Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

이 절차의 전반적인 목표는 Reus Maccas의 폐에서 전체 장기 생물학적 매트릭스를 분리하고 이러한 매트릭스를 폐 조직 공학 응용 분야를 조사하기 위한 골격으로 사용하는 것입니다. 이는 먼저 Reuss Maca 폐 전체를 세제, 소금 및 효소로 탈세포화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 탈세포화된 폐 골격을 기도를 환기시키고 폐 혈관 구조를 액체 세포 배양 배지로 관류할 수 있는 생물반응기에 설치하는 것입니다.

다음으로, 폐 골격은 기도를 통해 줄기세포와 함께 앉고 폐 혈관 구조를 통해 내피 세포와 함께 안착합니다. 마지막 단계는 원하는 시간 동안 생물반응기가 제공하는 환기 및 관류 조건에서 폐 골격 내의 세포를 배양한 다음 결과 세포 및 조직 형태를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 줄기세포와 내피 세포를 가진 무세포 마카 폐 골격을 재화하면 천연 폐 조직의 해부학적, 조직학적 특징을 모방하는 공학적 조직이 생성됩니다.

이 방법은 줄기 세포 또는 전구 세포를 사용하여 단독으로 또는 성숙한 폐 상피 및 내피 세포와 함께 폐 조직을 재생하는 데 사용할 수 있는지 여부와 같은 폐 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 말기 폐 질환 치료로 확장되는데, 이는 환자 유래 줄기 세포 또는 전구 세포를 가진 무세포 폐 매트릭스의 화는 폐 이식에 사용할 수 있는 기증자 폐의 수를 증가시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문입니다. 더욱이, 환자 자신의 줄기세포를 사용하여 조작된 폐는 면역 거부 반응에 저항력이 있을 수 있습니다.

우리는 예일 대학의 로라 니콜슨(Laura Nicholson) 박사 연구실 구성원이 이전에 발표한 Joe 비디오를 보았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 여기에서 우리는 대형 동물 Resus Meac 모델의 요구에 맞게 설치류에 대한 절차의 수정 사항을 제시합니다. 마카 조직으로 작업할 때 감염 노출 사고를 방지하기 위해 최대한의 주의를 기울여야 합니다.

인간이 아닌 영장류 조직을 다루기 전에 수술용 마스크, 안면 보호대, 수술용 장갑 한 겹, 일회용 가운, 폐가 해부 트레이에 평평하게 놓인 두 번째 수술용 장갑을 포함한 개인 보호 장비를 착용하고 적절한 크기의 미늘이 있는 암컷 루어 커넥터를 사용하여 폐동맥을 캐뉼레이션합니다. 알코올 살균 지퍼 타이로 캐뉼러를 제자리에 고정합니다. 기관 주위에 플라스틱 지퍼 타이를 끼웁니다.

암 루어 커넥터를 기관 개구부에 삽입하고 커넥터의 미늘 주위에 있는 지퍼 타이를 조여 미늘 주위의 기관을 제자리에 고정합니다. 헤파린 밀리리터당 30단위와 니트로프레스 나트륨 밀리리터당 5마이크로그램을 함유한 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 주입하여 폐에서 갇힌 공기를 제거합니다. 약식 SNP를 사용하면 용액이 반복되기 전에 자연 반동에 의해 배출될 수 있습니다.

PBS Heparin SNP 솔루션으로 세 번째 기도 삽입 후 두 번 더 설치합니다. 기관 루어 캐뉼러를 루어 플러그로 덮습니다. 심장의 정점을 잘라내고 PBS 헤파린 SNP로 내부 심실을 세척하여 잔류 혈액을 제거하고 양쪽 심방을 열상시켜 관류 시 폐 회로의 배액을 용이하게 합니다.

PBS 헤파린 SNP 용액으로 채워진 60cc 주사기를 폐동맥 캐뉼라에 부착하고 액체가 혈관 구조로 흘러 들어갈 수 있도록 플런저를 조심스럽게 제거합니다. 기관 캐뉼러에서 플러그를 제거하고 기도의 액체가 자연스러운 반동에 의해 배출되도록 합니다. 폐 혈관 조직에서 가능한 한 많은 혈액이 제거될 때까지 관류를 계속하십시오.

