세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

이 절차의 전반적인 목표는 조직에서 지질 적립(lipid droplets)을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 태반 조직을 해부하고 분리함으로써 수행됩니다. 그다음으로, 올레인(olein)의 세포를 균질화합니다.

그 다음, 여러 단계의 원심분리 과정을 통해 세포 소기관들을 분리합니다. 마지막으로, 지질 방울이 포함된 부유층을 수집하여 지질 방울의 특성을 분석합니다. 최종적으로, 형광 현미경 관찰과 웨스턴 블롯 분석을 통해 지질 방울 분획의 순도를 확인합니다.

이 기술의 주요 장점은 대부분의 대동맥 세포에서 지질 방울을 분리할 수 있다는 점입니다. 특정 조직의 경우, 방울의 수가 적어 부유 G 층과 방울의 수가 감소할 수 있음에 유의하십시오. 태반은 정기 분만 전 선택적 제왕절개술을 받는 단태 임신의 건강한 여성들로부터 수집되었으며, 대상자들은 태반 수집에 대해 서면 동의서를 제출하였습니다.

태반의 수집 및 이후 사용은 테네시 대학교와 녹스빌 소재 테네시 대학교 의과대학원 IRB(기관생명윤리위원회)의 승인을 받아 수행되었습니다. 생물안전 작업대 내에서 태반을 멸균된 오토클레이브 가능 용기로 옮기고, 멸균 식염수를 사용하여 태반과 막에서 혈액을 조심스럽게 세척합니다. 혈액이 섞인 식염수는 1L 비커에 담아 액체 생물학적 폐기물로 폐기하십시오.

멸균된 작업대 위에 탯줄이 있는 매끈한 표면이 위로 향하게 태반을 놓은 후, 끝이 날카롭고 가는 가위와 포셉을 사용합니다. 탯줄과 태아 막을 제거합니다. 그다음, 태반을 뒤집어 모체 표면이 위를 향하게 합니다.

그런 다음 표면에서 약 3mm 깊이의 상부 기저판 조직을 제거합니다. 융모막판을 피해 COTA leadin을 한 번에 하나씩 박리하고, 융모 조직을 생리식염수가 담긴 250mL 비커에 수집합니다. 그런 다음 0.9% 멸균 생리식염수와 핀셋을 사용하여 별도의 비커에서 조직을 여러 번 헹구며, 이때 1L 비커를 폐액 수거용으로 사용하여 용액을 소용돌이치게 섞어줍니다.

codi leadin을 한 번에 하나씩 150 millimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 포셉으로 잡고 면도날을 사용하여 혈관에서 조직을 긁어 페트리 접시에 담습니다. 긁어낸 조직을 0.9% 멸균 식염수가 들어 있는 별도의 비커에 넣습니다.

모든 조직 조각에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포 해리 용액으로 긁어낸 조직을 헹군 후, 과잉 액체를 제거하고 태반 조직을 소화시키기 위해 무게를 잽니다. 조직 소화 혼합물을 준비한 후, 수집된 전체 조직 중 60 grams를 500 milliliter 멸균 Helen Meyer 플라스크로 옮겨 분할합니다.

조직이 들어 있는 플라스크에 조직 소화 혼합물을 첨가하고, 셰이커를 이용하여 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 150 RPM으로 설정하며, 배양 후 플라스크를 기울여 조직이 가라앉게 한 뒤 해리된 세포를 수집합니다. 상층액을 수집하십시오.

분리되지 않은 UND 조직이 수집되지 않도록 주의하십시오. 상층액을 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기기 전, 상층액과 동일한 양의 HBSS를 첨가하십시오. 1000 times로 원심 분리한 후, 각 배치별로 남은 UND 결합 조직에 대해 해리와 상층액 수집 과정을 반복하십시오.

4°C에서 15분 동안 원심 분리한 후, 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 태반 융모 세포는 주로 적혈구 위에 층을 이룬 펠릿의 흰색 부분에 존재합니다. 펠릿의 흰색 부분에 있는 융모 세포를 멸균된 50 mL 원추형 원심 분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.

세 단계의 소화 과정에서 수집한 모든 세포를 멸균된 50 milliliter 원추형 원심 분리관 상단에 삽입한 100 micron 나일론 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 여과합니다. 세포 현탁액의 여과 속도가 느려지면 필터를 위로 들어 올려 튜브 내에 진공을 형성한 후, 4 °C, 1000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 펠릿이 섞이지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 생물 안전 작업대(BSC) 내에서 갓 제조한 저삼투압 용해 배지(hypotonic lysis medium, HLM)를 사용하여 태반 융모 세포를 균질화하며, 세포 펠릿 부피의 4배에 해당하는 얼음처럼 차가운 HLM을 세포에 첨가합니다.

