Name: 림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 림프절과 태아 지방 패드를 이용한 림프절 지방 패드 키메라 생성 방법을 통해 지방 조직이 림프절 기질 형성에 기여하는 정도를 평가하는 기술을 익히세요.

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우리는 동물 서식지를 돌봐준 버밍엄 대학의 생물 의학 서비스 부서 직원들에게 감사합니다. 이 작업은 EU FP7 통합 프로젝트 INFLACARE to JC의 지원을 받았습니다.

마우스는 영국 내무부 및 지역 윤리 위원회 규정에 따라 버밍엄 대학의 생물 의학 서비스 부서에서 SPF 조건으로 사육 및 유지되었습니다. 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 지역 윤리 위원회와 내무부에서 승인한 프로젝트 라이선스에 따라 적용됩니다.
1. 신생아 LN의 격리
<ol>
	<li>갓 태어난 쥐를 경추 탈구로 희생시킵니다.</li>
	<li>머리를 절개하고 흉부 위쪽에서 복부 아래쪽까지 가위로 몸을 열고 복강에서 모든 내장(심장, 폐, 간, 장, 신장, 방광)을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>RF10 배지(10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI1640 배지)가 포함된 90mm 페트리 접시에 시신을 옮깁니다. 이 단계부터 조직은 멸균 상태로 유지되고 조직 배양 후드에서 처리됩니다.</li>
	<li>RF90이 들어있는 새로운 10mm 페트리 접시로 본체를 옮깁니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 서혜부 피부에서 복막을 조심스럽게 분리합니다. 서혜부 LN은 지방 패드에 있는 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치합니다.</li>
	<li>LN을 조심스럽게 제거합니다. 모든 지방 조직이 제거되었는지 확인하십시오. LN을 RF10 매체가 들어 있는 50mm 페트리 접시로 옮깁니다. 절차를 계속하는 동안 티슈를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>
2. E18.5 팻 패드의 절연
<ol>
	<li>임신 18.5일째(E18.5)에 마우스 배아를 생성하려면, 케이지당 암컷 마우스와 수컷 마우스를 하룻밤 동안 배치하여 시간 제한 임신을 설정합니다. 아침에 생쥐를 분리하고 질 마개가 있는지 확인합니다(재태일 E0.5).
	<ol>
		<li>임신 18.5일째에 막힌 암컷을 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.</li>
		<li>배아를 제거하고 RF10이 들어있는 90mm 페트리 접시에 넣었습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이 단계부터는 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 조직을 처리해야 합니다. 해부 현미경으로 머리를 절편화하고 흉부 부위에서 복부 부위 하단까지 가위로 배아를 열고 체강에서 모든 내장(심장, 폐, 간, 장, 신장, 방광)을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>남아 있는 모든 내장 조직에서 몸을 씻고 PBS로 씻어 해부를 더 어렵게 만들 수 있는 모든 혈액 흔적을 제거합니다.</li>
	<li>깨끗한 본체를 RF90이 들어있는 새로운 10mm 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>서혜부 피부에서 복막을 조심스럽게 분리한다. 서혜부 LN은 지방 패드에 있는 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치합니다.</li>
	<li>LN을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 키메라에 사용되는 지방 패드가 림프 기질 세포에 의해 오염되지 않도록 LN을 완전히 제거하는 것이 매우 중요합니다.</li>
	<li>서혜부 지방 패드를 제거하고 RF50 매체가 들어 있는 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 절차를 계속하는 동안 티슈를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>
3. LN-fat Pad 키메라의 생성
<ol>
	<li>체외 장기 배양 시스템 준비15.
	<ol>
		<li>스폰지 및 필터 준비: 이것은 미리 수행할 수 있으며 스폰지와 필터는 배양 후드의 페트리 접시에 멸균 상태로 보관됩니다.
		<ol>
			<li>Vulkan 언더 랩을 1-1.5 cm2 개 잘라</li>
			<li>증류수에 스펀지를 2시간 동안 끓입니다.</li>
			<li>세포 배양 후드에서 스펀지를 몇 시간 동안 말리십시오.</li>
			<li>필터를 20분 동안 끓입니다.</li>
			<li>세포 배양 후드에서 필터를 몇 시간 동안 건조시킵니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>10% 소 태아 혈청, 10mM HEPES, 1x MEM 비필수 아미노산 용액, 50mM 2-메르캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보완된 DMEM 배지를 준비합니다.</li>
