Name: 세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 효모 세포와 인간 태반에서 밀도 구심 분리법을 이용하여 세포 지질 방울을 분리하는 방법을. 웨스턴 블롯 분석으로 순도를 확인하고 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 PD에 PD로 미국 심장 협회 (American Heart Association) 상 13SDG14500046, 지속 가능한 에너지 교육 및 연구 센터 상 (테네시 Univ.의)에 의해 지원되며, JM에 대한 의사의 의학 교육 및 연구 재단 (테네시 Univ.의)에 의해 수상했다 그의 떨고 인큐베이터, 탁상 원심 분리기, 웨스턴 블롯 분석 장비의 사용 에릭 T. Boder (테네시 Univ.의), 저자는 spheroplasts에 분열 효모를 변환하는 프로토콜 캐롤라인 Leplante (. 예일 대학교를) 감사를위한 센터 자신의 초 원심 분리기의 사용 환경 생명 공학 명 (대학 테네시), 효모 항체 귄터 다음 세대 (그라츠 대학 기술, 오스트리아.) 기술 지원 산부인과 명 (대학 테네시 의료 센터)의 부서의 직원 .

1. (분열) 효모 세포에서 지질 방울을 분리 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애의 신진 인기 모델 생물에서 물방울의 분리는 다음 프로토콜 6과 거의 동일합니다. 준비의 차이가 설명되어 있습니다. 1. 성장 효모 세포 <ol><li> 미디어를 준비합니다. 유리 병 또는 배양 플라스크에 dH보다 2 O 리터당 YE5S 분말 36g을 결합합니다. 미디어의 약 2 L이 필요합니다. 20 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 미디어가 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다. S.에 대한 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 YPD와 YE5S를 교체합니다. </li><li> 무균 기술을 사용하여 250 ㎖의 배양 플라스크에 냉각 YE5S 미디어의 10 ~ 20 ㎖를 놓습니다. 멸균 나무 막대기를 사용하거나 동등한 한천 플레이트에서 효모 세포의 소량의 매체를 접종한다. 세포가 30 ℃에서 원하는 광학 밀도로 성장하자 에서 광학 밀도를 측정분광 광도계를 사용하여 595 ㎚의 파장. </li><li> 2.8 L 플라스크에 남아있는 용지를 넣습니다. 진탕 배양기에서 세포 성장하는 동안 적절한 혼합을 보장하기 위해 미디어 2.8 L 당 플라스크의 1 더 이상으로보다 L을 사용합니다. 젖은 세포의 최종 수율은 프로테옴 lipidomic 분석을 위해 충분한 지질 방울을 취득 할 수 있도록 약 10 g으로한다. </li><li> 각 단계 1.1으로 제조 하였다 미디어 1 L를 갖는 2.8 L 플라스크에 1.2 단계에서 세포를 소개합니다. </li><li> 30 ° C에서 원하는 농도로 세포를 성장 </li><li> 세포가 지질 방울을 가지고 있는지 확인합니다. 세포의 준비 1 ㎖. 샘플의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 샘플 세포의 OD 당 에탄올에 BODIPY 503분의 493의 100 ㎜ 주식의 0.1 ML을 추가합니다. 유리 슬라이드와 유리 커버 슬립 사이의 샘플 3 μL를 놓습니다. GFP 필터 (그림 1A)과 형광 현미경으로 시각화. </li><li> 4 &amp; #에서 단계 1.5에서 세포 펠렛176, C 10 분 동안 3,800 XG에. 원심 분리기 튜브의 용량에 따라 일괄 적으로 작동한다. </li><li> YE5S 미디어를 붓고 소르비톨 EMM + 600 mm의 버퍼로 세포를 씻어. 소르비톨은 삼투 지원을 제공합니다. </li><li> 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송하고 10 분 동안 2,000 XG에서 4 ° C에서 세포 펠렛. 뜨는을 제거합니다. 젖은 세포를 무게. 셀 그램 당 (EMM + 600 mM의 소르비톨) 버퍼의 2 ml의 세포를 Resuspend. </li></ol> 2. spheroplasts 이후의 용해에 분열 효모 세포를 변환 <ol><li> ) 효모 세포 용해 효소를 5 mg의 1을 각각 추가, 2) 효모 트리코더마 harzianum 그램 당 단계 1.9에 무게했다 젖은 세포에서 효소를 용균. S.에 대한 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 Zymolyase 같은 양의 효소를 증가. </li><li> 60 분 동안 100 rpm으로 흔들어 부드러운에서 30 ° C에서 세포를 품어. </li><li> spheroplasts 지질 박사가 있는지 확인하십시오oplets. 