Name: 양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정 표준 광학 현미경과 특징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 배우세요 표준 광학 현미경을 이용하여 세포의 질량, 부피, 밀도를 비침습적으로 정량화하는 방법을. MATLAB 이미지 처리 프로그램으로 생세포 물리적 특성을 정확히 측정할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 보건원 (OJTM에 KGP, OJTM 및 R01HL101972에 U54CA143906)와 오레곤 의료 연구 재단 초기 임상 연구자 상 (KGP)에서 교부금에 의해 지원되었다. OJTM는 미국 심장 협회 (American Heart Association) 설립 탐정 (13EIA12630000)입니다. 우리는이 작업에 사용 된 세포 샘플을 준비하는 나이트 암 연구소의 박사 에릭 앤더슨 감사합니다.

1. 현미경 사양 올바른 방식으로 이미징을 수행하기 위해 현미경은 다음과 같은 사양을 가지고 있어야합니다 : <ol><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 및 시야 (BF) 대비 모두를 가지고있다. </li><li> 컴퓨터로 제어되는 Z 축 이동을해야합니다. </li><li> 집광 렌즈의 개구 수를 변경하는 조절 조리개가 있습니다. 등급 판정 규칙 또는 전자 판독 가진 조리개 개구 수의 값을 알 필요가있다. 개구 NIQPM 0.1에서 HTDIC 0.9 (또는 그 이상)까지 다양합니다. </li><li> 현미경 시야 촬상에 이용되는 협 대역 색상 필터를 가져야한다. 이 필터는 굴절 증가, NIQP에 대한 질량 밀도의 위상을 변환하는 데 사용되는 파장에 의존 골절을 해결하기 위해 필요합니다. </li></ol> 2. 미분 간섭 대비 (DIC) Z-스택 취득 <ol><li> SlideBook 소프트웨어를 엽니 다차 이미지 컬렉션에 대한 새 슬라이드를 만들 수 있습니다. </li><li> 다음으로, 초점 창을 엽니 다. 필터 설정 섹션에서, DIC를 선택합니다. 범위 탭에서, 콘덴서 섹션에서 멀리 오른쪽 위치 (모든 길을 열어)에 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다. 이는 높은 개구 조명을 제공하고, 시료의 광학 절편을 향상시킨다. </li><li> DIC의 목표를 사용하여 샘​​플에 초점을 맞 춥니 다. 샘플이 쉽게 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 카메라가 포화되지 않는 보장하기 위해, 초점 창에 카메라 탭을 선택하고 픽셀 세기의 히스토그램이 카메라의 동적 범위 내에 있는지 확인합니다. </li><li> 이미지 캡처 창을 엽니 다. 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다. 3D 캡처 섹션에서, 센터 주변의 범위를 선택하고 현재의 위치로 돌아 가기 </strong&gt; 박스 및 Z 방향의 범위, 평면의 수 및 스텝 사이즈를 지정한다. Z-방향 범위는 전체 샘플을 포함한다. </li><li> 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 DIC의 상자를 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지 이름을 지정하고 영상을 시작하려면 시작을 선택합니다. </li></ol> 3. 시야 (BF) Z-스택 취득 <ol><li> 현미경은 시료의 DIC의 Z-스택을 수집 완료되면, 초점 창을 열고 필터 설정 섹션에서 열기를 선택합니다. 낮은 NA 조명을 제공하기 위해 (모든 방법을 폐쇄) 멀리 왼쪽 위치로 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다. </li><li> 녹색으로 현미경 빛 경로 필터를 변경합니다. 샘플이 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 선택하여 카메라의 더 채도가 없는지 확인 <st룽&gt; 카메라 초점 창에서 탭 및 픽셀 세기의 히스토그램이 지정된 범위 내에 있는지 검사합니다. </li><li> 이미지 캡처 창을 엽니 다. DIC Z-스택을 수집에서 3D 캡처 설정이 표시됩니다. </li><li> 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 열기 확인란을 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지의 이름, 및 Z-스택의 이미지 수집을 시작하려면 시작을 선택합니다. </li></ol> 4. Z-스택 이미지 내보내기 <ol><li> Z-스택 캡처를 엽니 다. 100 %로보기를 변경합니다. 공 사이에 표시되는 화소 값의 히스토그램 및 카메라의 최대 화소 값 (4095 12 비트 카메라, 16 비트의 경우 65,535.) 조정한다. </li><li> 보기&gt; 내보내기&gt; TIFF 시리즈를 선택합니다. 이 TIFF 이미지의 일련의 Z-스택을 내 보냅니다(각 Z 평면에 대해 하나). 말 (즉, &quot;DIC 스택 1_&quot;)의 밑줄이있는 이름으로 별도의 폴더에 TIFF 시리즈를 저장합니다. 각 DIC 또는 BF Z-스택이 작업을 반복합니다. </li></ol> 5. 볼륨 측정 <ol><li> &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;라는 제목의 HTDIC MATLAB 프로그램을 엽니 다. </li><li> HTDIC 프로그램 제 0에서 종속 디렉토리 변수를 업데이트합니다. 복사 &quot;dependencies_directory =&quot;다음 작은 따옴표 사이에있는 탐색기에서 hilbert_transform_dic.m 및 sobel_edge_detect.m 파일 (PC)를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. JoVE_HTDIC_v1.m 프로그램의 ExecuteSection 0. </li><li> 제 1 항에서 &quot;images_directory&quot;을 업데이트합니다. 