효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시에서 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 표적 게놈 편집을 수행하여 강력하고 저렴한 방식으로 유전자 knockout을 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 척추동물 모델 시스템의 맥락에서 유전자가 고차원 진핵생물의 발달 과정에 어떻게 기여하는지와 같은 유전자의 생물학적 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 간단하고 강력한 절차를 통해 학부생을 포함한 모든 수준의 경험을 가진 실험실 직원이 제브라피시에서 표적 게놈 변형을 수행할 수 있습니다.

이 방법을 처음 접하는 개인은 CRISPR 돌연변이 유발에 대한 최적의 게놈 표적을 식별하고, 제브라피시 배아 미세주입을 수행하고, 변형된 대립유전자를 식별하기 위한 단계별 지침을 따를 수 있어야 합니다. 이 방법은 하나 이상의 필요한 기술에 익숙하지 않을 수 있는 학부생을 대상으로 하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 가이드 RNA 생산을 위한 주형 특이적 올리고의 설계에 대한 지침은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.

먼저 Cas9 단백질을 완충액에 현탁시켜 1밀리리터당 1밀리그램 용액을 생성합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 용액을 주입 가능한 섭씨 영하 80도의 부분 표본에 보관하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 이 기사의 재료에 제안된 것과 같은 체외 전사 키트와 함께 sgRNA를 합성합니다.

RNAse free ammonium acetate precipitation을 사용하여 합성된 sgRNA를 정제합니다. 합성된 RNA에 25마이크로리터의 5몰 암모늄 아세테이트를 첨가하고 와류로 용액을 혼합합니다. 다음으로, 150마이크로리터의 200프루프 뉴클레아제 프리 에탄올을 샘플에 추가합니다.

그리고 반응을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 최소 20분 동안 두십시오. 그 후, 최대 속도로 샘플을 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.

그런 다음 70% 에탄올 1ml를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 튜브에서 잔류 소금을 씻어냅니다. 다시 원심분리기를 섭씨 4도에서 최대 속도로 7분 동안 가열합니다. P1000 피펫을 사용하여 대부분의 용액을 제거합니다.

그런 다음 P200 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 남은 용액을 최대한 제거합니다. RNAse 오염을 방지하기 위해 주의하면서 튜브에 액체 방울이 보이지 않을 때까지 깨끗한 공간에서 펠릿을 건조시킵니다. 펠릿을 30마이크로리터의 RNAse 자유수에 재현탁시키고 분광 광도계를 사용하여 생성물을 정량화합니다.

씨 영하 80도에서 장기 보관을 위해 용액을 분취하십시오. 다음으로 300-500 나노그램의 sgRNA와 동일한 부피의 2X RNA 겔 로딩 염료를 혼합합니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 러닝 버퍼로 각 아가로스 젤 웰의 파편을 여러 번 제거합니다.

용액을 아가로스 겔 웰에 로드하고 겔의 RNA 밴드를 분리하기에 충분한 시간 동안 센티미터당 10볼트로 겔을 실행합니다. 시간은 전기영동 장치에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 염료 전면은 젤 길이의 2/3로 실행되어야 합니다.

그런 다음 핵산 염색을 사용하여 밴드를 시각화합니다. 온전한 RNA는 여기에 표시된 1번 및 2번 레인과 같은 단일 밴드로 나타납니다. 분해된 RNA는 3번째 레인에서와 같이 도말로 실행됩니다.

먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 주사를 수행하기 전날 밤에 제브라피시 피험자가 번식할 수 있도록 준비합니다. 그런 다음 Cas9 단백질과 sgRNA를 2:1 비율로 결합합니다. Cas9 및 sgRNA가 리보핵단백질 복합체를 형성하는 동안 실온에서 용액을 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 충분한 RNAse 자유수에 0.5 마이크로 리터의 2.5 % 페놀 레드 용액을 첨가하여 5 마이크로 리터의 최종 부피를 얻습니다. 주사 바늘을 준비하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1mm 유리 모세관을 당깁니다. 그런 다음 결과 생성된 유리 바늘의 끝을 면도날로 잘라 각진 구멍을 얻습니다.

마이크로인젝터에 부착된 마이크로매니퓰레이터에 바늘을 넣습니다. 광학 현미경을 사용하여 바늘이 페트리 접시에 1나노미터의 용액을 일관되게 주입할 때까지 주입 압력을 조정합니다. 배아 미세주입을 시행하기 전에 염료 전용 용액을 사용하여 바늘 준비 및 대조 배아를 주입하는 연습을 하고 발달 24시간 후 생존을 기록합니다.

주입하지 않은 대조군에 비해 90% 이상의 생존율을 얻을 수 있어야 합니다. 다음으로, 10-15개의 배아를 대조군 집단으로 선택하고 라벨이 붙은 별도의 페트리 접시에 넣습니다. 전사 피펫을 사용하여 나머지 배아를 실온 주입판에 조심스럽게 정렬합니다.

