림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

본 절차의 전반적인 목적은 림프절 기질 형성에 있어 지방 조직의 기여도를 평가하기 위해 림프절 지방 패드 키메라를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 신생 마우스로부터 림프절을 분리하고, 배아 18.5일 차 마우스로부터 지방 패드를 분리함으로써 수행됩니다. 그 후 배아 지방 패드에서 림프절을 제거하고 그 자리에 신생 마우스의 림프절을 대체하여 삽입합니다.

림프절 지방 패드 키메라는 신생 림프절 하나와 배아 지방 패드 하나를 체외에서 재결합하여 배양함으로써 제작됩니다. 이후 이 키메라를 수용 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식합니다. 이식 3주 후, 신장을 적출하여 키메라를 회수합니다.

최종적으로, 지방 패드 유래 세포가 림프절 기질에 기여하는 정도는 유세포 분석 및 면역형광 현미경 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 따라서 우리는 지방 패드 유래 세포가 림프절 형성에 기여하는지 평가할 방법을 찾던 중 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 신생아 서혜 림프절을 분리하려면, 머리를 절단한 후 가위를 사용하여 동물의 흉부 상단부터 복부 하단까지 신체를 절개하십시오.

복강에서 모든 내장 기관을 조심스럽게 제거한 후, RF 10 배지가 담긴 90 millimeter 페트리 접시에 체신을 넣습니다. 접시를 멸균 조직 배양 후드 안에 넣고, 다시 신선한 RF 10이 담긴 새로운 멸균 90 millimeter 페트리 접시로 체신을 옮깁니다. 그다음 서혜부에서 피부와 복막을 조심스럽게 분리하고, 지방 패드 내 세 개의 혈관이 교차하는 지점에 위치한 서혜 림프절을 찾습니다.

모든 지방 조직이 제거되었는지 확인하며 림프절을 조심스럽게 적출합니다. 그런 다음, 18.5일 차 배아에서 서혜부 지방 패드를 분리하기 위해 RF 10 배지가 들어있는 얼음 위의 50 millimeter 페트리 접시에 림프절을 넣습니다. 앞서 시연한 것과 같이 내장을 제거한 후, 몸체를 멸균 PBS로 세척하여 혈액 흔적을 모두 제거합니다.

세척된 사체를 새로운 90mm 페트리 접시에 옮긴 후, 복막을 분리하고 서혜 림프절의 위치를 찾아 앞서 시연한 것과 같이 제거합니다. 분리된 조직은 폐기하십시오. 지방 패드 키메라의 오염을 방지하기 위해 림프절 전체를 완전히 제거하도록 주의하십시오.

그런 다음 서혜부 지방 패드를 제거하여 얼음 위에 놓인 RF 10 배지가 담긴 50 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 인비트로(in vitro) 장기 배양 시스템을 구축하려면, 먼저 Vulcan under wrap을 1~1.5 square centimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 스펀지는 2시간 동안, 필터는 20분 동안 증류수에서 끓인 후 세포 배양 후드 내에서 몇 시간 동안 건조시킵니다.

재료가 건조되면, 2 mL의 배지가 담긴 50 mm 페트리 접시에 스펀지를 하나씩 넣습니다. 각 스펀지를 배지에 담가 양면을 적신 후, 각 in vitro 장기 배양 시스템의 기액 계면에 필터를 하나씩 배치합니다. 다음으로, 배아 지방 패드 하나와 신생아 림프절 하나를 각 필터의 상단에 직접 조심스럽게 재결합합니다.

페트리 접시를 바닥에 물이 있고 뚜껑에 구멍이 뚫린 직사각형 플라스틱 상자에 옮깁니다. 구멍은 열어둔 상태로 뚜껑을 상자에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 이 상자를 37 °C, 5% CO2 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

상자를 2시간 동안 평형 상태로 둔 다음, 뚜껑의 구멍을 테이프로 밀봉합니다. 이식 3~4주 후 신장 캡슐 아래로 옮기기 전, 림프절이 지방 패드에 부착될 수 있도록 조직을 최소 2일 동안 배양합니다. 각 신장 내에서 각 림프절 지방 패드 키메라를 분리하고 림프절을 절제합니다.

그런 다음 각 림프절에 대해, 작은 가위로 조직에 단일 절개를 가해 효소 소화를 돕습니다. 다음으로 600 µL의 소화 완충액이 들어 있는 개별 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 림프절을 각각 하나씩 넣습니다. 튜브를 교반 열 블록에서 37 °C로 30분 동안 배양하며, 조직의 해리를 돕기 위해 10분마다 피펫팅을 수행합니다.

그 다음 튜브에 EDTA 6 µL를 첨가하고 세포 현탁액을 몇 차례 트리튜레이션(triturate)하여 해리를 완료합니다. 이후 원하는 항체로 세포를 염색하고 유세포 분석기로 분석하여 강화 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein) 또는 EYFP 발현을 보존할 수 있습니다. 림프절을 3~4시간 동안 고정합니다.

그런 다음 각 림프절에 대해, 차가운 OCT 화합물 한 방울을 작은 알루미늄 호일 조각 위에 떨어뜨립니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 방울의 중앙에 림프절 하나씩을 조심스럽게 놓고, 호일을 드라이아이스 위에 올려 조직을 동결시킵니다. 이후 림프절을 절편화하고 염색하여 형광 현미경으로 분석할 수 있습니다.

림프절을 세심하게 분리하면 EYFP 양성 지방 유래 세포의 자손 세포를 추가로 분석할 수 있습니다. 림프절의 냉동 절편 및 면역형광 분석 결과, EYFP 양성 지방 유래 세포가 림프절로 이동하여 GP38 양성 ERTR7 양성 림프절 기질 세포 네트워크에 기여하는 것으로 나타났습니다. 유세포 분석을 통해 림프절 기질 세포의 상당 부분이 국소 EYFP 양성 지방 조직 전구 세포에서 유래함을 확인했으며, 이는 CD45 음성 GP38 양성 CD31 음성 섬유아세포 분획의 30%와 CD45 음성 GP38 음성 CD31 양성 혈관 내피 세포 분획의 10%를 차지합니다. CD45 음성 GP38 양성 CD31 음성 섬유아세포 분획의 최대 80%가 지방 조직 전구 세포에서 유래할 수 있으며, 이는 림프절 기질의 성장을 유지하는 데 있어 지방 조직이 수행하는 결정적인 역할을 입증합니다. 따라서 림프 기관 형성 분야의 연구자가 이 기술을 숙달하면 림프 기질 형성에 관여하는 다양한 분자의 역할을 탐구할 수 있을 것입니다.