다시 말하지만, 복사 따옴표 사이에. TIF 형태를 통해 초점 이미지를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다. </li><li> 정렬 힐버트에 대한 이미지의 회전은 실행을 코드의 2 절을 변환 할 수 있습니다. &quot;HTDIC 매개 변수 정의&quot;라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 다섯 번호 18RS는 사용자로부터 요구된다 : 샘플의 DIC 이미지의 초점이 초점면 번호는, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축선 단계에서 영상 획득을 위해 0.1이다), DIC 화상의 회전 각도는 힐버트 변환을 수행하기 위해 필요한, ​​전형적인 값은 45, -135이다. 마지막으로, 그 크기의 지역을 입력,이 매개 변수를 이후에 나타납니다 상자의 측면의 길이를 정의 - 일반적인 값은 400입니다. 확인을 클릭합니다. </li><li> 초점면 번호로 지정 DIC 초점면의 이미지는 청색 상자로 나타날 것이다. 셀 예를 들면, 그 기능에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 상자가 원하는 지역, 상자 안쪽을 두 번 클릭에 배치되면. </li><li> 또 다른 그림은 이제 나타납니다 :이 그림은 이전 단계에서 선택한 관심 영역의 자른 및 회전 된 이미지가 포함되어 있습니다. 화상의 콘트라스트는해야밝은 기능은 오른쪽에 표시하면서 그 어두운 기능은 왼쪽에 나타납니다. 관심 영역에 파란색 상자를 드래그하여, 필요에 따라 바꿀. </li><li> 3 장에서는 Z-스택 큐브에 대한 마스크를 생성합니다. 사각형 마스크 세포 주위에 사각형 손으로 그 셀 외곽선을 프리 핸드 툴을 만들 수 : 가능한 마스크의 두 가지 유형이 있습니다. </li><li> 직사각형 마스크의 주석 라인 167 및 주석 행 (170) (그 줄의 시작 부분에 &quot;%&quot;를 배치하여 줄을 주석으로) 생성합니다. 프로그램의 제 3 항을 실행합니다. 이미지를 클릭하고 사각형 마스크 정의를 시작하기 위해 마우스를 드래그합니다. 그것을 받아들이는 상자를 두 번 클릭합니다. </li><li> 손으로 그린​​ 마스크, 주석 행 167과의 주석 라인 (170)을 생성하고 3 절을 실행합니다. 클릭하고 마우스로 원하는 마스크를 그립니다. 그것을 받아들이는 마스크를 두 번 클릭합니다. </li><li> 힐버트를 구성 4to 실행 섹션 DIC 이미지 스택과 관심 영역의 해당 DIC 이미지 스택을 바꾸었다.3 장으로 구성 마스크는 DIC 스택과 &quot;maskON는&quot;라인 179에서 1로 설정되어 일반 DIC 스택을 변환 힐버트에 적용됩니다. 0 &quot;maskON&quot;을 설정하면 마스크를 적용하지 않고 이미지 스택을 구성합니다. </li><li> 관심 영역의 XZ의 단면 이미지의 이미지 분할을 최적화하기 위해 5 절을 실행합니다. 프로그램에 의해 생성 된 그림 500, 대조의 세 가지 유형의 표시가 나타납니다. 셀의 경계를 찾는 알고리즘의 성공은 사용 마스크 및 프로그램의 라인 (229)에서 &quot;임계&quot;값의 조합에 의존하고있다. 0.5의 값으로 시작합니다. 임계 값을 조정하고 적절한 개요이 열 중 하나에 도달 할 때까지 프로그램의이 부분을 다시 실행하십시오. </li><li> 개요는 1 열에서 가장 인 경우, DIC 이미지 분할을 사용하여 볼륨을 결정하기 위해 제 6를 사용합니다. 2 열은 최적의 결과를 제공 한 경우, 힐버트 변환 된 DIC 이미지에서 세포 부피를 결정하는 제 7을 실행합니다. 만약 3 열 GAV전자 최적의 결과를 실행 제 8 푸리에 필터링 힐버트 변환 된 DIC 이미지를 사용하여 볼륨을 결정합니다. </li><li> 입방 μM (FL)에보고 된 샘플의 부피는 측정, 체적 측정이 선택에 따라 프로그램에 의해 생성 된도 600, 700, 또는 800의 표제로 표시된다. </li></ol> 6. 질량 측정 <ol><li> &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;라는 제목의 NIQPM MATLAB 프로그램을 엽니 다. </li><li> NIQPM 프로그램 제 0에서 프로그램을 실행하는 데 필요한 세 개의 디렉토리의 위치를​​ 업데이트합니다. 이들은 &quot;dependencies_directory,&quot; &quot;brightfield_directory&quot;및 아르 &quot;dic_directory.&quot; </li><li> 다음, 제 1 항을 실행합니다. 이 코드 부분은 이미지의 전체 세트의 전체 필드의 시야 이미지 큐브를 생성합니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다. </li><li> 다음으로, 제 2를 실행합니다. &quot;NIQPM 매개 변수 정의&quot;라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 네 개의 숫자는 사용자의 필요 : 초점면 번호 위치의 시야 이미지샘플에 초점이, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축 단계로 화상 취득을 위해 0.1이다) 및 그 크기의 영역은,이 파라미터의 변의 길이를 정의 이후에 나타납니다 상자 - 일반적인 값은 200입니다. 확인을 클릭합니다. </li><li> 초점면 번호로 지정 시야 초점 평면의 이미지는 파란색 상자로 표시됩니다. <ol><li> 이미지에 포커스가없는 경우, 파란색 상자를 다시 실행 2 절에서 두 번 클릭하여 대화 상자에서 초점면의 수를 조정해야합니다. </li><li> 이미지의 초점이있는 경우, 이미지의 주위에 파란색 상자를 끌어 상자의 노드를 선택하고 필요에 따라 끌어 크기를 조정합니다. 셀 예를 들면, 그 기능을 주위에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 그것을 받아들이는 상자 안쪽을 두 번 클릭합니다. </li></ol></li><li> 다음으로, 실행 시야 이미지의 스택을 구성하는 제 3 절에서의 영역으로 자른의 terest. </li><li> 위상지도, 의사 DIC 이미지, 그리고 시야의 이미지와 실제 DIC 이미지에 대한 비교를 생성하려면, 섹션 4를 실행합니다. </li><li> 의사와 DIC와 질량 밀도지도, 전체 질량 및 세포 밀도의 히스토그램 최대한 유사 진정한 DIC 이미지 섹션 5A 또는 5B를 실행함으로써 결정될 수있다. 라인 300에 최적화 &quot;임계 값&quot;- - 섹션 5A 필드의 자동 보더 검출을 수행 일반적인 값은 0.1 ~ 1 사이에 다릅니다. 임계 값을 최적화하기 위해 필요에 따라이 부분을 다시 실행하십시오. 사용자가 관심있는 셀을 설명 후 절 (5b)는 등의 질량 측정을 수행한다. </li></ol>

