Name: 효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9를 이용한 Danio rerio 유전자 녹아웃 생성 및 식별 방법입니다. 이 프로토콜은 차세대 시퀀싱과 헤테로듀플렉스 이동성 분석을 통해 효율적인 게놈 편집을 가능하게 합니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (R21CA182197 J.O.), 랄 프 W.와 그레이스 M. Showalter 연구 신뢰, 그리고 퍼듀 농업 과학 경제 개발 (AgSEED) 프로그램에 대 한 확장에 의해. 생어 시퀀싱 데이터 P30 CA023168에서 지 원하는 퍼듀 유전체학 핵심 시설에 의해 인수 되었다. 메리 Witucki 퍼듀 대학 센터에서 암 연구 여름 학부 연구 프로그램 캐롤 카운티 암 협회 지원 지원 한다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 감사 벤자민 카터, 런 닝, 그리고 테일러 Sabato 원고에 중요 한 피드백을 제공. 우리는이 작품의 생화학의 부 그리고 Zebrafish 관심과 우리의 zebrafish 식민지의 복지에 그들의 헌신에 대 한 퍼듀 대학에서 연구를 위한 센터 감사합니다. 마지막으로, 우리는 퍼듀 유전체학 핵심 시설, 감사 하 고 필립 산 미 구 엘의 기여에 대해서 NGS 서비스.

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 CRISPR Cas9 기술을 사용 하 여 zebrafish 척추 동물 모델 시스템에서 유전자 녹아웃의 생산을 설명 합니다. 프로토콜의 수는 이전 zebrafish15,25,26,50,,5152CRISPR 중재 게놈 엔지니어링 수행을 설명 되었습니다. HMA와 여러 heterozygous 생선, 만들려고 간단, 경제적, 그리고 실험적으로 강력한 프로토콜의 NGS이이 프로토콜 수 간단 하 고 그러나 reproducibly 일관 된 실험 기법, 특히에서 결합 하 여 노력 이전에 빌드 CRISPR 중재 mutagenesis zebrafish에서 실험실 다양 한 훈련 및 경험, 뿐만 아니라 교육 연구소 직원과 직원에 대 한 적절 한입니다.
RNAs는이 프로토콜에 포함 된 설명서의 설계 및 합성에 대 한 권장 사항. 가이드 RNA 설계에에서 주요 고려 대상에서 효과의 최소화입니다. CRISPR-사용자가 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스 모두 대상에 가이드의 활동 및 오프 대상 효과34, 의 기회를 예측 하는 계산 도구를 액세스할 수 있도록 여러 가지 예측 알고리즘 개발 되었습니다 35,36. 특정 zebrafish 시스템의 장점은 오프 대상 효과의 저하 속도 Cas9 배아에 주입 되며 따라서 식 과도, 있는 감소에서 대상 효과53을 마우스에 표시 되었습니다 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 오프 대상 효과 zebrafish54에 입증 되었습니다. 한 오프 대상 효과 대 한 제어 방법은이 가이드는 매우 다른 오프 대상 사이트에 영향을 미칠 가능성이 있을 것 이라고 동일한 유전자를 대상으로 하는 두 개의 독립적인 가이드 RNAs에 의해 생성 된 표현 형 설립자 zebrafish에. 이 프로토콜에서 설명 되지 않은 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 다른 방법을 높은 효율으로 수리 대상 DNA 단일 가닥 휴식을 생성 하는 돌연변이 Cas9의 사용 이다. 반대로 보완 서로 근접 내의 DNA 닉스 페어링 원하는 장소에서 효과적인 indel 형성에 결과 긴 고 오프 대상 효과55,56를 최소화 합니다.
-대상 효과의 다른 요금 이외, 다른 sgRNAs mutagenesis 원하는 대상57,,5859의 다른 비율을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 heteroduplex 밴드 형성33,40을 사용 하 여 주어진된 sgRNA mutagenesis의 효율성을 분석 하 HMA를 사용 합니다. Heteroduplex 밴드와 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 쉽게 해결할 수 있습니다 불일치를 포함 하는 PCR에서 생성 된 DNA 가닥의 교 잡에 의해 만들어집니다. 일반적으로 indel 형성을 측정 하는 데 사용 하는 다른 메서드와 달리 T7 endonuclease 등 분석 결과 또는 높은 해상도 분석25,26, HMA 잘라 일치 하지 않는 DNA, 비싼 효소를 필요 하지 않습니다.를 녹여 필요 하지 않습니다. PCR의 복잡 한 분석 곡선 녹아 있습니다. 중요 한 것은, 물고기와 함께 돌연변이 식별 하는 비용을 줄일 수 있는 노크 아웃 라인의 다음 생산에 필요한 수를 최소화 하기 위해 수 사관 수 또한 HMA를 사용 하 여 주입 된 인구에서 indel 형성의 높은 속도 확인 하는 원하는 특성.
