양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

본 절차의 전반적인 목표는 표준 광학 현미경과 이미지 프로세싱을 이용하여 질량과 부피를 포함한 세포 시료의 기본적인 물리적 특성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 유리 커버슬립에서 배양된 세포 시료를 현미경 슬라이드에 마운팅함으로써 수행됩니다. 그다음으로 초점 평면 전체를 촬영하는(through focus) 명시야 및 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지를 획득합니다.

그런 다음, 각 Z 스택 이미지를 개별 MATLAB 이미지 처리 프로그램에 입력하여 물리적 데이터를 추출합니다. 최종적으로 명시야 대비 및 미분 간섭 대비 현미경 하에서의 초점 이동 강도 측정을 통해 세포 시료의 기본적인 물리적 특성을 얻습니다. 형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 시료를 고정, 투과화 또는 염색할 필요가 없다는 점입니다.

이 방법은 세포 주기 동안 또는 질병 상태에 기여하는 서로 다른 세포 집단 간에 세포 내 밀도가 어떻게 구성되는지와 같은 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DIC와 명시야 기능을 모두 갖춘 현미경과 텍스트 프로토콜에 따른 추가 사양을 사용하여, 먼저 슬라이드 북 소프트웨어를 열고 이미지 수집을 위한 새 슬라이드를 생성합니다. 다음으로 포커스 창을 열고 필터 설정 섹션에서 DIC를 선택합니다. 스코프 탭의 컨덴서 섹션에서 조리개 슬라이드 바를 가장 오른쪽 위치로 조정합니다. 이렇게 하면 높은 개구수 조명이 제공되어 시료의 광학적 절편화(optical sectioning)가 향상됩니다.

시료의 DIC 스택을 캡처한 후, 포커스 창을 열고 open을 선택합니다. 필터 세트 섹션에서 조리개 슬라이드 바를 가장 왼쪽의 완전히 닫힌 위치로 조정하여 낮은 NA 조명을 제공합니다. 신호 강도를 조절한 후, 이미지 캡처 창을 엽니다.

DICZ 스택 획득의 3D 캡처 설정이 이미지 캡처 창의 필터 세트 섹션에 표시됩니다. 확인란을 체크하고 노출 시간을 지정하십시오. 이미지 정보 섹션에서 이미지 이름을 지정하고 시작을 선택하여 Zack 이미지 획득을 개시하십시오.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 Z-stack을 내보낸 후, JoVE HT DCO V one M이라는 이름의 H-T-D-I-C MATLAB 프로그램에서 부피 측정을 수행합니다. 섹션 0에서, 탐색기의 hilbert. Transform DM 및 sobel edge Detect M 파일이 포함된 디렉토리를 복사하여 dependencies directory = 뒤의 작은따옴표 사이에 붙여넣어 종속성 디렉토리 변수를 업데이트하십시오. joco HT DCO V one M 프로그램의 섹션 0을 실행하십시오.

섹션 1에서 .TIF 형식의 through focus 이미지들이 포함된 디렉토리를 복사하여 붙여넣음으로써 이미지 디렉토리를 업데이트하십시오. 단일 따옴표 사이에 경로를 입력하며, 이미지 정렬 및 회전을 위해 이 섹션은 한 번만 실행하십시오. 힐베르트 변환(hilbert transform)을 수행하려면 코드의 섹션 2를 실행하십시오. 그러면 'Define HT DIC parameters'라는 제목의 대화 상자가 나타납니다.

그런 다음 샘플의 DIC 이미지가 초점에 맞은 초점면 번호, 가로 해상도, 세로 해상도, 힐버트 변환을 수행하는 데 필요한 DIC 이미지의 회전 각도, 그리고 마지막으로 관심 영역(ROI) 크기를 입력하십시오. 그 후 확인을 클릭합니다. 지정한 초점면 번호에 해당하는 DIC 초점면 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다.

세포와 같이 관심 있는 특징 위에 상자를 배치하십시오. 상자가 원하는 영역 위에 배치되면, B 내부를 더블 클릭하십시오. 이미지의 대비는 어두운 특징이 왼쪽에, 밝은 특징이 오른쪽에 나타나도록 설정해야 합니다. 파란색 상자를 관심 영역 위로 드래그하고 필요에 따라 모양을 조정하십시오.

다음으로, 섹션 3에서 직사각형 마스크를 생성하려면 167행의 주석을 해제하고 170행을 주석 처리한 후, 이미지 내에서 클릭하고 마우스를 드래그하여 직사각형 마스크 정의를 시작함으로써 프로그램의 섹션 3을 실행하십시오. 그런 다음 상자를 더블 클릭하여 이를 적용합니다. 수동으로 그린 마스크를 생성하려면 섹션 3을 실행하기 전 167행을 주석 처리하고 170행의 주석을 해제하십시오. 마우스로 원하는 마스크를 클릭하여 그린 후, 마스크를 더블 클릭하여 적용합니다. 섹션 4를 실행하여 텍스트 프로토콜에 따라 힐베르트 변환 이미지 스택을 구축한 후, 섹션 5를 실행하십시오.

관심 영역의 xz 단면 이미지에 대한 이미지 분할을 최적화하기 위해, 프로그램에서 생성된 그림 500은 세 가지 서로 다른 유형의 대비를 표시합니다. 세포의 경계를 찾는 알고리즘의 성공 여부는 사용된 마스크와 프로그램의 2, 2, 9행에 있는 임계값의 조합에 달려 있습니다. 0.5 값으로 시작하여, 열 중 하나에서 적절한 외곽선이 생성될 때까지 임계값을 조정하고 프로그램의 이 섹션을 다시 실행하십시오.