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</ol>

저자가 제시하는 일에 금전적 이해 관계가 없습니다.

일반적으로, NIQPM는 0.25-44.7에 이르기까지 광학 경로 길이에 대한 유효성을 검사 회절 제한 기술이다. 유효성 검사가 N에서 수행 하였다 = Fluoromount G 현탁 0.11-9.8 μM에서 직경 이르는 1.596 폴리스티렌 구체 (데이터는 도시되지 않음). 세포는 거의 0-7 범위의 광학 경로 길이를 가지고있다. 시편의 밀도 분포를 측정 할 때 하나는 밀도지도 원치 않는 기여를 보유하는 동안 의사 DIC 이미지가 잘 보이는 것을 알 수 있습니다. 이것은 NIQPM 알고리즘에 대한 입력으로서 사용 시료의 시야 이미지의 노이즈에 기인한다. NIQPM 방법에 두 가지 변형이 원치 않는 기여를 제거하는 데 사용할 수 있습니다 : 첫째로, 하나는 신호 대 잡음 시야 이미지의 향상에 더 이상 노출 시간을 사용할 수 있습니다. 광학 박막 시료를 이미징 할 때 특히 중요합니다. 대안 적으로, 하나는 Z-스택 acquisit의 축 방향 간격을 감소시킬 수있다NIQPM 알고리...