단계 1.6 (그림 1B)를 반복하여. </li></ol> 3. 밀도 구배 원심 분리 <ol><li> 5 분 2,000 XG에서 4 ° C에서 원심 분리하여 spheroplasts 펠렛. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 얼음 차가운 10 mM 트리스 - 염산, 소르비톨 600 ㎜, 200 μM EDTA와 펠렛 spheroplasts을 재현 탁. spheroplasts 매우 깨지기 있음을 알아 두셔야합니다. </li><li> 3.1 단계에서와 동일한 설정을 사용하여 다시 spheroplasts 펠렛. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 2 ㎖ / g-세포의 농도로 12 % 피콜있는 플라스틱 전송 피펫, 10 mM 트리스 - 염산, 200 μM EDTA를 사용 spheroplasts를 재현 탁. </li><li> 유리 균질에 재현 탁 spheroplasts를 전송하고 부드럽게 유리 균질의 느슨한 피팅 유 봉, 얼음에 20 ~ 30 스트로크를 균질화. </li><li> 원심 분리기 튜브에 용해 spheroplasts를 전송하고 같은 할머니와 오버레이12 % 피콜, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 완충액 LUME. 각각의 관은 3 분의 2 가득 차있는 것을 사용하는 원심 분리기 튜브의 수를 선택합니다. </li><li> SW28 로터 또는 이에 상응하는 1.5 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 부드럽게 피펫 또는 구부러진 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 원심 분리 관 (들)에 방울을 포함하는 상위 떠있는 하얀 층 (그림 2A)를, 전송할 수 있습니다. 이 원심 관의 약 3 분의 1을 채우도록 시료에 충분한 12 % 피콜 부피, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 버퍼를 추가. </li><li> 새로운 원심 분리 관 (들)의 샘플 (들)의 상단에 해당하는 8 % 피콜의 양, 10 MM 트리스 - 염산, 200 μM의 EDTA 버퍼를 추가합니다. 이 첨가 후, 튜브는 전체 3 분의 2이어야 버퍼. </li><li> SW28 로터 또는 동급에서 1 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 해안에 회 전자를 허용 (ROTOR 감속 = 0). </li><li> 부드럽게 피펫 또는 구부러진 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 원심 분리 관 (들)에 방울을 포함 할 최고 떠있는 하얀 층 (그림 2B)를 전송합니다. 이 원심 관의 약 3 분의 1을 채우도록 샘플, 소르비톨 8 % 피콜, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 완충액을 600 mM의 추가. </li><li> 새로운 원심 분리 관 (들)의 샘플 (들)의 정상에, 소르비톨 10 MM 트리스 - 염산을 250 ㎜의 동등한 볼륨을 추가, 200 μM의 EDTA 버퍼. 이 첨가 후, 튜브는 전체 3 분의 2이어야 버퍼. </li><li> SW28 로터 또는 동급에서 1 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 투석 튜브에 만 지질 방울과 결합 단백질을 포함하고 피콜을 제거하기 위해 10 mM 트리스 - 염산과 200 μM EDTA 버퍼에 O / N을 dialyze한다 최고 백색 층 (그림 2C)를 전송합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 인간의 태반 융모 세포에서 지질 방울을 분리 태반은 싱글 임신 전에 용어의 자발적인 노동의 발병에 선택적 제왕 절개 배달을 겪고있는 건강한 여성에서 수집되었다. 주제는 태반의 수집에 대한 서면 동의서를 주었다. 태반의 수집 및 후속 사용은 녹스빌 기관 검토위원회의 테네시 의학 테네시 대학 대학원 대학 (각각 # 1 8757B 및 # 3338)에서 승인을 수행 하였다. 1. 인간의 태반 융모 세포를 분리 프로토콜의 1 부 Petroff 등. (26)에 의해 이전에 발표 된 프로토콜의 변형입니다 솔루션 다음과 같은 준비 <ul><li> 염화나트륨 (1 L) : 1 L 용액을 수득 dH보다 2 O에 9g의 NaCl (M 58.4 g / 몰)을 용해. 소독 필터 (0.2; μm의 막). </li><li> 배 행크의 균형 소금 솔루션 (10X HBSS) (1 L) : 4g의 KCl (M 74.5 g / 몰), 0.6 g의 KH 2 PO 4 (M 136.086 g / 몰), 80g의 NaCl (M 58.44 g / 몰) 10g의 D-글루코오스 (M 180.16 g / mol)의 2 HPO 4 (M 141.96 g / mol)의 NA. 1 L 용액을 수득 dH보다 2 O에서 각각의 성분을 용해. 