양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

이 절차의 전반적인 목표는 표준 광학 현미경 및 이미지 처리를 사용하여 질량 및 부피를 포함한 세포 표본의 기본 물리적 특징을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 유리 커버 슬립에서 자란 세포 표본을 현미경 슬라이드에 장착하여 수행됩니다. 다음으로, 초점을 통해 명시야 및 미분 간섭 대비 이미지를 얻습니다.

그런 다음 이미지의 각 Z 스택을 물리적 데이터를 추출하는 별도의 MATLAB 이미지 처리 프로그램에 입력합니다. 궁극적으로, 세포 표본의 기본 물리적 특성은 명시야 대비 및 미분 간섭 대비 현미경 검사에서 초점 강도 측정을 통해 얻어집니다. 형광 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 표본을 고정, 투과 또는 염색할 필요가 없다는 것입니다.

이 방법은 세포 주기 동안 또는 질병 상태에 기여하는 다른 세포 집단 간에 세포 내 밀도가 어떻게 구성되는지와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DIC 및 명시야 기능과 텍스트 프로토콜에 따른 추가 사양을 모두 갖춘 현미경을 사용하여 슬라이드 북 소프트웨어를 열고 이미지 수집을 위한 새 슬라이드를 만드는 것으로 시작합니다. 그런 다음 초점 창을 열고 필터 세트 섹션에서 DIC를 선택합니다 콘덴서 섹션 아래의 스코프 탭에서 조리개 슬라이드 바를 가장 오른쪽 위치로 조정합니다. 이는 높은 개구수 조명을 제공하고 표본의 광학 절단을 향상시킵니다.

샘플의 DIC 스택을 캡처한 후 포커스 창을 열고 열기를 선택합니다. 필터 세트 섹션에서 조리개 슬라이드 바를 가장 왼쪽 위치까지 조정하고 완전히 닫힌 상태로 조정하여 낮은 NA 조명을 제공합니다. 신호 강도를 조정한 후 이미지 캡처 창을 엽니다.

DICZ 스택 획득의 3D 캡처 설정이 이미지 캡처 창의 필터 세트 섹션에 표시됩니다. 열린 상자를 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서 이미지 이름을 지정하고 시작을 선택하여 Zack 이미지 획득을 시작합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 Z 스택을 내보내 JoVE HT DCO V one M이라는 제목의 H-T-D-I-C MATLAB 프로그램에서 볼륨 측정을 한 번 수행합니다. 섹션 0에서 hilbert가 포함된 디렉토리를 복사하여 붙여넣어 종속성 디렉토리 변수를 업데이트합니다. DM 및 sobel edge 변환 탐색기에서 M 파일을 감지합니다. 작은따옴표 사이에, 종속성 디렉토리는 joco HT DCO V one M 프로그램의 섹션 0을 실행합니다.

섹션 1에서는 점 TIF 형식의 관통 포커스 이미지가 포함된 디렉토리를 복사하여 붙여넣어 이미지 디렉토리를 업데이트합니다. 작은따옴표 사이에서는 이 섹션을 한 번만 실행하여 이미지를 정렬하고 회전합니다. hilbert transform run의 경우 코드 A의 섹션 2에서 Define HT DIC parameters라는 제목의 대화 상자가 나타납니다.

그런 다음 샘플의 DIC 이미지에 초점이 맞춰진 초점면 번호, 측면 해상도, 축 해상도, 힐베르트 변환을 수행하는 데 필요한 DIC 이미지의 회전 각도, 마지막으로 관심 영역 크기를 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 초점면 번호로 지정된 DIC 초점면의 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다.

셀을 비롯한 관심 있는 피처 위에 상자를 놓습니다. 상자가 원하는 영역 위에 배치되면 B 내부를 두 번 클릭합니다. 이미지의 대비는 어두운 부분이 왼쪽에 나타나고 밝은 부분이 오른쪽에 나타나도록 해야 합니다. 파란색 상자를 관심 영역 위로 드래그하고 필요에 따라 모양을 변경합니다.

다음으로, 섹션 3에서 직사각형 마스크를 생성하려면 주석 라인 1 6 7 및 주석 라인 1 7 0 이미지를 클릭하고 마우스를 드래그하여 직사각형 마스크 정의를 시작하여 프로그램의 섹션 3을 실행합니다. 그런 다음 상자를 두 번 클릭하여 수락합니다. 손으로 그린 마스크를 생성하려면 섹션 3을 실행하기 전에 1 행 6 7 및 주석 라인 1 7 0 주석을 답니다 마우스로 원하는 마스크를 클릭하고 그리면 마스크를 두 번 클릭하여 섹션 4를 실행 한 후 수락하여 텍스트 프로토콜 실행 섹션 5에 따라 hilbert 변환 이미지 스택을 구성합니다.

관심 영역의 xz 단면 이미지의 이미지 분할을 최적화합니다. 프로그램에 의해 생성된 그림 500은 세 가지 다른 유형의 대비를 표시하는 것처럼 보입니다. 셀의 테두리를 찾는 알고리즘의 성공 여부는 사용된 마스크와 프로그램의 라인 2, 2, 9에서 임계값 값의 조합에 따라 달라집니다.0.5 값으로 시작하여 임계값 값을 조정하고 열 중 하나에서 적절한 개요가 달성될 때까지 프로그램의 이 섹션을 다시 실행합니다.