광학 현미경의 사용은 이제 세포 생물의 조사에 유비 쿼터스입니다. 때문에 가시 광 스펙트럼을 통해 자신의 낮은 내생 흡수 약한 산란 특성에, 세포는 강하게을 통과하는 광 파의 진폭에 영향을 미치고, 따라서 표준 밝은 필드 현미경으로 몇 군데 때 반투명 표시되지 않습니다. 셀룰러 시험편은, 그러나, 선형 광이 이동하는 공간을 통해 특정 영역에있는 로컬 질량 밀도의 양에 관련된 방법들을 통해 여행 광파를 느리게 않는다. 이 이기종 시간 지연 또는 현미경 표본을 통해 전송 광 파도의 &quot;단계&quot;프로파일의 활용 먼저 프리츠 제르 니케 (1)에 의해 1935 년에 기술 된 실험적 Zernikein 1942 (2)에 의해 실현되었다. 니케는 이러한 성과에 대해 1953 년 노벨상을 수상했다. 혈구 1945 년 3이 양상을 상용화. 1955 년 스미스와 Nomarsk내가 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경, 반대로기구로서 위상의 공간 구배를 사용하는 양상의 사용 4와 5의 이론에 자신의 초기 작품을 것입니다. DIC는 노멀 스키 6 1965in 긴밀한 협력 혈구에 의해 상용화되었다. 1981 년, 두 연구소는 DIC 현미경 7, 8의 광학 기차에 비디오 카메라의 장착으로 처음으로 기록 된 살아있는 세포 DIC 이미지를 보여 주었다. 라이브 세포 이미징의 시대가 탄생했습니다. 이 시간 이후, 상업 현미경에 위상 콘트라스트 및 DIC 모두의 실행은 큰 변화가 있었다. 형태, 세포 내 구조의 추적 및 멤브레인 역학 9의 조사 모니터링 :이 방법은 주로 정성적인 목적을 위해 세포의 이미지를 생산하는 생물 학자들에 의해 사용된다. 이 기술은 위상과 DI 모두 그들의 &quot;기성&quot;구성에서 질적C 이미지는 임의의 광원 강도의 함수, 조명 광학계 설정 및 CCD 카메라 이득, γ, 및 노출 설정이다. 물리학 자 및 광학 엔지니어의 작은 군단 상업 영상 기법으로 정량적하기 위해 노력하고있다. 첫 번째 노력 중 의사 출신 생물 물리학 자 로버트 Barer 시중에서 위상 현미경을 사용하여 이러한 종류의 세포를 통해 위상 변화를 추정하여 세포의 세포 건조 질량을 결정하는 위상 현미경의 사용을 입증하는 1952 년 1953 년 자연에 두 글자가 있었다 10, 11. 위상 현미경 10, 11, DIC 현미경 12-17, 광학 경로 길이, 상, 질량을 결정하는 시야 18 ~ 22 : 필드는 세 가지 기본 레이블이없는 반면 메커니즘을 기반으로 다음의 몇 년 동안 기술의 다수를 개발했다 밀도, 굴절률, 및 셀룰러 볼륨. 파라의llel, 사용자 정의 광학 기기의 큰 컬렉션은 1950 년대부터 개발되었으며, 기생충의 성장 (23) 응용 프로그램에서, 적혈구 (25)의 막 역학 조사에 세포주기 (24)를 문서화에 이르기까지 광학 측정 광범위한 만들었습니다. 특히, 지난 10 년 회절 위상 현미경 (26)의 형태, 단층 위상 현미경 (27), 디지털 홀로그램 현미경 28 단계 민감한 빛 간섭 현미경 29, 공간 광 간섭 현미경 (30), 힐버트에 라벨이없는 양적 현미경의 부를 볼 수있다 위상 현미경 31, 정량적 위상 현미경 32. 그들의 집단의 성공에도 불구하고,이 악기는 복잡한 장비 및 전산 요구 사항을 대부분, 때문에 생물학적 연구의 큰 분야에 전파되지 않았습니다. 여기에서 우리는 거라고명 시야 및 DIC 이미지에서의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경의 사용을 방접원을 그리다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하기 위하여, 미분 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 자신의 기술 접근​​성에 누워. 성공적인 실행에 필요한 촬상 조건은 대부분 시판 현미경의 정상 작동 범위 내에있다. 또한, 포스트 - 프로세싱 알고리즘이 안정된 퀵하고 견고 - 가능한 고속 푸리에 변환 (FFT) 기반 알고리즘을 사용하여 변환 MATLAB에서 구현 된 것으로. NIQPM 위상 및 CEL의 축 방향으로 집적 질량 밀도를 재구성하는 방법시야 이미지에서 lular 표본. 시험편의 면적 이상이 축 방향으로 집적 질량 밀도의 합산 시편의 총 건조 물질 함량을 준다. 이 셀의 위상 프로파일이 샘플을 통해 초점 시야 이미지에서 재구성 될 수 있다는 것을 입증되었던 - - NIQPM 프로토콜 Paganin 및 전트 (18, 19)에 의해 마련 실험적 토대에 기반하고 프랭크의 이론적 작품 , Altmeyer과 베르 니케 20 - 효율적인 FFT 기반 방식으로 근축 파 모델을 해결하십시오. 건조 질량 밀도상의 연결 Barer 10, 11 및 페스 쿠 (33)에 의해 워크에 기초한다. 체적 정보는 광축을 따라 시험편의 광학 절편을 활성화 높은 NA 조명 조건 하에서 관통 포커스 DIC 이미지에서 얻을 수있다. 힐버트 DIC 이미지 스택에서 변환 처리를 크게 향상배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 지역화를위한 에지 검출 알고리즘. 우리가 대조 샘플의 자동화 된 체적 분석을위한 기반 소벨 에지 검출 방법을 향상시키기 위해 두 푸리에 필터링 방법을 도입하고 있지만이 작품 Arinson 외. 34 유래. 우리는 또한 회절 한계에서 최대 직경이 36에서 20 μm의 크기에 이르기까지 폴리스티렌 분야에서 이전에 HTDIC을 확인했다. NIQPM 및 HTDIC 모두 상용 현미경에 자신의 발전으로 인하여 기술적으로 액세스 할 수 있지만, 방법은 근본적 현미경 자체의 하드웨어 구성에 의해 제한된다. 이러한 기술의 주요 제한은 두 가지이다 : 반대로 인해 전체 시료 스테이지의 변환에, 상업용 스코프 느린 Z-스택 획득 시간 그대로 대물 렌즈를 행현재 빠른 약 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 제한하고 둘째, 회절 효과는 각각 직경 10, 20 μm의 0.2에서 크기에 이르기까지 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유틸리티를 제한합니다. 따라서 관심의 표본과 관련 시간의 역학은 일반적으로 &quot;기성&quot;악기에 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기와 시간 제약 조건을 충족해야합니다. 호쾌하게, 대부분의 고정 된 세포 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다. NIQPM 및 HTDIC 프로토콜의 개요를 그림 1에 나타내었다. 도 2에서 우리는 시야 및 DIC 이미징 모두 낮고 높은 두 NA 조명 조건 하에서 최적 및 차선 관통 포커스 이미징을 도시한다. 3,4 성공 및 실패의 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여 피규어. <strong&gt;도 5는 HTDIC 화상 처리 알고리즘에 관련된 단계를 도시 및 세포 용적을 결정하는 알고리즘의 최적 구현을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 현미경</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 독일</td><td>Axio Imager D2</td><td>현미경</td></tr><tr><td>녹색 필터(&lambda; = 540 &plusmn; 25nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>녹색 필터</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>폴리스티렌 microspheres</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>폴리스티렌 구체</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>마운팅 미디어</td></tr></tbody></table>