소독 필터 (0.2 ㎛ 멤브레인). </li><li> 효소 소화 버퍼 (0.6 ㎖) : 3.3 ml의 7.5 % 나 Biscarbonate, 17.5 ㎖의 1 M HEPES 및 266.1 ㎖의 dH보다 2 O와 70 ㎖의 10 배 HBSS를 결합, 소독 필터 (0.2 ㎛의 막). 4 ℃에서 보관 </li><li> DNA 분해 효소 I : 그냥 사용하기 전에, DNA 분해 효소의 유리 병에 5 ㎖ 멸균 0.9 %의 NaCl을 추가합니다. -20 ° C에서 사용하거나 보관 할 때까지 얼음에 보관 </li></ul><ol><li> 해부를위한 준비 태반 <ol><li> 인간 태반 가능한 배달 시간에 가까운 과정을 구합니다. 이러한 태반을 수송하는 쿨러​​로 밀폐 용기를 사용합니다. 때 손을 항상주의하십시오링 인간의 생물학적 물질. </li><li> 생물학적 안전 후드에서 멸균 고압 증기 멸균 용기에 태반을 전송하고, 신중하게 멸균 0.9 % 염화나트륨 (염분) 용액을 이용하여 태반과 세포막에서 혈액을 씻어. 액체 생물학적 폐기물로 1 L 비이커에 피 묻은 염분을 폐기하십시오. </li><li> 부드러운면이 위를 향하고 탯줄 베어링과, 무균 영역에서 태반을 놓습니다. 샤프, 미세 포인트 가위와 집게로 태아 막 탯줄을 제거합니다. </li><li> 산모의 표면 (거친 표면)이 위로 오도록 태반을 뒤집습니다. 위에 놓인 기초 판의 조직, 표면으로부터 약 3mm를 제거합니다. </li></ol></li><li> 태반을 해부 <ol><li> 융모 판을 피하고 한 번에 하나의 떡잎을 해부하다. 식염수 250 ㎖의 비이커에 융모 조직을 수집합니다. </li><li> 액체 폐기물의 1 L 비이커를 사용하여 집게로 소용돌이 치는 0.9 % NaCl로 별도의 비커에 조직을 여러 번 씻어. </li><li> 150mm 배양 접시에 한 번에 한 자엽을 전송. 집게로 잡고 페트리 접시에 배에서 면도날로 조직을 다 쳤어요. 0.9 %의 NaCl을 포함하는 별도의 비커에 스크랩 한 조직을 놓습니다. 모든 조직의 조각에 대해 반복합니다. </li><li> 세포 분리 체에 조직의 작은 부분을 전송하고 용출액이 명확해질 때까지 광범위하게 0.9 % NaCl로 씻어냅니다. 모든 조직에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 세포 분리 체에 스크랩 한 조직을 세척 한 후 물기와 무게를 배수. 이 시점에서 조직을 DMEM에서 4 ° C에서 멸균 삼각 플라스크에 O / N을 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 태반 조직의 효소 소화 <ol><li> 데워진 효소 희석액 100 ㎖, 1 ㎖ DNase의 I 및 20 ㎖의 2.5 % 트립신 10X : 티슈 소화 혼합물을 제조한다. </li><li> 500 ㎖ 멸균 삼각 플라스크에 총 수집 된 조직 (일반적으로 250-300 g)를에서 60g을 전송, 조직을 나눈다. </li><l난&gt; 조직을 포함하는 삼각 플라스크에 조직 소화 혼합물을 추가하고 150 rpm에서 45 분 동안 진탕에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol></li><li> 해리 세포를 수집 <ol><li> 조직이 정착 될 때까지 처음 45 분 해리 후, 경사에서 소화 플라스크를 설정합니다. </li><li> 해리되지 않은 조직을 수집하지 않도록주의하면서 상층 액을 수집합니다. 수집 된 상층 액에 HBSS의 동일한 금액을 추가하고 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 해리되지 않은 조직의 추가 부분과, 해리되지 않은 조직과 단계 3.2부터 절차를 반복합니다. </li><li> 15 분 1,000 XG에서 4 ° C에서 균질를 원심 분리기. </li><li> 각 배치의 경우, 원심 분리 다음, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. 태반 융모 세포는 적혈구를 덮는, 펠릿의 흰 부분에 우세하다. </li><li> 세인트 융모 세포 (펠렛의 흰색 부분)로 이동50 ㎖에게 원뿔 원심 분리 관을 erile 얼음 계속. </li><li> 세 소화 단계에서 세포를 수집 한 후, 멸균 50 ㎖ 원추형 원심 분리 관의 상단에 삽입 100 μM 나일론 세포 여과기를 이용하여 현탁액을 고를. 세포 현탁액의 여과 속도가 느려 경우, 튜브 내에서 진공을 그립니다 필터를 위로 들어 올립니다. </li><li> 10 분 1,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 2. 