CRISPR 기반 indels 생성의 비교적 쉽게 한 번에 여러 여러 유전자의 대립 유전자의 생성을 수 있습니다. 웹 기반 소프트웨어는 생어를 사용 하 여 heterozygous 물고기에서 단일 돌연변이의 분석에 사용할 수 있는 PCR 제품49의 연속. 경우 3 개 이상의 CRISPR 돌연변이 대립 유전자 분석은 NGS는 indel의 자연 하는 가능성이 더 비용 효과적이 접근으로 indel의 자연 하 수 오에 특징을 최대 50 다른 대립 유전자의 풀 후부 터 (참조 테이블의 재료)60,,6162. 이러한 경제 규모의 가능성이 학부 실험실 환경에서 특히 유용 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 reproducibly 필요가 적은 성인 생선을 만들어 분석 성공적으로 관심의 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하는 (특히, sgRNA)에서 높은 품질 CRISPR 시 약을 생성 하기 위한 단계별 지침을 제공 하 또한 원하는 라인 생성의 비용과 시간을 줄일 수 있습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜을 저렴 한 방식으로 돌연변이 제 브라를 생산 하는 한정 된 자원 가진 실험실에 의해 적용할 수 있는 설계 되었습니다. 또한, 우리는이 이렇게 학부생에 적합 하 고 따라서 교육 및 CRISPR 기반 게놈 편집 실습에 관심 있는 학부 학생 들의 교육 기회를 확장 발견 했다.

진핵생물에서 분자 기계의 보전 기초 연구를 위한 모형 유기 체를 사용 하 여 전원. 이러한 모델 시스템의 많은 타겟된 유전자 녹아웃 유전자 제품의 생물 학적 또는 질병 과정에의 기여 하 등 역 유전 접근의 사용을 촉진 한다. 제 브라와 같은 유기 체에서 유전자 중단 기법 역사적 DSBs1,2의 부정확 한 수리 결과 frameshift 돌연변이의 대상된 도입에 의존 했습니다. 보편적으로 거의 모든 세포 유형 및 유기 체에 존재 하는 두 경로 중 하나를 통해 DNA 병 변 복구는 DSB 게놈에 도입 하는 경우: 비 동종 끝 결합 (NHEJ)과 상 동 감독 수리 (HDR)3,4 . NHEJ 기계의 정확 하지 않은 자연 자주 다양 한 길이5,6,7,,89의 indels를 생성합니다. Frameshift 돌연변이 유전자의 코딩 순서에의 소개는 종종 유전자 작동 하지 않는 렌더링 조 숙한 정지 codon를 생성할 수 있습니다.
초기 게놈 엔지니어링 전략 홍보 indels zebrafish 포함 meganucleases, 아연 손가락 nucleases, 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases, nuclease 특정 게놈을 대상으로 DNA 단백질 상호 작용을 활용 하는 모두의 대상 DSB10,11,12,13,,1415를 도입. 그러나, 이러한 기술은 종종 힘들고 복잡 한 엔지니어링 nuclease을 대상으로 관심사의 DNA 순서를 생성 하는 데 필요한 때문에 적용 하기 어려운 있습니다. 이전 전략, 달리 CRISPR 기반 유전자 편집 하지 대상에 대 한 단백질 DNA 상호 작용에 의존지 않습니다. 대신, CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 관심16,,1718,19의 게놈 사이트 대상 염기 기본 쌍 상호 작용을 사용 하는 RNA 가이드를 통해 감독 ,,2021. 설계는 RNA의 단순 그것을 대상에 대 한 상호 작용을 페어링 원하는 자료와 가이드는 상대적으로 쉽게 원하는 장소에 Cas endonuclease 대상입니다. 유형 II CRISPR 시스템 특히 널리 개발 되었습니다는 단일 다중 도메인 Ca nuclease (Cas9) endonuclease 활동을 자극 하는 DNA와 상호 작용을 필요로 하는의 사용을 포함 한 여러 유리한 기능 게놈 편집 응용 프로그램에 대 한 사용 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 동족 DNA 시퀀스18대상. 동족 sgRNA의 대상에 대 한 필요한 순서 요구 사항을 잘 이해19, 고 원하는 sgRNA 쉽게 체 외에 전사에 의해 생성 된. 단순 하 고 CRISPR/Cas9 접근의 견고성 크게 zebrafish 및 다양 한 다른 유기 체에 타겟된 유전자 조작 용이.