DIC 세분화에서 1열에서 개요가 가장 좋았다면 섹션 6을 사용하여 볼륨을 결정하십시오. 2열에서 최적의 결과를 얻은 경우 섹션 7을 실행하여 힐베르트에서 세포 부피를 결정하고, DIC 이미지를 변환하고, 3열에서 최적의 결과를 얻은 IF를 사용하고, 섹션 8을 실행하면서 필터링된 힐베르트 변환 DIC 이미지를 사용하여 NIQ PM MATLAB 프로그램에서 질량 측정을 위한 부피를 결정하고 섹션 0에서 JO VCO NI qpm V1 M이라는 제목을 지정합니다. 섹션 1을 실행한 후 세 디렉토리 종속성, BRIGHTFIELD 및 DIC 디렉토리의 위치를 업데이트하고 N-I-Q-P-M 매개변수 정의라는 제목의 대화 상자에서 섹션 2를 실행하여 샘플의 명시야 이미지에 초점이 맞춰진 초점 평면 번호, 측면 해상도, 축 해상도 및 관심 영역 크기를 입력합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 초점면 번호로 지정된 명시야 초점면의 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다. 필요한 경우 섹션 2를 다시 실행하여 초점을 조정한 후 이미지 주위의 상자를 드래그하고 상자의 노드를 선택한 다음 드래그하여 크기를 조정한 다음 상자 내부를 두 번 클릭하여 적용합니다.

섹션 3을 실행하여 명시야 이미지 스택을 구성하고, 섹션 4를 실행하여 위상 맵, 의사 DIC 이미지를 생성하고, 의사 DIC 및 실제 DIC 이미지가 가능한 한 유사할 때 명시야 이미지 및 실제 DIC 이미지와의 비교를 실행하고, 사용자가 셀의 윤곽을 그려 질량 밀도 맵을 생성할 수 있도록 섹션 5 A 또는 5 B를 실행합니다. 세포 밀도의 총 질량과 히스토그램이 정확합니다. 스루 포커스 이미지 획득 중 샘플 조명은 N-I-Q-P-M 및 H-T-D-I-C 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 이 그림은 폴리스티렌 구와 인간 결장직장 선암 세포주 SW six 20에 대한 DIC 및 명시야 대비 하에서 낮은 NA 및 높은 NA 조명을 보여줍니다.

이 패널은 N-I-Q-P-M에 대한 최적의 이미징을 보여주고 HT DIC에 대한 최적의 이미징을 표시합니다. 이 이미지는 NIQ PM 알고리즘의 매개변수 종속성을 보여주며, 성공적인 구현과 실패한 구현을 모두 강조합니다. 여기에서 우리는 4.8마이크로미터 직경의 폴리스티렌 구의 위상 프로파일을 살펴봅니다.

예상 프로파일은 이론적으로 알려져 있으므로 NIQ PM 재구성과 직접 비교할 수 있습니다. 이 패널은 구의 경계와 내부 모두에서 구의 회절 효과에 대해 얻을 수 있는 최상의 재구성을 제시하여 구의 모든 지점에서 안정적인 재구성을 방지합니다. 구의 중앙 영역은 위상 특성이 알려지지 않은 패널 L 세포 표본에서 볼 수 있듯이 1에서 5%의 백분율 오류로 N-I-Q-P-M으로 캡처할 수 있습니다.

의사 DIC 이미지를 실제 DIC 이미지와 비교하는 절차와 함께 NIQ PMM을 사용하여 선험적으로 재구성할 수 있습니다. N-I-Q-P-M에는 하나의 자유 매개변수가 있습니다. 계산이 중심이 되는 오른쪽 필드 이미지 스택의 평면입니다.

이 중앙 초점면은 의사 DIC 및 실제 DIC 이미지가 가능한 한 비슷하게 보일 때까지 조정해야 합니다. 여기에 제시된 것은 초점이 맞지 않는 의사 DIC 이미지, 최적 의사 DIC 이미지 및 0.9의 조명 NA로 촬영된 세포의 해당 DIC 이미지입니다. 흥미롭게도, 최적 위상 맵과 해당 의사 DIC 이미지가 이러한 패널에 표시된 것처럼 초점이 맞는 명시야 이미지와 반드시 일치하는 것은 아닙니다.

마지막으로, 여기에 도시된 것은 NA가 0.9 조도와 같은 하에서 초점 이미지를 통해 DIC로부터 H-T-D-I-C 이미지 처리 알고리즘에 관련된 단계이며, 힐베르트 변환은 DIC 이미지의 베이스 릴리프를 제거하기 위해 수행됩니다. 이것은 high pass forer filtering에서 제거할 수 있는 광축을 따라 약간의 흐림과 함께 제공됩니다. 이러한 최종 이미지는 전체 세포 부피를 추론하기 위해 표본의 각 단면 평면의 면적을 결정하기 위해 쉽게 분할됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 명시야 광석 차동 대비 이미징에 대한 올바른 조명을 기억하는 것이 중요합니다. 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법은 표본의 밀도 맵과 함께 바닥 힘의 공동 국소화를 사용하여 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.