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

우리는 밝은 필드와 미분 간섭 콘트라스트 이미지의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명한다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하는 차동 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. 낮은 개구 수 (NA) 조명, 약한 산란 및 표본에 의한 빛의 약한 흡수 : NIQPM는 전파의 단순화 된 모델을 기반으로, 세 가지 기본 가정으로, 근축 근사라고합니다. 다행히, 흠없는 세포 표본은 이러한 가정을 만족하는 낮은 NA 조명 쉽게 상용 현미경에 달성된다. HTDIC 높은 NA의 illumin 아래를 통해 초점 DIC 이미지에서 체적 정보를 얻는 데 사용됩니다ATION 조건. 높은 NA 조명 광축을 따라 시험편의 향상된 절편을 가능하게한다. 힐버트 DIC 이미지를 변환 처리가 크게 스택 배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 현지화 에지 검출 알고리즘을 향상시킵니다. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 &quot;기성품&quot;현미경을 사용하여 자신의 기술 접근​​성에 누워. 상용 범위에 느린 Z-스택 획득 시간은 빨리 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 abrogates, 둘째, 회절 효과는 최대 10 0.2에서 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유용성을 제한하는 이러한 방법의 두 가지 기본 제한이 있습니다 각각 (NIQPM) 직경 20 (HTDIC) μm의. 따라서, 그 시험편과 연관된 시간 역학 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기 및 시간 제약을 충족시켜야한다. 호쾌하게, 대부분의 고정 cellula연구 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.

