세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

이 절차의 전반적인 목표는 조직에서 지질 방울을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 태반 조직을 해부하고 분리함으로써 이루어집니다. 다음으로, 올레인의 세포가 균질화됩니다.

그런 다음 소기관은 여러 원심분리 단계로 분리됩니다. 마지막으로, 지질 방울을 포함하는 부유층을 수집하고 지질 방울을 특성화합니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사와 서양 혈액 분석을 사용하여 지질 방울 분획의 순도를 보여줍니다.

이 기술의 주요 장점은 대부분의 대동맥 세포에서 지질 방울을 분리할 수 있다는 것입니다. 특정 조직에서는 물방울의 수가 부동 G 층과 물방울의 수를 줄이는 것보다 적을 수 있습니다. 태반은 단태 임신을 한 건강한 여성으로부터, 만삭 시 자연 분만이 시작되기 전에 선택적 제왕절개 분만을 받은 건강한 여성으로부터 채취되었으며, 피험자는 태반 채취에 대한 서면 동의서를 제출했다.

태반의 채취 및 후속 사용은 테네시 대학교와 녹스빌에 있는 테네시 대학교 의과 대학원의 승인을 받아 수행되었습니다. 생물학적 안전 후드의 기관 검토 위원회는 태반을 멸균 오토클레이브 용기로 옮기고 멸균 식염수를 사용하여 태반과 멤브레인에서 혈액을 조심스럽게 씻습니다. 1리터 비커에 담긴 피 묻은 식염수를 액체 생물학적 폐기물로 폐기하십시오.

태반을 무균 지대에 놓고 이 매끄러운 표면이 탯줄을 향하게 하여 날카롭고 가는 가위와 집게로 위를 향하게 합니다. 탯줄과 태아막을 제거합니다. 다음으로, 모계 표면이 위를 향하도록 태반을 뒤집습니다.

그런 다음 표면에서 약 3mm 떨어진 위에 있는 기저판 조직을 제거합니다. 융모막 플레이트를 피하면서 한 번에 하나의 COTA 리드인을 해부하고 융모 조직을 식염수가 함유된 250ml 비커에 모읍니다. 그런 다음 0.9% 멸균 식염수와 집게를 사용하여 액체 폐기물용 1리터 비커를 사용하여 휘젓고 별도의 비커에서 조직을 여러 번 헹굽니다.

한 번에 하나의 코디 리드인을 150mm 페트리 접시에 옮깁니다. 집게로 잡고 면도날을 사용하여 혈관의 조직을 페트리 접시에 긁어냅니다. 긁어낸 조직을 0.9%의 멸균 식염수가 들어 있는 별도의 비커에 넣습니다.

모든 조직 조각에 대해 반복합니다. 세포 해리 cve에서 긁힌 조직을 헹군 후 태반 조직을 소화하기 위해 과도한 액체와 무게를 배출합니다. 조직 소화 혼합물을 준비한 후, 수집된 총 조직에서 60g을 옮기는 조직을 500ml 멸균 Helen Meyer 플라스크로 나눕니다.

조직이 들어있는 플라스크에 조직 분해 혼합물을 넣고 셰이커에서 섭씨 37도에서 45 분 동안 배양합니다. 150RPM에서 배양 후 해리된 세포를 수집하고 플라스크를 기울여 조직이 정착할 수 있도록 합니다. 슈퍼 나틴을 수집하십시오.

UND 분리 조직을 수집하지 않도록 주의합니다. 멸균 15ml 원심분리기 튜브로 옮기기 전에 상등액에 동일한 양의 HBSS를 첨가합니다. 원심분리 후 각 배치에 대해 UND 관련 조직의 나머지 부분에 대해 1000회 분해 및 상등액 채취를 반복합니다.

섭씨 4도에서 15분 동안 중력은 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡입합니다. 태반 융모 세포는 주로 적혈구 위에 있는 펠릿의 흰색 부분에 있습니다. 펠릿의 흰색 부분에 있는 융모 세포를 멸균된 50ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.

세 가지 분해 단계 모두에서 세포를 수집한 후 멸균 50ml 원추형 원심분리기 튜브 상단에 삽입된 100미크론 나일론 세포 여과기를 사용하여 현탁액을 여과합니다. 셀 현탁액의 여과 속도가 느려지면 필터를 위로 들어 올려 섭씨 4도, 중력의 1000배에서 10분 동안 튜브 원심분리기 내부의 진공을 끌어들입니다. 생물학적 안전 후드에서 갓 준비된 하이텐성 용해 배지 또는 HLM을 사용하여 태반 융모 세포를 균질화하기 위해 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하고, 얼음처럼 차가운 HLM의 세포 펠릿 부피의 4배를 세포에 추가합니다.