		<li>2mm 페트리 접시에 50ml의 미디어를 추가합니다.</li>
		<li>페트리 접시 바닥에 스폰지 하나를 놓습니다. 스펀지의 양면을 미디어에 담가 적십니다.</li>
		<li>스펀지 위에 필터 하나를 놓습니다. 필터는 액체-공기 인터페이스에 위치합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해부 현미경 아래에서 하나의 신생아 LN을 하나의 배아 지방 패드와 조심스럽게 다시 연결합니다.</li>
	<li>LN-fat 패드 키메라를 필터 위에 놓습니다.</li>
	<li>뚜껑에 몇 개의 구멍이 있고 습도를 보장하기 위해 바닥에 물이 들어 있는 직사각형 플라스틱 상자에 페트리 접시를 옮깁니다.</li>
	<li>테이프로 상자 뚜껑을 밀봉합니다. 뚜껑에 있는 두 개의 구멍을 열어 두십시오.</li>
	<li>상자를 37°C에서 5% CO2로 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 뚜껑의 구멍을 테이프로 밀봉하기 전에 상자를 2시간 동안 평형을 이룹니다.</li>
	<li>LN이 지방 패드에 부착되고 신장 캡슐 아래로 이동할 수 있도록 최소 2일 동안 조직을 배양합니다.</li>
</ol>
4. 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 LN-fat Pad 키메라의 이동
<ol>
	<li>필터에서 LN-fat pad 키메라를 수집하여 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 옮깁니다. 신낭 이식 방법은 이미 기술되어 있다 16.</li>
</ol>
5. 전송된 LN의 격리
<ol>
	<li>신장 캡슐 아래에서 3-4주가 지나면 LN-fat 패드 키메라를 수확할 준비가 됩니다. 승인된 지침에 따라 숙주 마우스를 안락사시킵니다.</li>
	<li>숙주 마우스에서 신장을 제거합니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 LN-fat pad 키메라를 분리하고 LN을 해부합니다.</li>
</ol>
6. 유세포 분석을 위한 전송된 LN의 효소 분해
<ol>
	<li>효소가 장기에 침투하여 소화를 촉진할 수 있도록 작은 가위로 LN을 한 번 절개합니다.</li>
	<li>600 μl의 분해 완충액(RPMI 1% FCS, 2.5 mg/ml Collagenase D, 100 μg/ml DNase I)이 포함된 1.5 ml Eppendorf에 LN 1개를 넣습니다.</li>
	<li>37 °C에서 교반 열 블록에서 30 분 동안 배양합니다. 10분마다 조직의 해리를 돕기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.</li>
	<li>튜브에 6μl EDTA 0.5M를 추가하고 위아래로 피펫을 넣어 조직의 해리를 마칩니다.</li>
	<li>490 x g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.</li>
	<li>일차 항체 조합을 함유한 염색 용액(PBS, 0.1% BSA, 5% 랫드 세럼 및 5% 마우스 혈청)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 두 번 세척</li>
	<li>필요한 경우 20분 동안 2차 항체로 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 2번 세탁합니다.</li>
	<li>유세포 분석기에서 분석합니다.</li>
</ol>
7. 면역형광에 의한 전달된 LN 분석
<ol>
	<li>동결 및 극저온 절편 공정 중 EYFP 보존을 위한 고정: LN을 PBS, 4% PFA 및 10% 자당 용액에 넣고 3-4시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>작은 알루미늄 호일 조각에 차가운 OCT 화합물을 한 방울 떨어뜨립니다. 기포를 피하십시오. 방울 중간에 액체가 없는 LN을 조심스럽게 놓습니다.</li>
	<li>드라이 아이스에 알루미늄 호일을 올려 오르간을 얼립니다.</li>
	<li>저온 유지 장치를 사용하여 추가 접착제 유리 슬라이드에 8-10μm 섹션을 자릅니다. 슬라이드를 -20°C에서 보관하기 전에 2시간 동안 건조시키십시오.</li>
	<li>염색 절차는 사용되는 1차 항체에 따라 달라질 수 있으며 다음 프로토콜에서 최적화할 수 있습니다. 일차 항체 조합을 함유한 염색 용액(PBS, 1% BSA)으로 절편을 염색합니다.</li>
	<li>가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 두 번 세척합니다</li>.
	<li>2차 항체로 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 5분 동안 두 번 세척합니다.</li>
	<li>DAPI가 포함된 장착 매체에 슬라이드를 장착합니다.</li>
	<li>형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
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</ol>