태반 융모 세포를 균질화 <ol><li> 분리 과정을 시작하기 전에, 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 1 mM의 EDTA를 포함 저장성 용해 중간 (HLM) 50 ㎖를 준비합니다. 사용 직전에 HLM에 단백질 분해 효소 억제제를 추가하고 얼음에 매체를 유지합니다. </li><li> 생물학적 안전 후드에서, 세포에 빙냉 HLM의 4 배 세포 펠렛 부피를 추가한다. 부드럽게하고 철저하게 세포를 피펫 팅하여 세포를 재현 탁 업10 ㎖ 피펫을 사용하여 D 다운. </li><li> 10 분 동안 얼음에 일시 중단 된 세포를 품어. </li><li> 얼음에 있어야 다운스 균질에 세포를 전송합니다. 천천히 균질의 헐렁한와 유 봉, 20-25 부드러운 스트로크를 적용하여 세포를 균질화. </li><li> 원심 분리기는 10 분 동안 3,000 XG에 4 ° C에서 세포 용 해물은 손상되지 않은 세포, 세포 파편과 핵을 제거합니다. </li><li> 상층 액을 수집하고 SW28 튜브 (25,000 XG에서 원심 분리 할 수​​있는 대안)에 전송할 수 있습니다. 미토콘드리아를 제거하는 20 분 동안 25,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. </li></ol> 3. 초 원심 분리에 의해 지질 방울을 분리 <ol><li> 50 100 밀리미터 탄산나트륨 (M 106g / 몰) 완충액 (pH 11.5)의 ㎖ 및 50 ㎖의 60 % 자당 (W / W) 솔루션을 준비합니다. 사용 직전에 탄산나트륨 버퍼에 프로테아제 억제제를 추가하고 얼음에 보관. </li><li> 조정, 50 ㎖ 원심 관에 단계 2.6에서 뜨는 수집SW28 로터 또는 이와 동등한에 대한 초 원심 분리기 튜브의 바닥에 자당 및 전송의 20 %. ~ 빙냉 100 mM의 탄산나트륨 완충액 (pH 11.5) 10 ㎖ 및 튜브를 채우기 위해 빙냉 HLM의 0.5-1 ml의 오버레이와 밀도를 조정 상등액. </li><li> SW28 스윙 버킷 로터를 사용하여 45 분 동안 130,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 10 % 자당에 조정 SW41Ti 로터, 또는 동등의 13.2 ML 초 원심 분리기 튜브의 바닥으로 전송, 부동 층을 수집합니다. 오버레이 밀도 약 5 빙냉 100 mM의 탄산나트륨 완충액 (pH 11.5) ml의 빙냉 HLM 0.5 ml의 상등액을 조정. </li><li> SW41Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 60 분 동안 274,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. (로터 감속 = 0) 지질 방울 층의 혼란을 최소화하기 위해 정지 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 조심스럽게 들어있는 최고 부유 계층 (그림 2D)를 수집1 ㎖ 피펫 단계를 반복 3.4과 지질 방울. </li><li> SW41Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 30 분 동안 274,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 조심스럽게 100 μL의 HLM을 포함하는 세 1.5 ML 튜브에 구부러진 파스퇴르 피펫과 지질 방울을 포함하는 상위의 흰색 부동 층을 수집합니다. </li></ol> 특성화 지질 방울 분획 (프로토콜 1, 2) 지질 방울 부분의 복구 및 순도는 빛이나 전자 현미경과 함께 서양의 얼룩에 의해 확인 될 수있다. 또 다른 원심 분리 단계 후에 분액 수집 될 수 있고, 정화 효율을 결정하기 위해 유지. 웨스턴 블 롯팅에서, t에 다른 막 분획에 지질 방울을 비교보다는 전체 세포 용 해물의 등가를 나타내는 지질 액적 분획의 양을 비교하는 것이 더 적절하다총 단백질 함량의 24 그는 기초.

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

<html> 이 프로토콜 내에서 중요한 단계 배양 세포의 성장하는 동안 미디어 및 세포 밀도와 일치해야합니다. 세포 지질 방울들이 관련된 단백질이 세포가 배양 된 17되는 환경에 크게 의존한다는 점에서 독특합니다. 따라서, 세포가 성장되어있는 미디어와 세포의 밀도는 밀접 용해 전에 모니터링해야한다. 지질 방울의 단백질 조성물은 효모 세포의 성장 단계의 함수이다. 간단히 단백질 정지상 대 로그 성장 단계에서 방울에 결합 될 것이다. 또한, 효율 spheroplasting 것은 효모 세포의 성장 단계의 함수이다. 후자는 효소 치료에 저항하기 때문에 로그 성장 단계에있는 세포는 정지 단계에서 세포보다 spheroplasts의 높은 수율을해야합니다. 십t &quot;&gt; <p class=...

