프로토콜을 수정함으로써 이 기술은 설치류 모델에서 붉은털 원숭이 모델로 성공적으로 이동했습니다. 이 보고서에 제시된 모든 연구는 툴레인 국립 영장류 연구 센터(Tulane National Primate Research Center)에서 시행 중인 기관 생물안전성 위원회(IBC) 정책에 따라 수행되었습니다. 프로토콜의 단계를 시각화하지 않고는 해부학적 구조를 식별하고 더 큰 장기를 물리적으로 조작하는 것이 때때로 어렵기 때문에 이 기술의 시연이 필수적입니다. 이러한 방법으로 가능해진 연구는 붉은털 중간엽 계통 줄기 세포 및 붉은털 미세혈관 내피 세포를 사용한 재세포화를 평가할 수 있는 탈세포화된 붉은털 원숭이 폐에 대한 필수적인 전임상 연구의 기초를 제공합니다. 이 생물반응기의 당사 버전은 발달 환경을 시뮬레이션하고 대형 동물 폐에 기계적 신장 및 변형의 힘을 가하고 폐 및 내피 발달을 촉진하는 것으로 알려진 조건에서 폐 재세포화를 조사할 수 있습니다13-15.

<table><tbody><tr><td>니트로 프루스 산</td><td>나트륨 시그마 - 알드리치</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>피셔</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>데옥시 콜산 나트륨</td><td>피셔</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장 DNase</td><td>시그마 알드리치</td><td>DN25</td><td>원료 준비, 분취 및 동결</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Fisher</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (no Ca/Mg)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">세포 배양 배지</td></tr><tr><td>알파 MEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>12561-072</td><td></td></tr><tr><td>매체 199</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 태아 소 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 100x</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보조제(ECGS)</td><td>ScienCell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">세포 파스팅 및 생물반응기 배양</td></tr><tr><td>체크 밸브</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-98553-20</td><td></td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td>ED-30614-08</td><td></td></tr><tr><td>3-Way stopcocks</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 14 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex L/S 16 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>수 잠금 Luer 1/8 in</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td></td></tr><tr><td>암 Luer 1/8 in</td><td>Cole-Parmer</td><td>SI-45502-04</td><td></td></tr><tr><td>수 Luer 잠금 플러그</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>주입 포트</td><td>Medi-Dose</td><td>EPS IV2004</td><td></td></tr><tr><td>라텍스 튜빙</td><td>세인트루이스 메디컬 서피</td><td>HN10910</td><td></td></tr><tr><td>호스 클램프</td><td>콜 파머</td><td>EW-06832-02</td><td></td></tr><tr><td>2L 입이 넓은 항아리</td><td>피셔</td><td>05-719-276</td><td></td></tr><tr><td>60ml</td><td>주사기 피셔</td><td>NC9035364</td><td></td></tr></tbody></table>

nonhuman primate lung decellularization and recellularization using a specialized large-organ bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

현재와 미래의 장기 이식 요구를 충족시킬 수 있는 폐의 수가 충분하지 않습니다. 생체 인공 조직 재생은 전통적인 장기 이식에 대한 매력적인 대안입니다. 이 기술은 장기의 자연적인 생물학적 세포외 기질(ECM)을 자가 세포 또는 줄기/전구 세포를 원래 조직의 재생을 촉진하는 방식으로 파종하고 배양할 수 있는 골격으로 활용합니다. 자연적인 ECM은 탈세포화(decellularization)라는 과정에 의해 격리됩니다. 탈세포화는 ECM을 온전하게 유지하면서 세포 물질을 효과적으로 제거하기 위해 일련의 세제, 염 및 효소로 조직을 처리함으로써 이루어집니다. 설치류 폐의 탈세포화(decellularization)와 그에 따른 재세포화(recellularization)를 활용하여 수행된 연구는 생체 내에서 가스 교환이 가능한 폐와 유사한 조직을 생성하는 데 미미한 성공을 거두는 것으로 나타났습니다. 설치류 모델은 필수적인 개념 증명을 제공하지만 인간이 사용할 수 있도록 직접 변환할 수는 없습니다. 비인간 영장류(NHP)는 최종 임상 사용을 위한 생체 인공 장기 생산의 사용을 조사하는 데 더 적합한 모델을 제공합니다.
NHP 붉은털 원숭이에서 얻은 폐의 완전한 탈세포화를 달성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 생성된 무세포 폐에는 중간엽 줄기 세포 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포가 파종될 수 있습니다. 원고는 또한 세포 파종된 원숭이 폐를 음압 환기와 혈관 구조를 통한 박동 관류에 의해 제공되는 기계적 신축성 및 변형 조건에서 배양할 수 있는 생물 반응기 시스템의 개발을 설명합니다. 이러한 힘은 각각 폐 및 내피 계통을 따라 분화를 지시하는 것으로 알려져 있습니다. 탈세포화(decellularization) 및 세포 시딩(cell seeding)의 대표적인 결과를 제공합니다.

