림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성
2013년 12월 16일
림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성이 설명됩니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절 지방 패드를 생성하고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 림프절을 옮기
는 것입니다.이 절차의 전반적인 목표는 림프절 지방 패드 키메라를 생성하여 림프절 기질 형성에 대한 지방 조직의 기여도를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 신생아 마우스의 림프절과 18.5일 마우스 배아의 지방 패드를 분리하여 수행됩니다. 림프절은 배아 지방 패드에서 제거되고 신생아 림프절로 대체됩니다.
림프절 지방 패드 키메라는 하나의 신생아 림프절과 하나의 배아 지방 패드를 체외에서 재연관시킨 다음 배양하여 조립됩니다. 그런 다음 키메라를 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식합니다. 이식 3주 후, 신장을 적출하고 키메라를 채취합니다.
궁극적으로, 지방 패드 유래 세포가 림프절 기질에 기여하는 정도는 유세포 분석 및 면역형광 현미경 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 그래서 우리는 지방 패드의 세포가 림프절 형성에 기여하는지 여부를 평가하는 방법을 찾고 있을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 머리를 절제 한 후 가위를 사용하여 흉부 부위 상단에서 복부 하단까지 동물의 몸을 엽
니 다.복강에서 모든 내장을 조심스럽게 제거한 후 RF 90 매체가 들어 있는 10mm 페트리 접시에 시체를 넣습니다. 접시를 멸균 조직 배양 후드에 넣은 다음 새 RF 90이 들어 있는 새로운 멸균 10mm 페트리 접시에 본체를 옮깁니다. 그런 다음 서혜부 부위의 피부에서 복막을 조심스럽게 분리하고 지방 패드에 있는 세 혈관의 교차점에 위치한 서혜부 림프절을 찾습니다.
림프절을 조심스럽게 제거하고 지방 조직이 모두 제거되었는지 확인합니다. 그런 다음 얼음 위에 RF 10 배지가 들어 있는 50mm 페트리 접시에 림프절을 넣어 18.5일 배아에서 서혜부 지방 패드를 분리합니다. 방금 시연한 대로 내장을 제거한 후 멸균 PBS로 시신을 씻어 모든 혈액 흔적을 제거합니다.
세척된 시신을 90mm 페트리 접시에 옮긴 다음 복막을 분리하고 서혜부 림프절을 국소화한 다음 방금 설명한 대로 제거합니다. 분리된 조직을 버립니다. 지방 패드 키메라의 오염을 방지하기 위해 림프절 전체를 제거하도록 주의하십시오.
그런 다음 서혜부 지방 패드를 제거하고 얼음 위에 RF 50 매체가 들어 있는 10mm 페트리 접시에 넣습니다. 체외 장기 배양 시스템을 설정하려면 먼저 일부 Vulcan Under Wrap을 1-1.5제곱센티미터 조각으로 자릅니다. 그런 다음 스펀지를 증류수에 2시간 동안 끓이고 필터를 20분 동안 끓인 다음 세포 배양 후드에서 몇 시간 동안 건조시킵니다.
재료가 건조되면 2밀리리터의 미디어가 들어 있는 50mm 페트리 접시에 각각 하나의 스펀지를 넣습니다. 각 스폰지를 매체에 담궈 양면을 적신 다음 액체 공기 계면에 체외 장기 배양 시스템당 하나의 필터를 배치합니다. 다음으로, 하나의 배아 지방 패드와 하나의 신생아 림프절을 각 필터의 상단에 직접 조심스럽게 다시 연결합니다.
페트리 접시를 바닥에 물이 있고 뚜껑에 구멍이 있는 직사각형 플라스틱 상자에 옮깁니다. 구멍을 열어 둔 상태로 상자 뚜껑을 테이프로 붙입니다. 그런 다음 상자를 섭씨 37도의 5%CO2 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
상자를 2시간 동안 평형을 이룬 다음 뚜껑의 구멍을 테이프로 밀봉합니다. 이식 후 3-4주 후에 림프절이 지방 패드에 부착될 수 있도록 최소 2일 동안 조직을 배양한 후 신장 캡슐 아래로 이식합니다. 각 신장 내의 각 림프절, 지방 패드, 키메라를 분리하고 림프절을 해부합니다.
그런 다음 각 림프절에 대해 작은 가위를 사용하여 조직을 한 번 절개하여 효소 소화를 돕습니다. 다음으로, 600마이크로리터의 소화 완충액이 들어 있는 개별 1.5ml einor 튜브에 림프절 하나를 각각 삽입합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 교반 열 블록에서 튜브를 배양하고 10분마다 위아래로 피펫팅하여 조직을 분리하는 데 도움을 줍니다.
그런 다음 6마이크로리터의 EDTA를 튜브에 추가하고 세포 현탁액을 몇 번 삼중분파하여 해리를 마칩니다. 그런 다음 세포를 원하는 관심 항체로 염색하고 유세포 분석법으로 분석하여 향상된 노란색 형광 단백질 또는 EYFP 발현을 보존할 수 있습니다. 3-4시간 동안 림프절을 고정합니다.
