Name: BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소의 분리 및 정량화 방법을. 면역침전과 형광 단백질 리포터 시스템을 사용하여 식품 및 환경 샘플에서 BoNT 활성을 측정하는 기술입니다.

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저자는 가치있는 토론과 조언을 H. 올리바 레스와 D. Ruge에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NSF SBIR 상 (BioSentinel 주식에 IIP-1127245)와 국방부 계약 (BioSentinel 주식에 W81XWH-07-2-0045)에 의해 부분적으로 지원되었다.

FM 독촉, TM 광장, F. Zeytin의, 및 WC 터커 BioSentinel 주식 BioSentinel의 직원 또는 소유자입니다 현재 생산이 보고서에서 제시 한 시약을 상용화했다.

이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 56, 60와 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수정은 특정한 샘플 조성 및 원하는 애플리케이션에 따라 요구 될 수있다. 행렬은 식품 샘플 (예 : 식품 도전 테스트) 또는 제약 부형제 버퍼 (예 : 본트 기반 약물 제품 테스트)를 포함 할 수 있습니다. 단지 비 식품 (예를 들어, 동물 조직 또는 환경) 액체와 고체 시료는 식품 샘플로 취급되어야한다. 이 프로토콜은 200 μL / 잘 샘플 볼륨을 사용하지만, 적은 50 μL / 잘 배 Bindin의 볼륨에 해당하는 조정으...

보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / 1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 3-5 인코딩 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 7-14 선도. 일반적으로 질병 &quot;보툴리누스 중독,&quot;본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다. 인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 (15, 16)의 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 (17, 18) 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 22 일을 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 (23, 24). 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다. 본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 &quot;오프 라벨&quot;응용 프로그램은 심각한 근육 장애 25-28를위한 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS 29-31. 본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A (34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다. BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 56, 60에있는 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬​​을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 (56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다. BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 56, 60과 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 56, 60 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A 보툴리눔 신경독소 검출 키트</td>, <td>BoNT/B 및 F용</td> <td>BioSentinel</td><td>A1015</td> 검출 키트도 사용할 수 있습니다.</tr><tr><td>Varioskan 플래시 형광 마이크로플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>434nm 여기와 470nm 및 526nm 방출 기능을 갖춘 대부분의 모노크로메이터 또는 필터 기반 장치를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>96웰 마그네틱 비드 분리 플레이트</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>다른 자성판을 사용할 수 있지만 플레이트는 비드를 우물 측면으로 분리하도록 설계되어야 합니다.</td></tr><tr><td>마그네틱 비드 호환 플레이트 워셔</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>선택 사항, 자동 플레이트 워싱에만 필요합니다.&nbsp; 다른 마그네틱 비드 호환 플레이트 와셔도 사용할 수 있지만 사용하기 전에 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td>옵션, 원심분리가 필요한 샘플에만 필요합니다.</td></tr><tr><td>MixMate 플레이트 믹서</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>실온 또는 25°C; C 온도 제어가 가능한 경우</td></tr><tr><td>EDTA가 없는 프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>식품 또는 환경 테스트에만 필요합니다. 프로테아제 억제제는 EDTA가 없어야 합니다.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>메타생물학제는</td><td></td><td>선택 사항, 표준화 및 정량화 목적으로만 필요</td></tr>함 <tr><td>검은색, 바닥이 평평한 96웰 플레이트</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>플레이트는 처리해서는 안 됨</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 밀봉 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

botest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 - 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.

설명 된 프로토콜의 단계를 요약 한 도면이도 2에 도시된다. 분석은 샘플의 종류와 원하는 분석 감도에 따라 완료하는 데 4-26 시간 사이에 필요하지만 만 ~ 2 시간 시간 실습. 어 세이는 96 - 웰 플레이트에서 수행하고, 테스트가 수행되는 분류에 따라서는, 접시 당 표준을 포함​​하여 최대 20 샘플 중으로 시험한다. 그림 3은 본트를 사용하는 대표적인 분석 결과를 보여줍니다 / A holotoxin는 PBS로 아군 및 A / E 기자 2, 4, 24 시간 배양 한 다음 설명 프로토콜 테스트. 정제 BONT / A holotoxin는 ~ 150 kDa의 그것의 정의 분자량이 독소 복합체에 대한보다 광범위하게 정의 된 700 ~ 900 kDa의 비교 때문에이 실험을 위해 선택하고, 순도는 정확한 농도에서 매우 정확한 스파이크를 허용했다. 발광 비율, 470 ㎚에서의 그것과 526 nm에서의 방출의 비는 (434)...