10 milliliter 피펫을 사용하여 세포를 부드럽고 충분히 재현탁합니다. 피펫팅을 통해 세포를 부유시킵니다. 세포를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 차가운 균질기로 옮기고 헐겁게 끼워진 유발을 사용하여 20~25회 부드럽게 문질러 세포를 천천히 균질화합니다.

파쇄액을 3000 ×g, 4°C에서 10분간 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포를 제거합니다. 그 후 상층액을 새 튜브에 수집하고, 다시 25,000 ×g, 4°C에서 20분간 원심분리합니다. 초원심분리를 통해 미토콘드리아를 제거하고 지질 방울을 분리하기 위해, 상층액을 50 mL 원심분리 튜브에 수집합니다.

sucrose 농도를 20%로 조절한 후 S SW 28 로터 또는 이에 상응하는 초원심분리관 바닥에 옮깁니다. 밀도를 조절한 상층액 위에 약 10 mL의 얼음처럼 차가운 100 mM sodium carbonate buffer와 0.5~1 mL의 얼음처럼 차가운 HLM을 추가하여 튜브를 채웁니다. S SW 28 스윙 버킷 로터 원심분리기를 사용하여 130,000 ×g, 4 °C에서 45분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 부유층을 수집하고 sucrose 농도를 10%로 조절한 후, SW 41 TI 로터 또는 이에 상응하는 13.2 mL 초원심분리관 바닥에 옮깁니다. 밀도를 조절한 상층액 위에 약 5 mL의 얼음처럼 차가운 100 mM sodium carbonate buffer와 0.5 mL의 얼음처럼 차가운 HLM을 추가합니다. 274,000 ×g, 4 °C에서 60분 동안 원심분리합니다. SW 41 TI 로터에서 1 mL 피펫을 사용하여 지질 방울이 포함된 최상단 부유층을 조심스럽게 수집합니다.

부피를 10% sucrose로 조절하고 다시 13.2 milliliter 초원심분리기 튜브로 옮긴 후, 얼음처럼 차가운 100 millimolar 탄산나트륨 완충액 5 milliliters와 얼음처럼 차가운 HLM 0.5 milliliters를 층으로 덮어줍니다. 30분 동안 원심분리한 후, 굽은 PE 피펫을 사용하여 지질 방울이 포함된 상단의 흰색 부유층을 100 microliters의 HLM이 들어 있는 3개의 1.5 milliliter 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 이 그림에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 지질 방울의 특성을 분석하며, 인간 term 태반 융모 세포에서 분리된 지질 방울의 존재는 중성 지질 특이적 형광 염료 boda P 4 93 5 0 3로 염색하고 형광 현미경을 사용하여 시각화함으로써 확인하였습니다.

여기에 제시된 바와 같이, 분리된 지질 방울 분획의 순도는 지질 방울 마커 단백질인 perilipin 2, ER 마커인 calnexin, Golgi 마커인 GM130, 미토콘드리아 및 세포막 마커인 COX IV와 MEK1을 이용한 웨스턴 블로팅으로 평가되었습니다. 차가운 아세톤으로 지질 방울을 용해시킨 후 단백질을 추출하였습니다. 각 분획을 perilipin에 대해 웨스턴 블로팅 분석하였습니다.

둘째, 지질 방울 단백질이 핵 상층액 및 지질 방울을 포함하는 분리된 백색 부유층에서 검출되었습니다. MK one 및 GM one 30과 같은 세포막 특이적 단백질은 spin four 및 spin five의 부유층 아래 층을 포함한 지질 방울 분획에서 검출되지 않았습니다. 이전에 보고된 바와 같이, 단백질 calnexin과 미토콘드리아 막 단백질 CO X four의 약한 염색이 지질 방울 분획의 다른 부분에서 검출된 바 있습니다.

이러한 결과는 지질 방울이 포유류 세포에서 미토콘드리아 및 ER과 상호작용한다는 이전의 보고들과 일치합니다. 이 절차 이후에, 어떤 인자들이 지질 방울에 결합되어 있는지와 같은 추가적인 질문을 연구하기 위해 프로테오믹스 및 리피도믹스 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.