세포의 지질 방울은 세포의 여러 기능을 제공 동적 세포 기관이다. 이들은 에너지로 변환하거나 인지질 합성을 위해 사용될 수있다 중성 지질, 스토리지 허브이다. 방울은 동맥 경화증, 비만과 관련된 대사 질환 등의 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 중심 역할을하고, 또한 전염병 1,2. 또한, 그들은 바이오 디젤 연료에 대한 흥미로운 소스입니다. 지질 방울의 세포 역할에 대한 많은 정보가 광범위한 생물 3에서 정제 방울의 프로테옴 lipidomic 분석에서 얻을 수있다. 이 생명체는 박테리아 4,5, 효모 6-11 포함 12,13 식물, 14 선충, 그리고 15, 16 비행했다. 인간 대사 질환에서 지질 소적의 역할에 관심을 감안할 때, 액적 또한 배양 된 동물 세포에서 분리 된nimal 조직. 배양 세포주는 3T3-L1 지방 세포 (17), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 K2 18 인간 hepatocyes 19,20 및 상피 세포 라인 (21)을 포함했다. 물방울이 고립되어있는 동물 조직 마우스 골격근 22 일 간 (23) 및 유 방 땀 샘 (23)를 포함했다. 전술 한 바와 같이, 대부분의 액적 분리 연구의 목표는 결합 계수 및 중립 및 인지질에 lipidomic 분석 프로테옴 분석을 수행하는 것이다. 중성 지질시기 - 지질 방울의 대부분의 수많은 구성 요소 - 대부분의 다른 세포 물질보다 밀도이며, 액적 분리 전통적 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 수행되었다. 그 기술은 여기에 제시된 두 수험 공부의 중심이다. 이전 기술 6,24은 배양 분열 효모 세포에서 물방울의 분리의 시각적 표현으로 결합 및 수정및 noncultured 인간의 세포는 태반 조직에서 얻을. 목표는 액적 분리를위한 시작점으로서이 크게 다른 세포 유형을 선택하여이 기술의 광범위한 응용을 보여주는 것이다. 이 기술은 대부분의 생물에서 물방울을 분리하고자하는 사람들에게 유용하게 쓰일 수있을 것이다. 프로토콜 하나는 진핵 세포 분열 (25) 중에 액적 형성을 관찰하기위한 모델로서 이용되어왔다 분열 효모 Schizosaccharomyces 용의 pombe로부터 지질 방울의 분리를 설명한다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애 지질 방울 생물학 연구의 모델 생물로 광범위하게 사용되어왔다. 프로토콜 1 생물과 준비의 차이 모두에 적용이 강조된다. 프로토콜 2는 인간의 장기 태반에서 얻을 수 차례에 태반 융모 세포에서 지질 방울의 분리에 대해 설명합니다.용어 태반의 수집은 안전하고 윤리적으로 지질 방울의 상당한 숫자가 포함 쉽게 사용할 수 인체 조직 26, 200-250 g을 수득 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 이것은 물방울이 배양 된 세포에서 발생한 높은 진핵 가장 지질 액적 분리 작업 대조적이다. 그 연구에서, 지방산은 종종 중성 지질 따라서 방울의 성장의 합성을 촉진하는 문화에 추가됩니다. 이 지질 방울는 태반 조직의 기본 조건이 형성되어 여기에 작업 대조적이다. 지질 방울 분획의 순도는 소기관 마커 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된다. 이 두 프로토콜은 다음, 프로테옴 lipidomic 분석에 적합한 지질 방울 분수를 얻을 것입니다.