를 통해 초점 이미지 수집하는 동안 올바른 샘플 조명 NIQPM 차 HTDIC 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 그림 2에서 우리는 DIC와 폴리스티렌 구와 인간의 대장 선암 세포주 SW620에 대한 시야 대비 모두에서 낮은 높은 NA 조명을 보여줍니다. 2A 피규어, 2C, 2I, 그리고 2K가 NIQPM에 대한 최적의 영상을 보여줍니다. 2 층 2H 피규어, 2N 및 2P는 HTDIC에 대한 최적의 영상을 보여줍니다. 도 3 및도 4는 성공 및 실패를 모두 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여준다. 예상 프로파일이 이론적으로 알려져 있고, 따라서 NIQPM 재구성에 직접 비교 될 수있다 -도 3에서 우리는 4.8 μm의 직경 폴리스티렌 구 위상 프로파일을 찾아. ...

명시야와 미분 간섭 대비 이미지의 조합을 통해 세포 질량, 부피 및 밀도의 정량적 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

본 절차의 전반적인 목표는 표준 광학 현미경과 이미지 프로세싱을 이용하여 질량과 부피를 포함한 세포 시료의 기본적인 물리적 특성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 유리 커버슬립에서 배양된 세포 시료를 현미경 슬라이드에 마운팅함으로써 수행됩니다. 그다음으로 초점 평면 전체를 촬영하는(through focus) 명시야 및 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지를 획득합니다.그런 다음, 각 Z 스택 이미지를 개별 MATLAB 이미지 처리 프로그램에 입력하여 물리적 데이터를 추출합니다. 최종적으로 명시야 대비 및 미분 간섭 대비 현미경 하에서의 초점 이동 강도 측정을 통해 세포 시료의 기본적인 물리적 특성을 얻습니다. 형광 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 시료를 고정, 투과화 또는 염색할 필요가 없다는 점입니다.이 방법은 세포 주기 동안 또는 질병 상태에 기여하는 서로 다른 세포 집단 간에 세포 내 밀도가 어떻게 구성되는지와 같은 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DIC와 명시야 기능을 모두 갖춘 현미경과 텍스트 프로토콜에 따른 추가 사양을 사용하여, 먼저 슬라이드 북 소프트웨어를 열고 이미지 수집을 위한 새 슬라이드를 생성합니다. 다음으로 포커스 창을 열고 필터 설정 섹션에서 DIC를 선택합니다. 스코프 탭의 컨덴서 섹션에서 조리개 슬라이드 바를 가장 오른쪽 위치로 조정합니다. 이렇게 하면 높은 개구수 조명이 제공되어 시료의 광학적 절편화(optical sectioning)가 향상됩니다.시료의 DIC 스택을 캡처한 후, 포커스 창을 열고 open을 선택합니다. 필터 세트 섹션에서 조리개 슬라이드 바를 가장 왼쪽의 완전히 닫힌 위치로 조정하여 낮은 NA 조명을 제공합니다. 신호 강도를 조절한 후, 이미지 캡처 창을 엽니다.DICZ 스택 획득의 3D 캡처 설정이 이미지 캡처 창의 필터 세트 섹션에 표시됩니다. 확인란을 체크하고 노출 시간을 지정하십시오. 이미지 정보 섹션에서 이미지 이름을 지정하고 시작을 선택하여 Zack 이미지 획득을 개시하십시오.그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 Z-stack을 내보낸 후, JoVE HT DCO V one M이라는 이름의 H-T-D-I-C MATLAB 프로그램에서 부피 측정을 수행합니다. 섹션 0에서, 탐색기의 hilbert. Transform DM 및 sobel edge Detect M 파일이 포함된 디렉토리를 복사하여 dependencies directory = 뒤의 작은따옴표 사이에 붙여넣어 종속성 디렉토리 변수를 업데이트하십시오. joco HT DCO V one M 프로그램의 섹션 0을 실행하십시오.섹션 1에서 .TIF 형식의 through focus 이미지들이 포함된 디렉토리를 복사하여 붙여넣음으로써 이미지 디렉토리를 업데이트하십시오. 단일 따옴표 사이에 경로를 입력하며, 이미지 정렬 및 회전을 위해 이 섹션은 한 번만 실행하십시오. 