절차의 가장 어려운 측면은 폐기도를 효과적으로 헹구고 세척하는 것입니다 액체의 경우 기도가 액체를 전도하기 위한 것이 아니기 때문에 기체에 비해 액체 흐름이 억제되며, 이러한 단계를 수행하는 데 시간과 환자가 필요하므로 탈세포화가 진행되고 세포 파편이 씻겨 나감에 따라 기도에 잔류 액체가 남아 있음에도 불구하고 프로토콜을 계속하는 것이 좋습니다. 유체 점도는 낮게 유지되고 폐는 첫날에 액체를 효율적으로 배출할 수 있습니다. 심장 폐 블록을 탈이온수에 담그고, 침수된 기관과 동맥 캐뉼라에 각각 부착된 60cc 주사기를 사용하여 폐를 탈이온수로 팽창시키고 관류합니다. 탈이온수로 기도와 혈관 세척을 효과적으로 반복합니다.

5회 세척 후 각각 약 0.5-1리터씩 총 5회 헹구기 위해 4회 더 물에서 폐를 제거하고 블록을 Triton 용액에 담그십시오. 트리톤 용액으로 폐를 팽창시키고 관류시킵니다. 이전과 마찬가지로 설치를 두 번 반복하고 섭씨 4도에서 밤새 트리톤 용액에 잠긴 장기를 배양합니다.

하룻밤 배양 후 Triton 용액에서 폐 차단을 제거하고 탈이온수로 외부를 씻습니다. 그런 다음 블록을 신선한 탈 이온수에 담그십시오. 탈이온수를 기관과 폐동맥에 5회 주입하여 트리톤 용액과 세포 파편을 씻어냅니다.

탈이온수에서 폐를 제거하고 2%나트륨 데옥시 코에이트 또는 SDC 용액에 담그십시오. 동일한 방식으로 SDC 용액으로 팽창 및 관류합니다. 3일째 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 SDC 용액에 폐를 담급니다.

탈이온수로 조직을 외부와 기도와 혈관 구조를 통해 다시 5회 씻습니다. 이전과 마찬가지로 탈이온수에서 조직을 제거하고 1몰 염화나트륨 용액에 담그십시오. 이전과 같이 염화나트륨 용액으로 팽창시키고 관류하고, 탈이온수 5번의 헹굼으로 염화나트륨 용액을 깨끗하게 세척한 후 실온에서 1시간 동안 조직을 염화나트륨 용액에 담그십시오.

이전과 마찬가지로 신선한 DNA 용액으로 목욕시키고 이 용액을 기도와 혈관 조직에 주입합니다. DNA 용액에 폐를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 DNA 용액에서 폐를 제거하고 PBS 용액으로 외부를 씻습니다.

PBS 용액에 폐를 담그고 이 용액을 기도와 혈관 구조를 통해 5회 세척합니다. 이전과 마찬가지로 PBS 용액에 담긴 폐를 밀폐된 용기에 담아 4일째 되는 날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관합니다. 기도와 혈관 구조를 통해 신선한 얼음처럼 차가운 PBS 용액으로 폐를 5회 씻습니다.

그런 다음 PBS 용액에 넣어 멸균 밀봉 용기에 담아 섭씨 4도에서 사용할 때까지 보관하십시오. 회로도에 따라 층류 후드 아래에 생물 반응기 구성 요소를 조립합니다. 텍스트 프로토콜에서 생물반응기에 사용하기 직전에 세포 배양 인큐베이터의 5%CO2 분위기와 평형을 이룬 배양 배지로 메인 챔버를 채우고 기관 및 혈관 캐뉼라 어댑터를 폐 캐뉼라에 적용합니다.

배양 배지에서 폐를 목욕시키고 캐뉼러 어댑터를 수정된 뚜껑의 적절한 포트에 부착하여 주 생물 반응기 챔버에 장기를 설치합니다. 연결되면 뚜껑을 단단히 단단히 고정합니다. 챔버는 주사기 포트와 18 게이지 바늘이 장착된 60 CCC 주사기를 사용하여 튜브에서 공기를 흡입하는 동안 다시 열리지 않으며, 3방향 스톱 콕의 방향을 움직여 액체의 흐름을 주사기로 유도합니다.

설치된 장기가 있는 밀봉된 연속적으로 연결된 생물반응기 챔버를 조직 배양 인큐베이터로 이동하여 온도와 가스를 평형화합니다. 주실에 부착된 주사기 펌프를 사용하여 약 2분마다 한 번의 완전 호흡으로 폐를 환기하고, 연동 펌프를 통해 분당 약 10ml로 총 30분 동안 기도 착석을 위해 혈관 구조를 관류합니다. 호흡 루프의 3방향 정지 콕에 부착된 주사기 포트를 통해 부드럽게 주입하여 세포 현탁액으로 폐를 팽창시킵니다.