크게는 타겟된 게놈 CRISPR 기반 시 약 개발의 결과로 제 브라에서 편집을 수행 하는 향상 된 능력 증가 프로세스 중앙 신경의 개발 같은 척추 생물의 상징을 공부 하는 기회 시스템입니다. Zebrafish 게놈 orthologs를 뿐만 아니라 인간22질병와 관련 된 유전자의 84%는 인간 게놈에서 발견 단백질 코딩 유전자의 70% 포함 되어 있습니다. Zebrafish 개발 전시 역 유전자 연구에 그것의 사용을 강화 하는 몇 가지 주요 자질: 배아 큰 클러치에서 누워 있다, microinjection, 및 성인 zebrafish 의무가 유전자 조작 하는 어머니 로부터 외부 개발 3 개월, 원하는 라인23의 급속 한 전파에 대 한 허용에 의해 성적으로 성숙.
수많은 프로토콜 사용할 수 있는 다양 한 생성 하 고 식별 zebrafish24,25,26,,2728,29 CRISPR 파생 indels 접근법을 설명 하는 ,,3031. 그러나,이 절차의 많은 시간 집중, 고가의 장비에 대 한 액세스를 필요 되며 제한 된 전문 기술 연구소에 대 한 일 수 있다. 여기 설명 하는 단계는 간단 하 고 강력 하 고 경제적인 CRISPR/Cas9-전략 엔지니어 zebrafish 녹아웃 라인을 제공 합니다. SgRNAs DNA oligonucleotides (oligos)를 사용 하 여 합성 하는 매우 효율적인 키트를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 되었습니다 다른 접근 비슷합니다 이전32설명. 설명된 프로토콜 포함 두 단계 특히 크게 라인 CRISPR 돌연변이의 분석을 단순화 하는: 쉽게 결정 게놈 수정의 존재 및 시퀀싱 분석의 PCR 기반 HMA33 의 단계별 사용 heterozygous zebrafish 신속 하 고 쉽게 여러 indels 경제적인 방식으로의 성격을 결정 하. 또한, 단계별 지침은 강력한 선택, 믿을 수 있는 생산 및 가이드 RNAs의 주입에 대 한 포함 되어 있습니다. 여기에 제공 된 단계에는 다양 한 전문 실험실 인원 zebrafish에 유전자 녹아웃의 식별을 가능 하 게 강력 하 고 상대적으로 저렴 한 프로토콜을 예증 하다.

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA 분석 소프트웨어. http://crispor.tefor.net/</td></tr> <tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA 분석 소프트웨어. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA 분석 소프트웨어. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR 프라이머 설계. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr>RNase-free 물 <td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td> <td>Rnase free 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> 가이드 RNA의 <td>모든 브랜드</td><td></td><td>합성. Thermo Fisher와 Qiagen은 모두 적절한 물을 운반합니다.</td></tr><tr><td>RNASE-free 에탄올</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>분자 생물학 등급 에탄올은 Rnase가 없습니다. Fischer, VWR은 적합한 에탄올을 판매합니다.</td></tr><tr><td>Cas9 단백질</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>핵 국소화 신호가 있는 Cas9 단백질.</td></tr><tr><td>표적 특이적 올리고</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>합성 가이드 RNAs.</td></tr><tr><td>PCR 프라이머 측면 가이드 RNA 절단 부위</td><td>Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td></td><td>이중이중 분석에 사용, 100-300bp 제품.</td></tr><tr><td>PCR 프라이머 측면 가이드 RNA 절단 부위</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td> <td>CRISPR-대립유전자 시퀀싱에 사용, 300-600bp 제품 권장.</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA 합성 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>체외 transccribe 가이드 RNA.</td></tr><tr>핵산의 전기영동을 위한 <td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>RNase-free 완충액.</td></tr><tr><td>6X 로드 염료</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>전기 pheresis를 위한 로딩 DNA.</td></tr><tr><td>5M 암모늄 아세테이트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>가이드 RNA 정제를 위한 클린업 시약.</td></tr><tr><td>에탄올(200프루프, 뉴클레아제 무함유)</td><td>모든 브랜드</td><td></td>의 <td>가이드 RNA 정제를 위한 세척 시약. 분자 등급 물질은 RNase가 없습니다.</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td>: <td>가이드 RNA의 합성 및 정제를 위한</td> <td>모든 브랜드</td><td></td>.</tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>표면, 장비, 유리 제품에서 RNase 오염을 제거합니다.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>DNA의 겔 전기영동을 위한 분자량 표준물.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>DNA의 겔 전기영동을 위한 분자량 표준물질.</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>전장 sgRNA가 합성되었는지 확인하기 위한 단일 가닥 RNA 마커</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>과황산 암모늄 (APS)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A3678</td><td>주조 폴리 아크릴 아미드 겔.</td></tr><tr><td>40% 폴리아크릴아미드 (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>변성 폴리아크릴아미드 겔 주조.</td></tr><tr><td>우레아</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>주조 변성 폴리아크릴아미드 겔.</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>전기영동을 위해 변성 겔에 가이드 RNA를 로딩합니다.</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>핵산 시각화.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 dsDNA를 검출하기 위한 브롬화 에티듐의 대체 방법.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA clean up, PCR 정제.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>PCR을 사용한 DNA 증폭용.</td></tr><tr><td>Thermocycler:</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>PCR 증폭.</td></tr><tr><td>분광 광도계</td>: <td>DNA/RNA의 amout를 정량화하는 모든 브랜드</td><td></td><td></td> NanoDrop 또는 관련 제품.</tr><tr><td>E3 배아 배지</td> 배아를 키우고 injeciton 플레이트를 만들기 위한 <td>사내</td><td></td><td>미디어. 레시피: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td>을 <td>배아의 진균 성장을 방지하기 위해 1x E3 배지에 첨가했습니다.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Store 배아, 캐스트 주입 플레이트.</td></tr><tr><td>아가 로즈</td><td>덴빌</td><td>CA3510-8</td><td>주조 사출 플레이트, 아가 로즈 젤.</td></tr><tr><td>Microinection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>주입 중에 배아를 담을 수 있는 우물을 만듭니다.</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0290&nbsp;</td><td>주입 시각화를 위한 염료.</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>바늘 주입량을 보정합니다.</td></tr><tr><td>피펫 이송</td><td>모든 브랜드</td><td></td>의 <td>움직이는 배아.</td></tr><tr><td>면도</td>날 <td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>절단 주사 바늘, 꼬리 깎기 성인 물고기.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>배아를 28.5 oC로 유지합니다.</td></tr><tr><td>Verticle 피펫 풀러</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>주입용 바늘을 생성합니다. 추가 바늘 당기는 지침: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>모세관</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>주입용 바늘을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Microloader 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>용액을 주삿바늘에 주입합니다.</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>배아 주입.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>주입 배아.</td></tr><tr><td>30% 폴리아실아미드 (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>헤테로듀플렉스 겔 캐스팅.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td>은 <td>배아에서 꼬리 자르기 및 gDNA 추출을 위해 제브라피시를 마취합니다. 조리법 : https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>주조 사출 플레이트, 아가 로즈 젤.</td></tr><tr><td>규모</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>주조 사출 플레이트, 아가로 스 젤.</td></tr><tr><td>장갑</td>: <td>모든 브랜드</td><td></td><td>: 프로토콜의 모든 측면.