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

본 절차의 전반적인 목적은 의약품, 환경 및 식품 샘플과 같은 복잡한 매질 내 보툴리눔 신경독소의 단백질 분해 활성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 필요한 경우 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플을 처리하여 적절한 pH 및 점도 조건을 설정함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, 항체가 코팅된 자기 비드를 사용하여 샘플로부터 보툴리눔 신경독소를 면역 침전시킵니다.그 후, 방해 화합물을 제거하기 위해 자성 비드(magnetic beads)를 충분히 세척하고 최적화된 반응 버퍼에 재현탁합니다. 마지막으로, 세척된 비드를 단백질 리포터와 함께 배양하고 시간에 따른 리포터의 절단을 분광학적으로 측정합니다. 최종적으로, 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플의 리포터 절단 정도를 비교하여 테스트 샘플 내 보툴리늄 독소의 활성을 마우스 수준 또는 마우스 생물학적 분석법에 근접한 감도로 정량화합니다.마우스, 생물학적 분석, 면역학적 분석 및 기타 형광법과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 동물 사용이 필요하지 않으며, 식품, 환경 및 제약 시료에서 발견되는 매우 복잡한 매트릭스에서도 사용할 수 있음이 입증되었다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 세밀한 시료 처리와 희석 과정이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 실험 절차는 Bio Sentinel의 과학자인 Dr.Mark Dunning이 시연할 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 버퍼를 준비하여 테스트 시료 정량을 위한 표준 곡선을 생성합니다. 50 mL 원추형 튜브에 10 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣고 따로 둡니다. 이 시료는 희석제로 사용됩니다. 두 번째 튜브에 2 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣습니다. 2 g의 식품 시료 표면에 보툴리눔 신경독소(BoNT)를 첨가하여 식품 1 g당 최종 농도가 30,000 MLD₅₀이 되도록 합니다. BoNT가 식품 매질과 상호작용할 수 있도록 희석제와 스파이킹된 시료를 실온 또는 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다.천연 오염 상태를 모방하기 위해, 추가 시료 유형에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 스파이킹된 시료와 스파이킹되지 않은 시료의 식품 1 g당 1 mL의 GPB를 첨가하고, 유발을 사용하여 완전히 혼합될 때까지 균질화하십시오. 10 g 희석 시료의 대략적인 총 부피를 바탕으로, 2 g 스파이킹 시료의 총 부피를 추산하십시

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연구

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Neuroscience

신경과학

이 동영상은 샘플에서 여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석을 보여줍니다. 사이토카인 특이적 항체에 접합된 별개의 미세구체의 혼합물을 사용하여 샘플에 존재하는 사이토카인을 결합합니다. Streptavidin이 태그된 기자는 비오틴화 검출 항체를 사용하여 결합 사이토카인에 고정됩니다. 유세포 분석은 미세구의 고유한 크기와 내부 형광 강도를 기반으로 결합된 사이토카인을 식별하며, 리포터의 형광 강도는 사이토카인의 수를 나타냅니다.

여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법

보툴리눔 신경독소 A형 경쇄(BoNT/A LC)는 운동 뉴런에 들어가 기질 SNAP-25를 절단하고 신경 전달을 방해하여 이완 마비를 일으키는 금속프로테아제입니다. 고처리량 호환 FRET 기반 분석을 활용하여 작은 분자의 대규모 라이브러리를 BoNT/A LC 효소 활성에 미치는 영향을 스크리닝할 수 있습니다.

Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators의 식별 및 특성화를 위한 고처리량 호환 FRET 기반 플랫폼

보툴리눔 신경독소는 A급 생물위협제 중 가장 강력한 독소 중 하나이지만, 노출 후 치료제는 이용할 수 없다. High Content Imaging 접근법은 이 독소의 주요 표적인 생물학적으로 관련된 운동 뉴런을 사용하여 다중 매개변수 스크리닝을 가능하게 하기 때문에 새로운 억제제를 식별하기 위한 강력한 방법론입니다.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

이 프로토콜은 최근 발표된 EU Commission Regulation 2023/915에 따라 식품 내 맥각 알칼로이드의 존재를 결정하기 위해 검증된 액체 크로마토그래피-이온 이동성-고분해능 질량 분석 방법을 제공합니다.

액체 크로마토그래피-트랩 이온 이동성 분광법-비행 시간 질량 분석법을 통한 식품 매트릭스에서 조절되는 맥각 알칼로이드 검출

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마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

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