<table><tbody><tr><td>프로토콜 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. 효모 세포를 성장시키고 스페로플라스트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>로 전환Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 5가지 보충제(YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S 미디어(각 보충제 225mg/ml): 아데니니, 히스티딘, 류신, 라이신, 우라실. 싹을 틔우는 효모에 해당하는 것은 YPD입니다.</td></tr><tr><td>YPD 분말</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>S. cerevisiaeSorbitol</td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>효모 용해 효소</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma harzianum의 용해 효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T Sunrise</td><td>Science Products</td><td>N0766391</td><td><>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>1 L 유리병</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250ml 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.8L 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력>2. 효모 지질 방울 분리</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>자극제</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 25 mm x 89 mm (SW28용)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por 투석 멤브레인</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 쉐이커</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR 원심분리기</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기 로터</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6X100Y 고정각 로터</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 초원심분리기 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>프로토콜 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강한>1. 태반 융모 세포 격리</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 언더패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 팬(용기), 3L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위, 날카롭고 곧은</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>1406011</td> 런던 펜치 파인 사이언스 도구 1108002 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>CD-1용 스크린 컵</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 메시 스크린&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 세포 염색기 100 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150mm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>피셔 사이언티픽</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신 10x</td><td>인비트로겐</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 등급 II, 소 췌장에서 채취</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 삼각 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><강한>2. 융모 태반 세포에서 지방 방울 분리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>자극제</td></tr><tr><td>Dounce 호모게나이저&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 25 mm x 89 mm (SW28용)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>초투명 원심분리기 튜브 14 mm x 89 mm (SW41용)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 후드&nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조,</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 온도 제어 쉐이커</td>, <td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr>, <tr><td>Thermo Sorvall Legend, XTR 원심분리기</td><td>, Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기 로터</td>, <td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 초원심분리기 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti 초원심분리기 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>희석 1:15,000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 안티-마우스 IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>희석 1:5,000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris 겔</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Primary 항체 Protocol 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>선물 Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>희석 1:5,000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu; g/ml</td></tr> 오스트리아 G<tr><td>. Daum</td><td>Graz 공과 대학</td> 박사의<td>Por1p</td><td>희석 1:5,000</td></tr><tr>오스트리아 G<td>. Daum</td><td>Graz 공과 대학</td> 박사의<td>Pma1p</td><td>선물 희석 1:10,000</td></tr><tr><td>Vma1p(ATP6V1A 방지)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0.5 &mu; </td></tr><tr><td>프로토콜 2에 대한 g/ml1차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2 (anti-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>2679</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>희석 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4850</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>희석 1:50</td></tr></tbody></table>

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

지질 방울은 대부분의 진핵 및 원핵 특정 세포에서 발견 될 수있는 동적 소기관이다. 구조적으로, 방울 인지질 단층으로 둘러싸인 중성 지질의 핵심으로 구성되어 있습니다. 액적 셀룰러 역할을 결정하는데 가장 유용한 기술 중 하나는 작은 방울과 함께 단리 할 수​​있다 결합 단백질의 프로테옴 식별되었다. 분열 효모 및 인간의 태반 융모 세포 : 여기, 두 가지 방법은 두 개의 광범위한 진핵 생물에서 지질 방울과 그들의 결합 된 단백질을 분리 할 수​​ 있도록 서술되어있다. 두 기술의 차이가 있지만, 주요 방법 - 밀도 구배 원심 분리 - 모두 준비가 공유됩니다. 이 제시 액적 분리 기법의 넓은 적용 가능성을 보여준다. 첫 번째 프로토콜에서 효모 세포는 세포벽의 소화 효소에 의해 spheroplasts로 변환됩니다. 그 결과 spheroplasts는 신사된다LY는 헐렁한 균질화에 용해. 피콜은 밀도 구배를 제공하기 위해 파쇄물을 첨가하고, 혼합물을 세 번 원심 분리된다. 첫번째 스핀 후, 지질 방울을 소포체 (ER), 세포막과 액포 함께 원심 분리기 튜브의 하얀색 부동 층에 지역화된다. 두 개의 연속 스핀은 다른 세 가지 세포 기관을 제거하는 데 사용됩니다. 결과는 작은 방울과 결합 단백질을 가지고 층이다. 두 번째 프로토콜에서, 태반 융모 세포는 트립신과 DNA 분해 효소 나 세포가 느슨한 맞는 균질의 균질화되어있는 소화 효소에 의해 인간의 장기 태반에서 격리됩니다. 저속 및 중속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포, 세포 파편, 핵, 미토콘드리아를 제거하는 데 사용됩니다. 자당은 밀도 구배를 제공하기 위해 파쇄 액에 첨가하고, 혼합물을 다른 cellula로부터 지질 방울을 분리하기 위해 원심 분리R 분수. 두 프로토콜의 지질 방울의 순도는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된다. 모두 최상의 상태로 준비에서 물방울 분수 이후 프로테오믹스 및 lipidomic 분석에 적합하다.