기도나 혈관 관류 없이 하룻밤 동안 섭씨 37도, 5%CO2에서 폐를 정적으로 유지하여 세포가 탈세포화된 폐 기질에 부착할 수 있도록 합니다. 하룻밤 배양 후 표준 기도 환기 프로그램과 배양을 다시 시작하고 혈관 안착을 위해 3-7일 동안 장기를 배양합니다. 유로의 방향성은 이 두 구획을 연결하는 튜브에 위치한 스톱 콕의 밸브를 회전시켜 내피 세포를 시딩하고, 시딩이 완료되면 자기 교반을 사용하여 부드럽게 교반하면서 연동 펌프를 사용하여 점차적으로 내피 세포를 파종함으로써 메인 챔버에서 내피 시트 저장소로 변경할 수 있습니다.

스톰프 관류를 하고 약 4-6시간 동안 정적으로 배양합니다. 분당 약 10밀리리터의 속도로 메인 챔버 배지로 혈관 관류를 다시 시작합니다. 3일에서 7일 동안 기도 환기 배양 기간과 동시에 지속적인 혈관 관류를 통해 배양합니다.

탈세포화 과정 전반에 걸쳐 MCCA 폐는 점진적인 미백을 보였으며 과정이 끝날 때 반투명하게 보였습니다. 그러나 폐는 전체적인 해부학적 특징을 유지했고 대체로 탄력성을 유지했으며 액체로 팽창한 후 자연스러운 반동을 일으킬 수 있었습니다. 미시적 수준에서.

조직학적 울트라 구조는 탈세포화 후에도 그대로 유지되었습니다. 그것은 기관지 호흡기 기관지 폐포 주머니입니다. 혈관과 모세혈관은 여전히 저전력 현미경으로 매우 명확하게 구별할 수 있었습니다.

그러나 조직학적 미세해부학은 폐의 전체적인 해부학적 구조와 초구조가 탈세포화에 의해 약간 교란되는 반면, 여기에서 볼 수 있듯이 조직에는 온전한 세포가 전혀 없다는 것을 보여주었습니다. 탈세포화된 조직에는 미량의 DNA만 남았습니다. 또한, 알코올 침전에 의해 농축되고 0.8% AROS 겔에서 시각화된 미량 DNA는 대부분 저분자량 분해 단편으로 구성되었습니다.

세포 단백질 제거의 효율성은 천연 폐 단백질과 탈세포화된 폐 단백질 모두에 대한 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가되었습니다. 베타 액틴에 대한 항체를 사용한 용해물, 베타 액틴은 천연 폐 용해물에서는 쉽게 검출되었지만, 탈세포화된 폐 용해물에서는 검출되지 않았는데, 이는 탈세포화가 세포를 급격히 고갈시키고 마카 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 BMC를 사용한 기도 파종 후 14일 후에 세포 관련 단백질 물질을 제거하고, 약 2분마다 약 1회의 흡기 만료 주기로 생물반응기 배양을 했음을 시사합니다. 탈세포화된 마카 폐의 실질(parenchyma)은 효과적으로 화되었다.

BMC는 깨끗하고 열린 폐포 내강을 유지하면서 폐포 격막을 정렬했습니다. 큰 기도의 탈락된 매트릭스는 또한 생물반응기를 사용하여 BMC에 의해 측정되었으며, 주요 줄기 기관지의 내강 표면은 14일의 배양 후 BMC와 같은 편평 단층으로 늘어섰습니다. 여기에 표시된 생물반응기에는 혈관 조직에 미세혈관 내피 세포를 파종하고 분당 5밀리리터의 속도로 내피 배양 배지로 일정한 혈관 관류를 제공한 후 5일 후에 탈세포화된 reus 폐엽이 있습니다.

조직학적 분석은 폐 실질의 작은 혈관 구조를 감싸고 있는 세포를 밝혀냈습니다. 어떤 경우에는 세포가 내강을 가로지르는 여러 세포 돌기를 통해 기질에 부착된 것처럼 보였고, 혈관의 다른 단면에서는 세포가 내피 표면을 투명한 내강으로 감싸고 있는 것을 보여주었습니다. 이 절차를 따릅니다.

면역조직화학, 웨스턴 블롯 및 정량적 real-time PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 파종된 줄기세포가 무세포 폐 기질에서 배양된 후 폐 계통 세포로 분화하는지 또는 생물반응기 내의 성숙한 상피 및 내피 세포로 분화하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간이 아닌 영장류 폐를 탈세포화하고 생성된 무세포 폐를 생물반응기 시스템에서 줄기 세포, 상피 세포 및 내피 세포를 배양하기 위한 골격으로 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간이 아닌 영장류 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 안면 보호대와 라텍스 또는 니트릴 장갑의 이중 층을 포함한 완전한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.