힐베르트 변환(hilbert transform)을 수행하려면 코드의 섹션 2를 실행하십시오. 그러면 'Define HT DIC parameters'라는 제목의 대화 상자가 나타납니다.그런 다음 샘플의 DIC 이미지가 초점에 맞은 초점면 번호, 가로 해상도, 세로 해상도, 힐버트 변환을 수행하는 데 필요한 DIC 이미지의 회전 각도, 그리고 마지막으로 관심 영역(ROI) 크기를 입력하십시오. 그 후 확인을 클릭합니다. 지정한 초점면 번호에 해당하는 DIC 초점면 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다.세포와 같이 관심 있는 특징 위에 상자를 배치하십시오. 상자가 원하는 영역 위에 배치되면, B 내부를 더블 클릭하십시오. 이미지의 대비는 어두운 특징이 왼쪽에, 밝은 특징이 오른쪽에 나타나도록 설정해야 합니다. 파란색 상자를 관심 영역 위로 드래그하고 필요에 따라 모양을 조정하십시오.다음으로, 섹션 3에서 직사각형 마스크를 생성하려면 167행의 주석을 해제하고 170행을 주석 처리한 후, 이미지 내에서 클릭하고 마우스를 드래그하여 직사각형 마스크 정의를 시작함으로써 프로그램의 섹션 3을 실행하십시오. 그런 다음 상자를 더블 클릭하여 이를 적용합니다. 수동으로 그린 마스크를 생성하려면 섹션 3을 실행하기 전 167행을 주석 처리하고 170행의 주석을 해제하십시오. 마우스로 원하는 마스크를 클릭하여 그린 후, 마스크를 더블 클릭하여 적용합니다. 섹션 4를 실행하여 텍스트 프로토콜에 따라 힐베르트 변환 이미지 스택을 구축한 후, 섹션 5를 실행하십시오.관심 영역의 xz 단면 이미지에 대한 이미지 분할을 최적화하기 위해, 프로그램에서 생성된 그림 500은 세 가지 서로 다른 유형의 대비를 표시합니다. 세포의 경계를 찾는 알고리즘의 성공 여부는 사용된 마스크와 프로그램의 2, 2, 9행에 있는 임계값의 조합에 달려 있습니다. 0.5 값으로 시작하여, 열 중 하나에서 적절한 외곽선이 생성될 때까지 임계값을 조정하고 프로그램의 이 섹션을 다시 실행하십시오.외곽선 추출 결과가 첫 번째 열에서 가장 좋았다면, DIC 분할 시 섹션 6을 사용하여 부피를 결정하십시오. 두 번째 열에서 최적의 결과가 나왔다면, 섹션 7을 실행하여 hilbert로부터 세포 부피를 결정하십시오. 세 번째 열에서 최적의 결과가 나왔다면, 섹션 8을 실행하는 동안 forer 필터링된 hilbert 변환 DIC 이미지를 사용하여 부피를 결정하십시오. NIQ PM MATLAB 프로그램의 섹션 0 아래에 JO VCO NI qpm V1 M이라는 제목으로 질량 측정값을 기록하십시오. 세 개의 디렉토리 의존성, BRIGHTFIELD 및 DIC 디렉토리의 위치를 업데이트한 후 섹션 1을 실행하고, 이어서 섹션 2를 실행하십시오. define N-I-Q-P-M parameters라는 제목의 대화 상자에 샘플의 명시야 이미지가 초점에 맞은 초점면 번호, 가로 해상도, 세로 해상도 및 관심 영역(ROI) 크기를 입력하십시오.그 다음 확인(Okay)을 클릭합니다. 지정한 초점 평면 번호에 해당하는 명시야 초점 평면 이미지가 파란색 상자와 함께 나타납니다. 필요한 경우 섹션 2를 다시 실행하여 초점을 조정한 후, 이미지 위에서 상자를 드래그하여 위치를 잡고 상자의 노드를 선택해 드래그하여 크기를 조절한 다음, 상자 내부를 더블 클릭하여 확정합니다.섹션 3을 실행하여 명시야 이미지 스택을 구축한 후, 섹션 4를 실행하여 위상 맵, 의사 DIC 이미지, 그리고 명시야 이미지 및 실제 DIC 이미지와의 비교 결과를 생성하십시오. 의사 DIC 이미지와 실제 DIC 이미지가 최대한 유사해지면, 사용자가 세포의 외곽선을 지정하여 질량 밀도 맵, 총 질량 및 세포 밀도 히스토그램을 정확하게 생성할 수 있는 섹션 5A 또는 5B를 실행하십시오. 초점 이동 이미지 획득 중 샘플 조명은 N-I-Q-P-M 및 H-T-D-I-C 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 이 그림은 폴리스티렌 구체와 인간 대장암 세포주 SW six 20에 대해 DIC 및 명시야 대비 하에서의 저배율 및 고배율 NA 조명을 보여줍니다.이 패널들은 N-I-Q-P-M의 최적 이미징을 보여주며, 이들은 HT DIC의 최적 이미징을 보여줍니다. 