예상대로 밀도 구배 원심 분리에 근무하는 경우, 부동 층은 지질 방울을 포함해야하고, 고속 스핀의 진행 내내 다른 소기관 고갈 될. 프로토콜 1의 경우, 웨스턴 블롯 마커 지질 방울 (Erg6p)에 대한 항체, 효모, ER (Dpm1p), 미토콘드리아 (Por1p)의 지질 방울과 상호 작용하는 것으로 밝혀졌다 세포 기관으로 수행하고, 세포막 (Pma1p), 및 액포 (Vma1p). 각 3 스핀의 부동 층 (단계 3.7, 3.10, 3.13)가 수집 된 같은 부피는, 트리클로로 아세트산 (15 % 최종 농도)로 침전, 물에 용해. 13 세포 용 해물의 ML (도 3a, &quot;리스&quot;)와 각 3 돕니 단백질 프렙 (도 3a, &quot;Spin1&quot;, &quot;Spin2&quot;및 &quot;Spin3&quot;)은 니트로 셀룰로오스로 전달, 1...

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

이 절차의 전반적인 목표는 조직에서 지질 적립(lipid droplets)을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 태반 조직을 해부하고 분리함으로써 수행됩니다. 그다음으로, 올레인(olein)의 세포를 균질화합니다.그 다음, 여러 단계의 원심분리 과정을 통해 세포 소기관들을 분리합니다. 마지막으로, 지질 방울이 포함된 부유층을 수집하여 지질 방울의 특성을 분석합니다. 최종적으로, 형광 현미경 관찰과 웨스턴 블롯 분석을 통해 지질 방울 분획의 순도를 확인합니다.이 기술의 주요 장점은 대부분의 대동맥 세포에서 지질 방울을 분리할 수 있다는 점입니다. 특정 조직의 경우, 방울의 수가 적어 부유 G 층과 방울의 수가 감소할 수 있음에 유의하십시오. 태반은 정기 분만 전 선택적 제왕절개술을 받는 단태 임신의 건강한 여성들로부터 수집되었으며, 대상자들은 태반 수집에 대해 서면 동의서를 제출하였습니다.태반의 수집 및 이후 사용은 테네시 대학교와 녹스빌 소재 테네시 대학교 의과대학원 IRB(기관생명윤리위원회)의 승인을 받아 수행되었습니다. 생물안전 작업대 내에서 태반을 멸균된 오토클레이브 가능 용기로 옮기고, 멸균 식염수를 사용하여 태반과 막에서 혈액을 조심스럽게 세척합니다. 혈액이 섞인 식염수는 1L 비커에 담아 액체 생물학적 폐기물로 폐기하십시오.멸균된 작업대 위에 탯줄이 있는 매끈한 표면이 위로 향하게 태반을 놓은 후, 끝이 날카롭고 가는 가위와 포셉을 사용합니다. 탯줄과 태아 막을 제거합니다. 그다음, 태반을 뒤집어 모체 표면이 위를 향하게 합니다.그런 다음 표면에서 약 3mm 깊이의 상부 기저판 조직을 제거합니다. 융모막판을 피해 COTA leadin을 한 번에 하나씩 박리하고, 융모 조직을 생리식염수가 담긴 250mL 비커에 수집합니다. 그런 다음 0.9% 멸균 생리식염수와 핀셋을 사용하여 별도의 비커에서 조직을 여러 번 헹구며, 이때 1L 비커를 폐액 수거용으로 사용하여 용액을 소용돌이치게 섞어줍니다.codi leadin을 한 번에 하나씩 150 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 포셉으로 잡고 면도날을 사용하여 혈관에서 조직을 긁어 페트리 접시에 담습니다. 긁어낸 조직을 0.9% 멸균 식염수가 들어 있는 별도의 비커에 넣습니다.모든 조직 조각에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포 해리 용액으로 긁어낸 조직을 헹군 후, 과잉 액체를 제거하고 태반 조직을 소화시키기 위해 무게를 잽니다. 조직 소화 혼합물을 준비한 후, 수집된 전체 조직 중 60 grams를 500 milliliter 멸균 Helen Meyer 플라스크로 옮겨 분할합니다.조직이 들어 있는 플라스크에 조직 소화 혼합물을 첨가하고, 셰이커를 이용하여 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 150 RPM으로 설정하며, 배양 후 플라스크를 기울여 조직이 가라앉게 한 뒤 해리된 세포를 수집합니다. 상층액을 수집하십시오.분리되지 않은 UND 조직이 수집되지 않도록 주의하십시오. 상층액을 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기기 전, 상층액과 동일한 양의 HBSS를 첨가하십시오. 1000 times로 원심 분리한 후, 각 배치별로 남은 UND 결합 조직에 대해 해리와 상층액 수집 과정을 반복하십시오.4°C에서 15분 동안 원심 분리한 후, 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 태반 융모 세포는 주로 적혈구 위에 층을 이룬 펠릿의 흰색 부분에 존재합니다. 펠릿의 흰색 부분에 있는 융모 세포를 멸균된 50 mL 원추형 원심 분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.세 단계의 소화 과정에서 수집한 모든 세포를 멸균된 50 milliliter 원추형 원심 분리관 상단에 삽입한 100 micron 나일론 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 여과합니다. 