외곽선 추출 결과가 첫 번째 열에서 가장 좋았다면, DIC 분할 시 섹션 6을 사용하여 부피를 결정하십시오. 두 번째 열에서 최적의 결과가 나왔다면, 섹션 7을 실행하여 hilbert로부터 세포 부피를 결정하십시오. 세 번째 열에서 최적의 결과가 나왔다면, 섹션 8을 실행하는 동안 forer 필터링된 hilbert 변환 DIC 이미지를 사용하여 부피를 결정하십시오. NIQ PM MATLAB 프로그램의 섹션 0 아래에 JO VCO NI qpm V1 M이라는 제목으로 질량 측정값을 기록하십시오. 세 개의 디렉토리 의존성, BRIGHTFIELD 및 DIC 디렉토리의 위치를 업데이트한 후 섹션 1을 실행하고, 이어서 섹션 2를 실행하십시오. define N-I-Q-P-M parameters라는 제목의 대화 상자에 샘플의 명시야 이미지가 초점에 맞은 초점면 번호, 가로 해상도, 세로 해상도 및 관심 영역(ROI) 크기를 입력하십시오.

그 다음 확인(Okay)을 클릭합니다. 지정한 초점 평면 번호에 해당하는 명시야 초점 평면 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다. 필요한 경우 섹션 2를 다시 실행하여 초점을 조정한 후, 이미지 위에서 상자를 드래그하여 위치를 잡고 상자의 노드를 선택해 드래그하여 크기를 조절한 다음, 상자 내부를 더블 클릭하여 확정합니다.

섹션 3을 실행하여 명시야 이미지 스택을 구축한 후, 섹션 4를 실행하여 위상 맵, 의사 DIC 이미지, 그리고 명시야 이미지 및 실제 DIC 이미지와의 비교 결과를 생성하십시오. 의사 DIC 이미지와 실제 DIC 이미지가 최대한 유사해지면, 사용자가 세포의 외곽선을 지정하여 질량 밀도 맵, 총 질량 및 세포 밀도 히스토그램을 정확하게 생성할 수 있는 섹션 5A 또는 5B를 실행하십시오. 초점 이동 이미지 획득 중 샘플 조명은 N-I-Q-P-M 및 H-T-D-I-C 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 이 그림은 폴리스티렌 구체와 인간 대장암 세포주 SW six 20에 대해 DIC 및 명시야 대비 하에서의 저배율 및 고배율 NA 조명을 보여줍니다.

이 패널들은 N-I-Q-P-M의 최적 이미징을 보여주며, 이들은 HT DIC의 최적 이미징을 보여줍니다. 이 이미지들은 NIQ PM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여주며, 성공적인 구현 사례와 그렇지 못한 사례를 모두 강조합니다. 여기서는 직경 4.8 µm의 폴리스티렌 구체의 위상 프로파일을 탐구합니다.

예상 프로파일은 이론적으로 알려져 있으므로 NIQ PM 재구성 결과와 직접 비교할 수 있습니다. 이 패널들은 구체 회절 효과로 인해 구체 경계와 내부 모두에서 모든 지점의 안정적인 재구성이 방해받는 상황에서 얻을 수 있는 최선의 재구성 결과를 보여줍니다. 구체의 중앙 영역은 패널 L에서 볼 수 있듯이 1~5%의 오차율로 N-I-Q-P-M을 통해 캡처할 수 있으며, 이는 위상 특성이 알려지지 않은 세포 시료의 경우입니다.

가상(A priori) 데이터는 가상 DIC 이미지와 실제 DIC 이미지를 비교하는 절차와 함께 NIQ PMM을 사용하여 재구성할 수 있습니다. N-I-Q-P-M에는 하나의 자유 매개변수가 있습니다. 이는 계산의 중심이 되는 우측 시야 이미지 스택의 평면입니다.

이 중앙 초점면은 pseudo DIC 이미지와 true DIC 이미지가 최대한 비슷하게 보일 때까지 조정해야 합니다. 여기에는 illumination NA 0.9로 촬영한 세포의 초점이 맞지 않은 pseudo DIC 이미지, 최적의 pseudo DIC 이미지 및 그에 대응하는 DIC 이미지가 제시되어 있습니다. 흥미롭게도, 이 패널들에서 보여지듯이 최적의 위상 맵(phase map)과 그에 대응하는 pseudo DIC 이미지가 반드시 초점이 맞은 명시야(bright field) 이미지와 일치하는 것은 아닙니다.

마지막으로, NA 0.9 조명 하에서 초점면 이미징을 통한 DIC로부터 H-T-D-I-C 이미지 처리 알고리즘에 포함된 단계들을 보여줍니다. DIC 이미지의 베이스 릴리프(base relief)를 제거하기 위해 힐베르트 변환(hilbert transform)을 수행합니다. 이 과정에서 광축을 따라 일부 흐림 현상이 발생하며, 이는 하이패스 푸리에 필터링(high pass fourier filtering)으로 제거할 수 있습니다. 이렇게 얻은 최종 이미지들은 쉽게 분할되어 시료의 각 단면적을 결정함으로써 전체 세포 부피를 추론할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, 본 과정 이후 명시야(brightfield) 또는 미분 간섭(differential contrast) 이미징을 위한 올바른 조명을 기억하는 것이 중요합니다. 표본의 밀도 맵과 바닥 힘(floor force)의 공국소화(colocalization)를 이용하여 추가적인 질문에 답하기 위해 형광 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.