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이 기사에서 우리는 발달 중인 LN에 대한 지방 조직 전구 세포의 기여도를 분석하고 정량화하는 방법과 자손을 분석할 수 있는 두 가지 기술을 제시했습니다. 배아 지방 패드 및 신생아 LN의 해부는 섬세하며 실제 LN-지방 패드 키메라를 생성하기 전에 많은 연습을 통해 얻은 수동 기술이 필요합니다. 해부의 품질을 제어하기 위해 지방 패드와 LN에 대해 유세포 분석을 수행할 수 있습니다. 배아 지방 패드 준비에는 림프절이 없어야 하며 CD45+CD4+IL-7Ra+ 림프 조직 유도 세포를 포함해서는 안 됩니다. 신생아 LN 제제는 지방 조직이 전혀 없어야 하며 높은 비율의 CD45-CD31-ICAM-1 높은VCAM-1높은 림프 조직 조직자 세포6,13-14를 포함해야 합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 조직 배양 및 수술을 위한 표준 멸균 기술을 따라야 합니다.	
	<p ...

림프절(LN)은 림프 혈관 구조망을 따라 신체의 전략적 위치에 위치한 면역 체계의 핵심 기관입니다. 그들은 항원과 병원체의 여과를 가능하게 하고 림프구에 항원을 제시하고 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 장소를 제공합니다. LN의 기본 구조를 형성하고 적응 면역 반응의 다양한 조혈 참가자의 움직임을 조율하는 기질은 이러한 기관의 기능에 중심적인 역할을 합니다. 기질 세포의 다양한 집단은 면역 체계의 조혈 구성 요소의 이동, 국소화, 생존, 증식 및 성숙에 대한 필수적이고 구체적인 단서를 제공합니다1-3. 성인 LN 기질 세포는 혈액 내피 세포, 림프 내피 세포 및 섬유아세포의 세 가지 범주로 나뉩니다. 이 세 가지 범주는 이질적인 인구를 포함합니다. 섬유아세포 집단은 섬유아세포 망상 세포(FRC), 여포 수지상 세포(FDC), 변연 망상 세포(MRC)를 포함하는 반면, 캡슐을 형성하는 섬유아세포, 수질 및 아직 확인되지 않은 기타 세포1-5를 포함합니다. 서로 다른 LN 기질 세포 집단의 성숙을 지배하는 기원과 메커니즘은 불분명하며, 특정 LN 기질 세포 집단의 운명 매핑을 가능하게 하는 특정 마커가 없기 때문에 연구가 특히 어렵습니다. 그러나 LN 기질 세포의 개체발생에 대한 완전한 이해는 적응 면역 반응, 내성에 기여하는 메커니즘의 이해를 위해 필요하며 인공 LN 개발의 기초가 됩니다.
지금까지 LN 기질 세포 기원 및 발달에 대한 연구는 대부분 야생형 마우스와 다른 녹아웃 마우스 균주6-9의 배아 및 신생아의 LN 발달에 대한 직접적인 평가로 제한되었습니다. 이러한 접근법은 LN 발달에 중요한 유전자에서 결실을 운반하는 일부 마우스 균주의 배아 및 주산기 치사율에 의해 제한됩니다. 더욱이, 림프조직 발달에 필수적인 유전자 중 일부는 RANK10-11 또는 NF-κB212의 경우와 같이 광범위한 생물학적 과정에 관여합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래에 배아 LN의 분리 및 이식이 수행되었습니다12-13. 이 기술은 예를 들어, 야생형 환경에서 유전자 변형 배아 LN을 전달하여 장기 발달과 숙주 세포의 모집 및 조직을 평가할 수 있습니다. 그러나 성체 숙주의 신장 캡슐 아래에 이식된 배아 LN의 성장이 손상되어 이 기술의 사용이 제한됩니다.
LN과 지방 침전물은 해부학적으로 밀접하게 연관되어 있으며 배발생 중에 동시에 발생합니다. 우리는 최근에 LN/지방 조직 연관이 LN을 위한 기질 세포 전구 세포를 제공하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다. 특히, LTβR을 통한 신호전달은 지방형성을 차단하고 대신 LN 기질세포 표현형14를 향한 성숙을 촉진함으로써 지방세포 전구세포의 운명을 조절합니다. 여기에서는 LN-fat pad chimeras의 생성을 기반으로 하는 방법을 설명하여 개발 중인 LN에서 지방 조직 유래 세포를 추적할 수 있습니다. 이 방법은 서로 다른 LN 기질 세포 집단에 대한 지방 조직의 기여도를 결정하는 데 유용하며, 유전자 변형 마우스 균주의 조직을 사용하는 것과 결합하여 서로 다른 LN 기질 세포 하위 집합의 분화를 제어하는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50mm 스테릴린 페트리 디쉬</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90mm 스테릴린 페트리 디쉬</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>접착 슬라이드</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IgM 로다민 레드</td><td>스트라텍</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Podoplanin PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Podoplanin 정제</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM 미디엄</td><td>시그마</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>시그마</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게 Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>배아 및 신생아 박리용 초미세 집게</td></tr><tr><td>EDTA 용액 0.5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogenesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>경화 파인 아이리스 가위 스트레이트 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>해부용 소형 가위</td></tr><tr><td>HEPES 용액</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isopore 멤브레인 필터 0.8 &mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 화합물</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 플라스틱 상자</td><td>Watkins and Doncaster</td><td>E6052</td><td>in vitro 장기 배양을 위한 샌드위치 상자. CO2 인큐베이터에서 가스를 교환할 수 있도록 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫습니다.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 미디엄</td><td>시그마</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>스폰지 Vulkan 언더랩</td><td>Patterson 의료</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>줌</td></tr> 써<tr><td>모믹서</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 배지 DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