10ml 피펫을 사용하여 부드럽고 철저하게 소생시킵니다. 세포를 위아래로 피펫팅하여 현탁시킵니다. 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양한 후 얼음 냉각 균질기로 옮기고 20-25번의 부드러운 스트로크를 가하여 느슨한 유봉으로 세포를 천천히 균질화합니다.

3000배 중력과 섭씨 4도에서 10분 동안 용해물을 회전시켜 끊어지지 않은 세포를 제거합니다. 그런 다음 20 분 동안 25, 000 시간 중력 및 섭씨 4도에서 다시 회전하기 전에 상등액을 새 튜브에 모으십시오. 미토콘드리아를 제거하여 초원심분리로 지질 방울을 분리하려면 50ml 원심분리 튜브에 슈퍼 나틴을 수집합니다.

20% 자당으로 조정하고 S SW 28 로터 또는 이에 상응하는 초원심분리기 튜브의 바닥으로 옮기고 밀도 조정된 슈퍼 나틴을 약 10ml의 얼음 냉기, 100밀리몰의 탄산나트륨 완충액 및 0.5-1ml의 얼음 냉기 HLM으로 오버레이하여 130에서 S SW 28 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 튜브를 채웁니다. 중력의 000배와 섭씨 4도의 온도에서 45분 동안 회전합니다. 그런 다음 부유층을 수집하고 10% 자당으로 조정한 다음 SW 41 TI 로터 또는 이에 상응하는 13.2밀리리터 초원심분리기 튜브의 바닥으로 옮기고 밀도 조정 상등액을 약 5밀리리터의 얼음 냉기, 100밀리몰의 탄산나트륨 완충액 및 0.5밀리리터의 얼음 냉기 HLM으로 오버레이합니다. 중력의 000배와 섭씨 4도의 온도에서 60분 동안 회전합니다. SW 41 TI 로터에서 1ml 피펫을 사용하여 지질 방울이 포함된 상단 부유층을 조심스럽게 수집합니다.

부피를 10% 자당으로 조정하고 다시 13.2ml 초원심분리 튜브로 옮긴 후 5ml의 냉냉, 100mmol의 탄산나트륨 완충액 및 0.5ml의 냉식 HLM을 오버레이합니다. 30분 동안 원심분리 한 후 구부러진 PE 피펫을 사용하여 지질 방울이 들어있는 상단의 흰색 부동 층을 100 마이크로 리터의 HLM이 들어있는 3 개의 1.5 밀리리터 튜브에 조심스럽게 모으십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 지질 방울을 특성화합니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 인간 용어 태반 융모 세포에서 분리된 지질 방울의 존재는 중성 지질 특이적 형광 염료 boda P 4 93 5 0 3으로 염색하고 형광 현미경을 사용하여 시각화하여 확인했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 분리된 지질 방울 분획의 순도는 er에 대한 para lippin 2 calnexin, goi marker, 미토콘드리아 및 원형질막에 대한 GM 1 30 CO X four, MEK 1을 포함하는 지질 방울에 대한 마커 단백질을 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 평가되었습니다. 낡은 후, 차가운 아세톤과 함께 지질 방울과 단백질이 추출됩니다. 분획은 Western blotting para lipin에 적용되었습니다.

둘째, 지질 방울 단백질은 핵 상등액 후 및 지질 방울을 포함하는 고립된 흰색 부유층에서 검출되었습니다. MK one 및 GM one 30과 같은 원형질막에 특이적인 단백질은 스핀 4 및 스핀 5에 대한 부유층 아래의 어느 층에서도 지질 방울 분획이 검출되지 않았습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 단백질 칼넥신(calnexin)과 미토콘드리아 막 단백질 CO X 4의 약한 염색이 지질 방울 분획의 다른 곳에서 검출되었습니다.

이러한 결과는 지질 방울이 포유류 세포의 미토콘드리아와 상호 작용하고 ER r과 상호 작용한다는 것을 보여주는 이전 보고서와 일치합니다. 이 절차에 따라 단백질체학 및 지질체학 방법과 같은 다른 방법을 수행하여 방울에 어떤 요인이 결합되어 있는지와 같은 추가 질문을 연구할 수 있습니다.