그런 다음 각 림프절에 대해 차가운 OCT 화합물 한 방울을 작은 알루미늄 호일 조각에 떨어뜨립니다. 기포를 피하면서 조심스럽게 림프절 하나를 한 방울 중간에 놓은 다음 호일을 드라이아이스에 올려 조직을 얼립니다. 그런 다음 림프절을 절편화하고 염색하고 형광 현미경으로 분석할 수 있습니다.
P: 림프절의 신중한 분리를 통해 EYFP 양성 지방 유래 세포의 자손을 추가로 분석할 수 있습니다. 림프절의 극저온 절편 및 면역형광 분석은 EYFP 양성 지방 유래 세포가 림프절로 이동하여 GP 38 양성 E RTR 7 양성 림프절 기질 세포 네트워크 흐름에 기여하는 것을 보여줍니다 세포 분석 결과 림프절 기질 세포의 중요한 분획이 국소 EYFP 양성 지방 조직 전구 세포에서 유래한다는 것을 확인합니다 CD 45 음성 G 38 양성 CD 31 음성 섬유아세포의 30%에 기여합니다 분획 및 CD 45 음성 GP 38 음성 CD 31 양성 혈액 내피 세포 분획의 10%는 CD 45의 최대 80%, 음성 G 38 양성 CD 31 음성 섬유아세포 분획은 지방 조직 전구 세포에서 파생될 수 있으며, 이는 림프절 기질의 성장을 유지하는 데 지방 조직이 수행하는 중요한 역할을 보여줍니다. 그래서 일단 림프구 기관 형성 분야의 연구원과 함께이 기술을 마스터하여 림프 외상에 관여하는 다양한 분자의 역할을 탐구했습니다.
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개요
이 기사는 림프절 기원을 연구하기 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성에 대해 설명합니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절-지방 패드를 만들고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식하는 것을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 면역학
배경
- 림프절은 면역 시스템에서 중요한 역할을 합니다.
- 기질 세포는 림프절의 구조와 기능에 필수적입니다.
- 지방 조직이 림프절 발달에 기여하는 것을 이해하는 것이 중요합니다.
- 키메라 모델은 세포의 기원과 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 지방 조직이 림프절 기질 형성에 기여하는 정도를 평가합니다.
- 림프절 발달을 연구할 수 있는 모델을 만듭니다.
- 림프절과 주변 조직 간의 상호 작용을 조사합니다.
사용된 방법
- 신생아 마우스에서 림프절 분리.
- 18.5일 마우스 배아에서 배아 지방 패드 분리.
- 키메라를 만들기 위해 지방 패드 내의 림프절 교체.
- 키메라를 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식.
주요 결과
- 림프절-지방 패드 키메라의 성공적인 생성.
- 키메라는 림프절과 지방 패드의 통합을 나타냅니다.
- 기질 세포의 기원과 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성.
- 지방 조직이 림프절 발달에서 역할하는 통찰력.
결론
- 이 방법은 림프절 생물학을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
- 키메라 모델은 면역 시스템 발달에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
- 추가 연구는 면역 반응에 대한 영향을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding the cellular origin and lineage of lymph node stromal cells is critical for de-risking early immunology target validation and clarifying mechanisms underlying lymphoid organogenesis. The lymph node-fat pad chimera model enables precise lineage tracing of stromal precursors, supporting predictive confidence in stromal cell biology and facilitating risk-adjusted decisions in immunology-focused discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of stromal cell lineage and differentiation pathways.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying adipose-derived contributions to lymph node stroma.
- Facilitates functional target validation for stromal cell-related immune modulation.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative flow cytometric and immunofluorescence analysis of stromal cell populations.
- Enables reproducible preparation of chimeric tissues for downstream phenotypic screening.
- Supports assay standardization by allowing controlled manipulation of precursor cell sources.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by recapitulating stromal cell development in vivo.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of stromal cell function.
- Supports translational biomarker identification through lineage tracing and phenotypic analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This chimera model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven lineage tracing, quantitative stromal cell analysis, and mechanistic de-risking of immune targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal cell origin and differentiation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for stromal cell population analysis.
- Analytics: Enables flow cytometric and immunofluorescence readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates preclinical continuity by modeling in vivo stromal cell integration.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating genetic or pharmacological perturbations in stromal cell development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stromal cell lineage and function.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and stromal cell quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for immunology targets by reducing mechanistic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stromal cell-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery, tissue isolation, and organ culture techniques.
- Demands access to flow cytometry and immunofluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible chimera assembly and analysis.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for tissue compatibility.
- Dependent on availability of genetically labeled precursor cells for lineage tracing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Isolation of Newborn Inguinal Lymph Nodes (LN)
2:38
Isolation of E18.5 Fat Pads
3:28
Generation of the LN-fat Pad Chimera
5:14
Isolation and Enzymatic Digestion of the Transferred LN for Flow Cytometric Analysis
6:31
Analysis of the Transferred LNs by Immunofluorescence
7:16
Results: Typical Experimental Results Obtained Using the LN/fat Pad Chimera Method
8:44
Conclusion