기질은 림프절 구조와 기능의 핵심 구성 요소입니다. 그러나 그 기원, 정확한 세포 구성 및 그 형성을 지배하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 림프절은 항상 지방 조직에 캡슐화되어 있으며, 우리는 최근에 림프절 기질의 형성에 대한 이러한 관계의 중요성을 입증했습니다. 지방세포 전구세포는 발달 과정에서 림프절로 이동하며, 림프세포(Lymphotoxin-b) 수용체가 관여하면 지방형성을 끄고 지방형성을 차단하고 림프구 기질세포(lymphoid stromal cell)로 분화한다(Bénézech et al.14). 지방 조직의 림프구 기질 전위를 기반으로 림프절 기질 세포 전구체의 계통 추적을 가능하게 하는 림프절/지방 패드 키메라를 사용하는 방법을 제시합니다. 신생아 림프절과 EYFP+ 배아 지방 조직을 분리하고 LN/EYFP+ 지방 패드 키메라를 만드는 방법을 보여줍니다. 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 이식된 후, 림프절은 국소 지방 조직 전구 세포를 통합하고 형성을 마칩니다. 생성된 림프절에서 EYFP+ 지방 패드 세포의 자손 분석은 효소로 분해된 림프절의 유세포 분석 또는 림프절 동결절편의 면역형광 분석을 통해 수행할 수 있습니다. 다양한 knockout 마우스 모델의 지방 패드를 사용함으로써, 이 방법은 다양한 림프절 기질 세포 집단의 기원을 분석하는 효율적인 방법을 제공할 것입니다.