아래에 제시된 결과는 앞서 기술한 바와 같이 분리 및 특성 분석이 완료된16-18 붉은털원숭이 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 붉은털원숭이 폐 유래 미세혈관 내피세포를 각각 기도 또는 혈관 구획에 파종하여 수행한 개별 실험들을 나타냅니다.
탈세포화 과정 전반에 걸쳐 마카크 원숭이의 폐는 점진적으로 하얗게 변하다가 과정 끝에는 투명한 외관을 보였으나, 폐의 육안적 해부학적 특징은 유지되었으며 액체 주입 후 팽창 시 자연스러운 반동을 일으킬 수 있을 만큼 대체로 탄력적인 상태를 유지하였습니다(그림 3A 및 3B). 미세 구조 수준에서는 탈세포화 후에도 조직학적 초미세구조가 온전하게 유지되었습니다. 즉, 저배율 현미경 관찰 시 세기관지, 호흡 세기관지, 폐포낭, 혈관 및 모세혈관을 여전히 매우 명확하게 구분할 수 있었습니다(그림 3C 및 3D)....

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

이 절차의 전반적인 목표는 Reus Maccas의 폐에서 전체 장기 생물학적 매트릭스를 분리하고 이러한 매트릭스를 폐 조직 공학 응용 분야를 조사하기 위한 골격으로 사용하는 것입니다. 이는 먼저 Reuss Maca 폐 전체를 세제, 소금 및 효소로 탈세포화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 탈세포화된 폐 골격을 기도를 환기시키고 폐 혈관 구조를 액체 세포 배양 배지로 관류할 수 있는 생물반응기에 설치하는 것입니다.다음으로, 폐 골격은 기도를 통해 줄기세포와 함께 앉고 폐 혈관 구조를 통해 내피 세포와 함께 안착합니다. 마지막 단계는 원하는 시간 동안 생물반응기가 제공하는 환기 및 관류 조건에서 폐 골격 내의 세포를 배양한 다음 결과 세포 및 조직 형태를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 줄기세포와 내피 세포를 가진 무세포 마카 폐 골격을 재화하면 천연 폐 조직의 해부학적, 조직학적 특징을 모방하는 공학적 조직이 생성됩니다.이 방법은 줄기 세포 또는 전구 세포를 사용하여 단독으로 또는 성숙한 폐 상피 및 내피 세포와 함께 폐 조직을 재생하는 데 사용할 수 있는지 여부와 같은 폐 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 말기 폐 질환 치료로 확장되는데, 이는 환자 유래 줄기 세포 또는 전구 세포를 가진 무세포 폐 매트릭스의 화는 폐 이식에 사용할 수 있는 기증자 폐의 수를 증가시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문입니다. 더욱이, 환자 자신의 줄기세포를 사용하여 조작된 폐는 면역 거부 반응에 저항력이 있을 수 있습니다.우리는 예일 대학의 로라 니콜슨(Laura Nicholson) 박사 연구실 구성원이 이전에 발표한 Joe 비디오를 보았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 여기에서 우리는 대형 동물 Resus Meac 모델의 요구에 맞게 설치류에 대한 절차의 수정 사항을 제시합니다. 마카 조직으로 작업할 때 감염 노출 사고를 방지하기 위해 최대한의 주의를 기울여야 합니다.인간이 아닌 영장류 조직을 다루기 전에 수술용 마스크, 안면 보호대, 수술용 장갑 한 겹, 일회용 가운, 폐가 해부 트레이에 평평하게 놓인 두 번째 수술용 장갑을 포함한 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 크기의 미늘이 있는 암컷 루어 커넥터를 사용하여 폐동맥을 캐뉼레이션합니다. 알코올 살균 지퍼 타이로 캐뉼러를 제자리에 고정합니다. 기관 주위에 플라스틱 지퍼 타이를 끼웁니다.암 루어 커넥터

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 decellularized의 폐를 세포외 기질 및 기능 폐 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 소설 biomimetic 생물 반응기를 개발했습니다. 생물 반응기에서 매트릭스와 culturing에 세포를 시딩함으로써, 우리는 시간의 짧은 기간에 대한 생체내에 이식하면 효과 가스 교환을 보여주는 조직을 생성합니다.

룽 공학을위한 절차

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

탈세포화된 쥐 간의 재세포화된 세포외 기질은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구하기 위해 인간화된 3차원 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다.

인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

여기, 선물이 비보 전 폐 암 모델을 모방한 종양 진행의 단계 및 기본 종양을 격리 하는 데 도움이 프로토콜 순환 종양 세포, 및 전이성 병 변.

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

이 프로토콜은 탈세포화된 정밀 절단된 폐 조각을 폐포 상피 유형 2 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로 재채움으로써 재현 가능한 소규모 조작된 폐 조직을 생성하는 방법을 설명합니다.

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

여기에 제시된 것은 국소 탈세포화된 폐 조직의 분리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포외 기질 및 세포-기질 상호 작용의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

학습하세요 비인간 영장류 폐의 전 장기 탈세포화 및 생물반응기를 이용한 재세포화 방법을 통해 폐 조직 공학을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 재생의학 분야에서 환자 맞춤형 폐 이식을 위한 새로운 가능성을 제시합니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화) (동영상) | JoVE Journal

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

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