</td></tr><tr><td>N2</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>: 배아 주입을 위해 모세혈관에서 액체를 배출합니다.</td></tr><tr><td>1,000 &마이크로; 엘&nbsp; 팁</td><td>: 모든 브랜드</td><td></td><td>프로토콜의 모든 측면.</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 팁</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>프로토콜의 모든 측면.</td></tr><tr><td>10 & 마이크로; L 팁</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td>프로토콜의 모든 측면.</td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>: 프로토콜의 모든 측면에 대한</td> <td>모든 브랜드</td><td></td>.</tr><tr><td>마이크로피펫:</td> 프로토콜<td>의 모든 측면에 대한</td> <td>모든 브랜드</td><td></td>.</tr><tr><td>NGS 시퀀싱 플랫폼: Wideseq</td><td></td><td></td><td>귀하의 기관에서 이 서비스를 제공하지 않는 경우: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/(외부 비용: $35).</td></tr><tr><td>이</td><td></td><td></td><td>형접합 어류의 Sanger 염기서열분석용 소프트웨어. http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>염기서열분석</td><td></td><td></td>소프트웨어(Software for <td>sequenceanalysis) SnapGene Viewer, NGS 염기서열분석(NGS sequencing) 분석을 위한 염기서열 스캐너(Sequence Scanner)를 방문하십시오.</td></tr></tbody></table>

효율적인 생산 및 모델 시스템 danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 crispr/cas9 생성

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복의 연쇄 상 구 균 pyogenes (CRISPR) 시스템의 다양 한 유전자 수정을 빠르게 생성 하는 사용자 정의 플랫폼의 개발 활성화 생물, zebrafish를 포함 하 여 CRISPR 기반 게놈 편집 사용 하 여 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 관심, genomic DNA (gDNA) 대상에 CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 대상 Cas endonuclease 두 배 물가 틈 (DSB)을 생성. 삽입 또는 삭제 (indels) 오류가 메커니즘 리드에 의해 DSBs의 수리. 이 종종 소개 함으로써 단백질 null 대립 유전자를 만드는 코딩 시퀀스 내에서 조 숙한 정지 codon frameshift 돌연변이 일으킬 수 있습니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링만 몇 분자 구성 요소를 필요로 하 고 쉽게 microinjection에 의해 zebrafish 태아에 도입. 이 프로토콜 zebrafish microinjection에 대 한 시 약 CRISPR를 생성 하 고 CRISPR 수정 유전자의 생식 전송 전시 물고기를 식별 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 sgRNAs, microinjection CRISPR 시 약의 indels heteroduplex 이동성 분석 결과 (HMA), 및 특성화는 indels의 PCR 기반 메서드를 사용 하 여 대상 사이트에 유도의 식별에 생체 외 녹음 포함 낮은 처리량 및 강력한 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여-기반 접근 heterozygous 물고기에서 수집 하는 여러 PCR 제품을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필요한 물고기의 수와 종류의 분석을 수행 하는 데 필요한 장비를 최소화 하기 위해 유선형의. 또한,이 프로토콜은 되도록 설계 되었습니다 사용에 대 한 의무가 학부생, CRISPR 기반 수행에 관심이 있는 연구 그룹에 의해 경제적으로 고용 될이 강력한 도구를 사용 하면 포함 하는 경험의 모든 수준의 실험실 개인에 의해 제 브라에 게놈 수정입니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 실험 방법의 제 브라 노크 아웃 라인 CRISPR/Cas9 기술을 사용 하 여 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 수 있습니다. 다음 수치 해석 및이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 문제 해결이 문서에 포함 되었습니다. 다음 성공적인 생산 그리고 CRISPR 시 약의 microinjection, zebrafish 태아 명백한 고기 및 indel 형성 HMA를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. CRISPR 실험의 성공을 시각화 하는 유용한 컨트롤은 안료 생산 유전자를 대상으로 1.5 단계에서 설명 하는 sgRNA 사용 하 여 tyrosinase. Cas9 유도 indel tyrosinase 에서 염색의 손실에 결과 형성과 48에 의해 쉽게 득점 hpf (그림 1). 주입에 성공 했다에 대 한 CRISPR 시 약의 그 준비를 위해 또 다른 유용한 제어는 전체 길이 확인 하는 것입니다 (120 nt) sgRNA 변성 polyacrylamide 젤 (그림 2, 레인 1와 2)를 사용 하 여 합성 되어 있다. RNA를 타락 하는 경우 그것은 나타날 수 있습니다 얼룩, 예를 들어 레인 3 (그림 2)은 저하 RNA 사출에 적합 하지 않습니다.