이식 3주 후, 신장에서 LN/지방 패드 키메라를 회수합니다. 이제 키메라는 자체 지방 패드 내의 정상적인 LN과 매우 유사하며, 지방 조직 중앙에서 LN을 확인할 수 있습니다(그림 1). 만약 LN을 식별할 수 없다면, 신장 이식 과정에서 손실되었을 가능성이 있습니다. LN 발달에 잠재적으로 중요한 유전자의 역할을 평가할 때, 회수된 LN은 크기가 매우 작아 찾기 더 어려울 수 있습니다. 이는 LTβR-/- 마우스의 지방 조직을 신생 LN과 재결합시킨 경우에 해당합니다14.
LN을 주의 깊게 분리하면 EYFP+ 지방 유래 세포의 자손에 대한 추가 분석이 가능합니다. LN의 냉동 절편 및 면역형광 분석 결과, EYFP+ 지방 유래 세포가 LN으로 이동하여 Gp38+ERTR-7+ LN 기질 세포 네트워크에 기여하는 것으로 나타났습니다(...

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성이 설명됩니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절 지방 패드를 생성하고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 림프절을 옮기는 것입니다.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

본 절차의 전반적인 목적은 림프절 기질 형성에 있어 지방 조직의 기여도를 평가하기 위해 림프절 지방 패드 키메라를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 신생 마우스로부터 림프절을 분리하고, 배아 18.5일 차 마우스로부터 지방 패드를 분리함으로써 수행됩니다. 그 후 배아 지방 패드에서 림프절을 제거하고 그 자리에 신생 마우스의 림프절을 대체하여 삽입합니다.림프절 지방 패드 키메라는 신생 림프절 하나와 배아 지방 패드 하나를 체외에서 재결합하여 배양함으로써 제작됩니다. 이후 이 키메라를 수용 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식합니다. 이식 3주 후, 신장을 적출하여 키메라를 회수합니다.최종적으로, 지방 패드 유래 세포가 림프절 기질에 기여하는 정도는 유세포 분석 및 면역형광 현미경 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 따라서 우리는 지방 패드 유래 세포가 림프절 형성에 기여하는지 평가할 방법을 찾던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 신생아 서혜 림프절을 분리하려면, 머리를 절단한 후 가위를 사용하여 동물의 흉부 상단부터 복부 하단까지 신체를 절개하십시오.복강에서 모든 내장 기관을 조심스럽게 제거한 후, RF 10 배지가 담긴 90 millimeter 페트리 접시에 체신을 넣습니다. 접시를 멸균 조직 배양 후드 안에 넣고, 다시 신선한 RF 10이 담긴 새로운 멸균 90 millimeter 페트리 접시로 체신을 옮깁니다. 그다음 서혜부에서 피부와 복막을 조심스럽게 분리하고, 지방 패드 내 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치한 서혜 림프절을 찾습니다.모든 지방 조직이 제거되었는지 확인하며 림프절을 조심스럽게 적출합니다. 그런 다음, 18.5일 차 배아에서 서혜부 지방 패드를 분리하기 위해 RF 10 배지가 들어있는 얼음 위의 50 millimeter 페트리 접시에 림프절을 넣습니다. 앞서 시연한 것과 같이 내장을 제거한 후, 몸체를 멸균 PBS로 세척하여 혈액 흔적을 모두 제거합니다.세척된 사체를 새로운 90mm 페트리 접시에 옮긴 후, 복막을 분리하고 서혜 림프절의 위치를 찾아 앞서 시연한 것과 같이 제거합니다. 분리된 조직은 폐기하십시오. 지방 패드 키메라의 오염을 방지하기 위해 림프절 전체를 완전히 제거하도록 주의하십시오.그런 다음 서혜부 지방 패드를 제거하여 얼음 위에 놓인 RF 10 배지가 담긴 50 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 인비트로(in vitro) 장기 배양 시스템을 구축하려면, 먼저 Vulcan under wrap을 1~1.5 square centimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 스펀지는 2시간 동안, 필터는 20분 동안 증류수에서 끓인 후 세포 배양 후드 내에서 몇 시간 동안 건조시킵니다.재료가 건조되면, 2 mL의 배지가 담긴 50 mm 페트리 접시에 스펀지를 하나씩 넣습니다. 각 스펀지를 배지에 담가 양면을 적신 후, 각 in vitro 장기 배양 시스템의 기액 계면에 필터를 하나씩 배치합니다. 다음으로, 배아 지방 패드 하나와 신생아 림프절 하나를 각 필터의 상단에 직접 조심스럽게 재결합합니다.