해부 현미경으로 1나노리터의 용액을 각 배아의 난황낭에 주입합니다. 그런 다음 주입된 배아를 라벨이 부착된 페트리 접시에 다시 넣고 메틸렌 블루가 함유된 1X E3 배지로 덮습니다. 주입된 배아를 섭씨 28도의 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.

그런 다음 주입된 배아를 검사하여 죽거나 비정상적으로 발달하는 개체를 제거합니다. 먼저, 주입된 배아가 들어 있는 플레이트에서 72시간 된 배아 5개 2세트를 채취하고, 주입되지 않은 대조군에서 72시간 된 배아 5개 한 세트를 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. 각 배아 세트의 배지를 부드럽게 피펫으로 제거하고 마취합니다.

2분 후 마취제를 제거하고 50밀리몰 수산화나트륨 45마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 95도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 실온으로 식힙니다.

1몰 pH tris hydrochloride 5마이크로리터를 넣고 샘플을 격렬하게 와류시킵니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 최대 속도로 용액을 원심분리합니다. 게놈 DNA를 함유한 상등액을 표지된 새 튜브로 옮기고 gDNA를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

heteroduplex 분석을 위한 PCR 단편을 증폭하기 위해 텍스트에 설명된 대로 sgRNA 타겟 영역 주위를 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용합니다. PCR 클린업 키트를 사용하여 PCR 반응 산물을 정제합니다. 샘플을 30마이크로리터의 물에 희석하고 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다.

PCR 앰플리콘이 들어있는 튜브를 끓는 물 수조의 플로팅 랙에 놓습니다. 다음으로 30% 폴리아크릴아미드를 사용하여 15% 폴리아크릴아미드 TBE 겔을 준비합니다. 겔이 굳은 후 TBE 러닝 버퍼가 있는 전기영동 장치에 넣습니다.

그런 다음 500나노그램의 재어닐링된 PCR 산물을 로드하고 각 sgRNA 샘플 세트 옆에 대조군을 로드합니다. 150볼트에서 2시간 30분 동안 또는 염료 전면이 젤 바닥에 올 때까지 젤을 실행합니다. HMA에서 이종이중 띠를 보이는 주입된 제브라피시 배아를 성인으로 성장시킵니다.

HMA를 해석하기 위해, 야생형 비주입 대조군의 PCR에서 상응하는 주입된 샘플과 호모듀플렉스 밴드의 강도를 비교하십시오. 충분한 절단이 발생하면 주입된 물고기의 밴드 강도는 야생형 대조군보다 약 50% 낮아야 합니다. 잠재적인 창시자 부모 물고기에 인델의 존재를 확인하려면 0.004%트리카인을 물고기에 마취시키고 깨끗한 면도날을 사용하여 꼬리 지느러미의 1/2에서 3/4을 제거합니다.

그런 다음 꼬리를 45마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨에 넣습니다. 물고기를 회수 탱크로 되돌려 놓고 앞에서 설명한 대로 gDNA 추출을 수행합니다. 다음으로, 꼬리 클립 gDNA에 HMA를 수행하여 개체가 CRISPR 주입에 의해 성공적으로 변형되었는지 확인합니다.

그런 다음 꼬리 DNA에 이질이중 띠를 보이는 성체를 야생형 물고기와 교배시킵니다. 풀의 HMA 분석을 기반으로 F1 물고기를 생성하려면 파운더 물고기를 선택합니다. 마지막으로, 관심 물고기의 gDNA를 염기서열 분석하여 indel의 특성을 특성화합니다.

CRISPR 시약의 성공적인 생산 및 미량 주입에 이어, HMA를 사용하여 제브라피시 배아를 분석하여 명백한 표현형과 인델 형성을 분석했습니다. 티로시나아제(tyrosinase)에서 Cas9 유도 인델 형성은 색소 침착 손실의 결과이며 수정 후 48시간까지 쉽게 점수가 매겨집니다. 명백한 발달 표현형을 초래하지 않는 CRISPR 변형 대립유전자의 식별은 HMA를 사용하여 수행됩니다.

관심 유전자의 성공적인 표적화는 이중이중 밴드의 형성과 3차 및 4차선과 같은 호모듀플렉스 밴드의 강도 감소를 초래합니다. 척추 동물과 함께 일하는 것은 윤리적 책임을 수반한다는 것을 잊지 말자. 이 프로토콜은 녹아웃을 얻는 데 필요한 제브라피쉬의 수를 최소화하는 전략을 설명하며, 이 절차를 수행하는 동안 고려해야 하는 목표입니다.

일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 생식계에서 높은 효율로 전달될 CRISPR 변형 대립유전자를 운반하는 제브라피시를 빠르게 생성하고 식별할 수 있습니다. 중요한 것은 이 기술이 학부생과 사전 경험이 거의 없는 사람들이 사용할 수 있는 저렴한 접근 방식으로 최적화되었다는 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시를 사용하여 CRISPR 기반 유전자 녹아웃 접근 방식을 쉽게 설계하고 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.