Tyrosinase, 같은 명백한 고기 초래 하지 않는 CRISPR Cas9 대상 유전자의 indel 형성 주파수 분석을 HMA 분석은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. sgRNA/Cas9 heteroduplex 밴드의 형성 및 homoduplex 밴드 (그림 4)의 강렬의 감소에서 HMA 결과 사용 하 여 분석 하는 배아를 주입. Heteroduplex 밴드의 존재는 더 잠재적인 설립자 물고기 (그림 4 및 그림 5), 성인 설립자 ( 의 생식 전송 효율을 분석 하 고 microinjected 배아에서 식별 하기 위해이 프로토콜에 활용 그림 6), 그리고는 indel heterozygous F1 물고기 (그림 7)의 존재를 확인 하. Heterozygous 물고기는 indel을 포함 하는 후보로 NGS는 indel의 성격을 파악 하 고 조 숙한 정지 codon 대상 유전자의 코딩 지구에 존재 여부를 확인 하는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> 그림 1 : Zebrafish 태아 전시 tyrosinase 1 셀 단계에서 대상으로 하는 sgRNA와 함께 주입 했을 때 안료 결함. (A) 야생-타입, uninjected 48에 배아 hpf와 (B) 주입 48에서 배아 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> 그림 2 : 합성 키트를 사용 하 여 sgRNA의 녹음 방송 생체 외에서 . Oligos는 sgRNA 종합 키트 지침에 따르면 녹음 방송 생체 외에서 를 사용 하 여 합성 했다. 500 ng RNA의 설명 된 대로 요소/페이지 젤에 실행 했다. sgRNA 레인 1과 2에 로드 밴드 전체 길이 그대로 120 nt RNA에 해당 표시 됩니다. 레인 3에 sgRNA 사출에 적합 하지 않습니다 저하 RNA 샘플을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> 그림 3 : 24 hpf 주입 태아의 건강의 비교. 24 생활 배아 (A) 개발 hpf, (B) 개발 중단은 배아에서 쉽게 구별 된다. (B)를 닮은 나 크게 있는 태아 척추 곡률 등 (a) 기능을 변경 또는 머리를 변경 및 눈 개발 접시에서 제거 되어야 합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> 그림 4 : SgRNA Cas9의 Heteroduplex 이동성 분석 결과 zebrafish 태아 microinjected. 샘플 당 5 배아의 풀 72에서 수집 된 hpf 및 gDNA 추출 되었다. Heteroduplex 분석 수행, 설명 된 대로 샘플 500 동등 하 게 로드 된 DNA의 ng. 레인: M = 100 bp 마커; 1 = uninjected 제어; 2 사출 샘플 1; = 3 = 사출 샘플 2. 예상 밴드 크기 98 = 혈압.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> 그림 5 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 gDNA 성인 CRISPR 주입 zebrafish의 꼬리에서 추출의. 배아는 sgRNA와 Cas9 단백질 주입 했다 성인 (3 개월)로 성장 했다. 물고기 B와 C heteroduplex 악대를 전시 하 고 이후에 생식 전송 indels;을 식별 하기 위해 사육 했다 긍정적인 heteroduplex 밴드를 전시 하지 않습니다 때문에 물고기 A는 이후 분석에 사용 되지 않습니다. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기; 3 = 물고기 B; 4 물고기 C. 예상 밴드 크기 = 98 = bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> 그림 6 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 단일 배아 전송 생식 indels를 식별 하는 야생-타입 물고기 F0 CRISPR 주입 제 브라를 번 식에 의해 생성 된의. Zebrafish 성관계 했다 F1 배아 72 h. 단일 배아에 대 한 성장 수집 그리고 heteroduplex 분석 수행 설명 된 대로. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2-10 차선 당 하나의 F1 배아를 =. 이 젤 10 중 7 배아는 indel의 70%의 생식 전송 속도 나타내는 긍정적인 heteroduplex 밴드 표시 보여줍니다. 밴드 크기 예상 = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> 그림 7 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 성인 F1 zebrafish 꼬리 클립의. 성인 F1 물고기 HMA indels를 식별 하 여 득점 했다. 긍정적인 heteroduplex 밴드 전시 물고기가 했다 PCR 증폭 및 넓은 시퀀싱 분석에 대 한 돌연변이의 특성을 확인 하. (A) 차선: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기 (4 혈압 삭제, 1 bp 불일치). (B)이이 F1 생선과 같은 설립자에서 확인 되었다 아직 다른 heteroduplex 패턴화, 하나의 설립자에서 여러 수정 된 대립 유전자의 생식 전송을 나타내는 표시. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 물고기 (4 bp 삽입, 7 bp 불일치), B = 3 = 물고기 C (4 혈압 삭제, 4 혈압 불일치). 