페트리 접시를 바닥에 물이 있고 뚜껑에 구멍이 뚫린 직사각형 플라스틱 상자에 옮깁니다. 구멍은 열어둔 상태로 뚜껑을 상자에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 이 상자를 37 °C, 5% CO2 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.상자를 2시간 동안 평형 상태로 둔 다음, 뚜껑의 구멍을 테이프로 밀봉합니다. 이식 3~4주 후 신장 캡슐 아래로 옮기기 전, 림프절이 지방 패드에 부착될 수 있도록 조직을 최소 2일 동안 배양합니다. 각 신장 내에서 각 림프절 지방 패드 키메라를 분리하고 림프절을 절제합니다.그런 다음 각 림프절에 대해, 작은 가위로 조직에 단일 절개를 가해 효소 소화를 돕습니다. 다음으로 600 µL의 소화 완충액이 들어 있는 개별 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 림프절을 각각 하나씩 넣습니다. 튜브를 교반 열 블록에서 37 °C로 30분 동안 배양하며, 조직의 해리를 돕기 위해 10분마다 피펫팅을 수행합니다.그 다음 튜브에 EDTA 6 µL를 첨가하고 세포 현탁액을 몇 차례 트리튜레이션(triturate)하여 해리를 완료합니다. 이후 원하는 항체로 세포를 염색하고 유세포 분석기로 분석하여 강화 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein) 또는 EYFP 발현을 보존할 수 있습니다. 림프절을 3~4시간 동안 고정합니다.그런 다음 각 림프절에 대해, 차가운 OCT 화합물 한 방울을 작은 알루미늄 호일 조각 위에 떨어뜨립니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 방울의 중앙에 림프절 하나씩을 조심스럽게 놓고, 호일을 드라이아이스 위에 올려 조직을 동결시킵니다. 이후 림프절을 절편화하고 염색하여 형광 현미경으로 분석할 수 있습니다.림프절을 세심하게 분리하면 EYFP 양성 지방 유래 세포의 자손 세포를 추가로 분석할 수 있습니다. 림프절의 냉동 절편 및 면역형광 분석 결과, EYFP 양성 지방 유래 세포가 림프절로 이동하여 GP38 양성 ERTR7 양성 림프절 기질 세포 네트워크에 기여하는 것으로 나타났습니다. 유세포 분석을 통해 림프절 기질 세포의 상당 부분이 국소 EYFP 양성 지방 조직 전구 세포에서 유래함을 확인했으며, 이는 CD45 음성 GP38 양성 CD31 음성 섬유아세포 분획의 30%와 CD45 음성 GP38 음성 CD31 양성 혈관 내피 세포 분획의 10%를 차지합니다. CD45 음성 GP38 양성 CD31 음성 섬유아세포 분획의 최대 80%가 지방 조직 전구 세포에서 유래할 수 있으며, 이는 림프절 기질의 성장을 유지하는 데 있어 지방 조직이 수행하는 결정적인 역할을 입증합니다. 따라서 림프 기관 형성 분야의 연구자가 이 기술을 숙달하면 림프 기질 형성에 관여하는 다양한 분자의 역할을 탐구할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

림프절 기원 연구를 위한 림프절-지방 패드 키메라 생성

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

이 프로토콜 어떤 autoreactive 세포 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 기자를가지고 자연 면역 어린 싹 센터와 혼합된 murine 골 키메라의 생성을 설명 합니다. 이 다운스트림 분자 및 기능 분석 조직에 세포 위치를 연결 하는 기능을 제공 합니다.

면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문

본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.

쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제합니다.

종양 형성 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 배액 림프절 전이 모델

이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.

쥐 비장 조직 형성을 조사하기 위한 Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation

배우세요 신생아 마우스 림프절과 태아 지방 패드를 이용한 림프절 지방 패드 키메라 생성 방법을 통해 지방 조직이 림프절 기질 형성에 기여하는 정도를 평가하는 기술을 익히세요.

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

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