세포 현탁액의 여과 속도가 느려지면 필터를 위로 들어 올려 튜브 내에 진공을 형성한 후, 4 °C, 1000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 펠릿이 섞이지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 생물 안전 작업대(BSC) 내에서 갓 제조한 저삼투압 용해 배지(hypotonic lysis medium, HLM)를 사용하여 태반 융모 세포를 균질화하며, 세포 펠릿 부피의 4배에 해당하는 얼음처럼 차가운 HLM을 세포에 첨가합니다.10 milliliter 피펫을 사용하여 세포를 부드럽고 충분히 재현탁합니다. 피펫팅을 통해 세포를 부유시킵니다. 세포를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 차가운 균질기로 옮기고 헐겁게 끼워진 유발을 사용하여 20~25회 부드럽게 문질러 세포를 천천히 균질화합니다.파쇄액을 3000 ×g, 4°C에서 10분간 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포를 제거합니다. 그 후 상층액을 새 튜브에 수집하고, 다시 25,000 ×g, 4°C에서 20분간 원심분리합니다. 초원심분리를 통해 미토콘드리아를 제거하고 지질 방울을 분리하기 위해, 상층액을 50 mL 원심분리 튜브에 수집합니다.sucrose 농도를 20%로 조절한 후 S SW 28 로터 또는 이에 상응하는 초원심분리관 바닥에 옮깁니다. 밀도를 조절한 상층액 위에 약 10 mL의 얼음처럼 차가운 100 mM sodium carbonate buffer와 0.5~1 mL의 얼음처럼 차가운 HLM을 추가하여 튜브를 채웁니다. S SW 28 스윙 버킷 로터 원심분리기를 사용하여 130,000 ×g, 4 °C에서 45분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 부유층을 수집하고 sucrose 농도를 10%로 조절한 후, SW 41 TI 로터 또는 이에 상응하는 13.2 mL 초원심분리관 바닥에 옮깁니다. 밀도를 조절한 상층액 위에 약 5 mL의 얼음처럼 차가운 100 mM sodium carbonate buffer와 0.5 mL의 얼음처럼 차가운 HLM을 추가합니다. 274,000 ×g, 4 °C에서 60분 동안 원심분리합니다. SW 41 TI 로터에서 1 mL 피펫을 사용하여 지질 방울이 포함된 최상단 부유층을 조심스럽게 수집합니다.부피를 10% sucrose로 조절하고 다시 13.2 milliliter 초원심분리기 튜브로 옮긴 후, 얼음처럼 차가운 100 millimolar 탄산나트륨 완충액 5 milliliters와 얼음처럼 차가운 HLM 0.5 milliliters를 층으로 덮어줍니다. 30분 동안 원심분리한 후, 굽은 PE 피펫을 사용하여 지질 방울이 포함된 상단의 흰색 부유층을 100 microliters의 HLM이 들어 있는 3개의 1.5 milliliter 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 이 그림에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 지질 방울의 특성을 분석하며, 인간 term 태반 융모 세포에서 분리된 지질 방울의 존재는 중성 지질 특이적 형광 염료 boda P 4 93 5 0 3로 염색하고 형광 현미경을 사용하여 시각화함으로써 확인하였습니다.여기에 제시된 바와 같이, 분리된 지질 방울 분획의 순도는 지질 방울 마커 단백질인 perilipin 2, ER 마커인 calnexin, Golgi 마커인 GM130, 미토콘드리아 및 세포막 마커인 COX IV와 MEK1을 이용한 웨스턴 블로팅으로 평가되었습니다. 차가운 아세톤으로 지질 방울을 용해시킨 후 단백질을 추출하였습니다. 각 분획을 perilipin에 대해 웨스턴 블로팅 분석하였습니다.둘째, 지질 방울 단백질이 핵 상층액 및 지질 방울을 포함하는 분리된 백색 부유층에서 검출되었습니다. MK one 및 GM one 30과 같은 세포막 특이적 단백질은 spin four 및 spin five의 부유층 아래 층을 포함한 지질 방울 분획에서 검출되지 않았습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 단백질 calnexin과 미토콘드리아 막 단백질 CO X four의 약한 염색이 지질 방울 분획의 다른 부분에서 검출된 바 있습니다.이러한 결과는 지질 방울이 포유류 세포에서 미토콘드리아 및 ER과 상호작용한다는 이전의 보고들과 일치합니다. 이 절차 이후에, 어떤 인자들이 지질 방울에 결합되어 있는지와 같은 추가적인 질문을 연구하기 위해 프로테오믹스 및 리피도믹스 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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