각 이러한 indels NGS 정한 대상 유전자의 코딩 순서에서 조 숙한 정지 codon를 만들었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시에서 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 표적 게놈 편집을 수행하여 강력하고 저렴한 방식으로 유전자 knockout을 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 척추동물 모델 시스템의 맥락에서 유전자가 고차원 진핵생물의 발달 과정에 어떻게 기여하는지와 같은 유전자의 생물학적 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 간단하고 강력한 절차를 통해 학부생을 포함한 모든 수준의 경험을 가진 실험실 직원이 제브라피시에서 표적 게놈 변형을 수행할 수 있습니다.이 방법을 처음 접하는 개인은 CRISPR 돌연변이 유발에 대한 최적의 게놈 표적을 식별하고, 제브라피시 배아 미세주입을 수행하고, 변형된 대립유전자를 식별하기 위한 단계별 지침을 따를 수 있어야 합니다. 이 방법은 하나 이상의 필요한 기술에 익숙하지 않을 수 있는 학부생을 대상으로 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 가이드 RNA 생산을 위한 주형 특이적 올리고의 설계에 대한 지침은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.먼저 Cas9 단백질을 완충액에 현탁시켜 1밀리리터당 1밀리그램 용액을 생성합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 용액을 주입 가능한 섭씨 영하 80도의 부분 표본에 보관하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 이 기사의 재료에 제안된 것과 같은 체외 전사 키트와 함께 sgRNA를 합성합니다.RNAse free ammonium acetate precipitation을 사용하여 합성된 sgRNA를 정제합니다. 합성된 RNA에 25마이크로리터의 5몰 암모늄 아세테이트를 첨가하고 와류로 용액을 혼합합니다. 다음으로, 150마이크로리터의 200프루프 뉴클레아제 프리 에탄올을 샘플에 추가합니다.그리고 반응을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 최소 20분 동안 두십시오. 그 후, 최대 속도로 샘플을 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.그런 다음 70% 에탄올 1ml를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 튜브에서 잔류 소금을 씻어냅니다. 다시 원심분리기를 섭씨 4도에서 최대 속도로 7분 동안 가열합니다. P1000 피펫을 사용하여 대부분의 용액을 제거합니다.그런 다음 P200 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 남은 용액을 최대한 제거합니다. RNAse 오염을 방지하기 위해 주의하면서 튜브에 액체 방울이 보이지 않을 때까지 깨끗한 공간에서 펠릿을 건조시킵니다. 펠릿을 30마이크로리터의 RNAse 자유수에 재현탁시키고 분광 광도계를 사용하여 생성물을 정량화합니다.섭씨 영하 80도에서 장기 보관을 위해 용액을 분취하십시오. 다음으로 300-500 나노그램의 sgRNA와 동일한 부피의 2X RNA 겔 로딩 염료를 혼합합니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 러닝 버퍼로 각 아가로스 젤 웰의 파편을 여러 번 제거합니다.용액을 아가로스 겔 웰에 로드하고 겔의 RNA 밴드를 분리하기에 충분한 시간 동안 센티미터당 10볼트로 겔을 실행합니다. 시간은 전기영동 장치에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 염료 전면은 젤 길이의 2/3로 실행되어야 합니다.그런 다음 핵산 염색을 사용하여 밴드를 시각화합니다. 온전한 RNA는 여기에 표시된 1번 및 2번 레인과 같은 단일 밴드로 나타납니다. 분해된 RNA는 3번째 레인에서와 같이 도말로 실행됩니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 주사를 수행하기 전날 밤에 제브라피시 피험자가 번식할 수 있도록 준비합니다. 그런 다음 Cas9 단백질과 sgRNA를 2:1 비율로 결합합니다. Cas9 및 sgRNA가 리보핵단백질 복합체를 형성하는 동안 실온에서 용액을 5분 동안 배양합니다.그런 다음 충분한 RNAse 자유수에 0.5 마이크로 리터의 2.5 % 페놀 레드 용액을 첨가하여 5 마이크로 리터의 최종 부피를 얻습니다. 주사 바늘을 준비하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1mm 유리 모세관을 당깁니다. 그런 다음 결과 생성된 유리 바늘의 끝을 면도날로 잘라 각진 구멍을 얻습니다.마이크로인젝터에 부착된 마이크로매니퓰레이터에 바늘을 넣습니다. 광학 현미경을 사용하여 바늘이 페트리 접시에 1나노미터의 용액을 일관되게 주입할 때까지 주입 압력을 조정합니다. 배아 미세주입을 시행하기 전에 염료 전용 용액을 사용하여 바늘 준비 및 대조 배아를 주입하는 연습을 하고 발달 24시간 후 생존을 기록합니다.주입하지 않은 대조군에 비해 90% 이상의 생존율을 얻을 수 있어야 합니다. 다음으로, 10-15개의 배아를 대조군 집단으로 선택하고 라벨이 붙은 별도의 페트리 접시에 넣습니다. 전사 피펫을 사용하여 나머지 배아를 실온 주입판에 조심스럽게 정렬합니다.해부 현미경으로 1나노리터의 용액을 각 배아의 난황낭에 주입합니다. 그런 다음 주입된 배아를 라벨이 부착된 페트리 접시에 다시 넣고 메틸렌 블루가 함유된 1X E3 배지로 덮습니다. 주입된 배아를 섭씨 28도의 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.