이 이미지들은 NIQ PM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여주며, 성공적인 구현 사례와 그렇지 못한 사례를 모두 강조합니다. 여기서는 직경 4.8 µm의 폴리스티렌 구체의 위상 프로파일을 탐구합니다.예상 프로파일은 이론적으로 알려져 있으므로 NIQ PM 재구성 결과와 직접 비교할 수 있습니다. 이 패널들은 구체 회절 효과로 인해 구체 경계와 내부 모두에서 모든 지점의 안정적인 재구성이 방해받는 상황에서 얻을 수 있는 최선의 재구성 결과를 보여줍니다. 구체의 중앙 영역은 패널 L에서 볼 수 있듯이 1~5%의 오차율로 N-I-Q-P-M을 통해 캡처할 수 있으며, 이는 위상 특성이 알려지지 않은 세포 시료의 경우입니다.가상(A priori) 데이터는 가상 DIC 이미지와 실제 DIC 이미지를 비교하는 절차와 함께 NIQ PMM을 사용하여 재구성할 수 있습니다. N-I-Q-P-M에는 하나의 자유 매개변수가 있습니다. 이는 계산의 중심이 되는 우측 시야 이미지 스택의 평면입니다.이 중앙 초점면은 pseudo DIC 이미지와 true DIC 이미지가 최대한 비슷하게 보일 때까지 조정해야 합니다. 여기에는 illumination NA 0.9로 촬영한 세포의 초점이 맞지 않은 pseudo DIC 이미지, 최적의 pseudo DIC 이미지 및 그에 대응하는 DIC 이미지가 제시되어 있습니다. 흥미롭게도, 이 패널들에서 보여지듯이 최적의 위상 맵(phase map)과 그에 대응하는 pseudo DIC 이미지가 반드시 초점이 맞은 명시야(bright field) 이미지와 일치하는 것은 아닙니다.마지막으로, NA 0.9 조명 하에서 초점면 이미징을 통한 DIC로부터 H-T-D-I-C 이미지 처리 알고리즘에 포함된 단계들을 보여줍니다. DIC 이미지의 베이스 릴리프(base relief)를 제거하기 위해 힐베르트 변환(hilbert transform)을 수행합니다. 이 과정에서 광축을 따라 일부 흐림 현상이 발생하며, 이는 하이패스 푸리에 필터링(high pass fourier filtering)으로 제거할 수 있습니다. 이렇게 얻은 최종 이미지들은 쉽게 분할되어 시료의 각 단면적을 결정함으로써 전체 세포 부피를 추론할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, 본 과정 이후 명시야(brightfield) 또는 미분 간섭(differential contrast) 이미징을 위한 올바른 조명을 기억하는 것이 중요합니다. 표본의 밀도 맵과 바닥 힘(floor force)의 공국소화(colocalization)를 이용하여 추가적인 질문에 답하기 위해 형광 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 하나의 살아있는 세포 내에서 subcellular 역학을 측정하는 필터링 가보와 같은 기반으로 한 어두운 현장 현미경 방법을 보여줍니다. 이 기술은 mitochondrial 조각 같은 organelles의 구조 변경에 민감합니다.

2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

렌즈 무료 비디오 현미경 셀 문화 인큐베이터 안에 직접 모니터링할 수 있습니다. 여기 우리가 획득 하 고 배양된 HeLa 세포의 2.7 하루 종일 수집 분석 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜 설명, 개별 셀 형태학 및 10584 세포 주기6 측정 추적 2.2 x 10의 데이터 집합에 지도.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

광학 해상도 photoacoustic 현미경 (또는 - PAM)는 영상 광학 흡수 능력이 새로운 기술을...

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

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배우세요 표준 광학 현미경을 이용하여 세포의 질량, 부피, 밀도를 비침습적으로 정량화하는 방법을. MATLAB 이미지 처리 프로그램으로 생세포 물리적 특성을 정확히 측정할 수 있습니다.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

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