그런 다음 주입된 배아를 검사하여 죽거나 비정상적으로 발달하는 개체를 제거합니다. 먼저, 주입된 배아가 들어 있는 플레이트에서 72시간 된 배아 5개 2세트를 채취하고, 주입되지 않은 대조군에서 72시간 된 배아 5개 한 세트를 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 각 배아 세트의 배지를 부드럽게 피펫으로 제거하고 마취합니다.2분 후 마취제를 제거하고 50밀리몰 수산화나트륨 45마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 95도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 실온으로 식힙니다.1몰 pH tris hydrochloride 5마이크로리터를 넣고 샘플을 격렬하게 와류시킵니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 최대 속도로 용액을 원심분리합니다. 게놈 DNA를 함유한 상등액을 표지된 새 튜브로 옮기고 gDNA를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.heteroduplex 분석을 위한 PCR 단편을 증폭하기 위해 텍스트에 설명된 대로 sgRNA 타겟 영역 주위를 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용합니다. PCR 클린업 키트를 사용하여 PCR 반응 산물을 정제합니다. 샘플을 30마이크로리터의 물에 희석하고 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다.PCR 앰플리콘이 들어있는 튜브를 끓는 물 수조의 플로팅 랙에 놓습니다. 다음으로 30% 폴리아크릴아미드를 사용하여 15% 폴리아크릴아미드 TBE 겔을 준비합니다. 겔이 굳은 후 TBE 러닝 버퍼가 있는 전기영동 장치에 넣습니다.그런 다음 500나노그램의 재어닐링된 PCR 산물을 로드하고 각 sgRNA 샘플 세트 옆에 대조군을 로드합니다. 150볼트에서 2시간 30분 동안 또는 염료 전면이 젤 바닥에 올 때까지 젤을 실행합니다. HMA에서 이종이중 띠를 보이는 주입된 제브라피시 배아를 성인으로 성장시킵니다.HMA를 해석하기 위해, 야생형 비주입 대조군의 PCR에서 상응하는 주입된 샘플과 호모듀플렉스 밴드의 강도를 비교하십시오. 충분한 절단이 발생하면 주입된 물고기의 밴드 강도는 야생형 대조군보다 약 50% 낮아야 합니다. 잠재적인 창시자 부모 물고기에 인델의 존재를 확인하려면 0.004%트리카인을 물고기에 마취시키고 깨끗한 면도날을 사용하여 꼬리 지느러미의 1/2에서 3/4을 제거합니다.그런 다음 꼬리를 45마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨에 넣습니다. 물고기를 회수 탱크로 되돌려 놓고 앞에서 설명한 대로 gDNA 추출을 수행합니다. 다음으로, 꼬리 클립 gDNA에 HMA를 수행하여 개체가 CRISPR 주입에 의해 성공적으로 변형되었는지 확인합니다.그런 다음 꼬리 DNA에 이질이중 띠를 보이는 성체를 야생형 물고기와 교배시킵니다. 풀의 HMA 분석을 기반으로 F1 물고기를 생성하려면 파운더 물고기를 선택합니다. 마지막으로, 관심 물고기의 gDNA를 염기서열 분석하여 indel의 특성을 특성화합니다.CRISPR 시약의 성공적인 생산 및 미량 주입에 이어, HMA를 사용하여 제브라피시 배아를 분석하여 명백한 표현형과 인델 형성을 분석했습니다. 티로시나아제(tyrosinase)에서 Cas9 유도 인델 형성은 색소 침착 손실의 결과이며 수정 후 48시간까지 쉽게 점수가 매겨집니다. 명백한 발달 표현형을 초래하지 않는 CRISPR 변형 대립유전자의 식별은 HMA를 사용하여 수행됩니다.관심 유전자의 성공적인 표적화는 이중이중 밴드의 형성과 3차 및 4차선과 같은 호모듀플렉스 밴드의 강도 감소를 초래합니다. 척추 동물과 함께 일하는 것은 윤리적 책임을 수반한다는 것을 잊지 말자. 이 프로토콜은 녹아웃을 얻는 데 필요한 제브라피쉬의 수를 최소화하는 전략을 설명하며, 이 절차를 수행하는 동안 고려해야 하는 목표입니다.일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 생식계에서 높은 효율로 전달될 CRISPR 변형 대립유전자를 운반하는 제브라피시를 빠르게 생성하고 식별할 수 있습니다. 중요한 것은 이 기술이 학부생과 사전 경험이 거의 없는 사람들이 사용할 수 있는 저렴한 접근 방식으로 최적화되었다는 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시를 사용하여 CRISPR 기반 유전자 녹아웃 접근 방식을 쉽게 설계하고 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 제브라피시 난황낭에 화합물을 전달하는 배아 미세주입 기술에 대해 설명합니다.

배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F0 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

이 문서에서는 RNA 표적 Cas13D 효소(RfxCas13D)를 파리에서 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

CRISPR/CasRx를 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 에서 유비쿼터스 및 조직 별 RNA 표적화

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

배우세요 CRISPR/Cas9를 이용한 Danio rerio 유전자 녹아웃 생성 및 식별 방법입니다. 이 프로토콜은 차세대 시퀀싱과 헤테로듀플렉스 이동성 분석을 통해 효율적인 게놈 편집을 가능하게 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

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