Name: BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소의 분리 및 정량화 방법을. 면역침전과 형광 단백질 리포터 시스템을 사용하여 식품 및 환경 샘플에서 BoNT 활성을 측정하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 가치있는 토론과 조언을 H. 올리바 레스와 D. Ruge에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NSF SBIR 상 (BioSentinel 주식에 IIP-1127245)와 국방부 계약 (BioSentinel 주식에 W81XWH-07-2-0045)에 의해 부분적으로 지원되었다.

FM 독촉, TM 광장, F. Zeytin의, 및 WC 터커 BioSentinel 주식 BioSentinel의 직원 또는 소유자입니다 현재 생산이 보고서에서 제시 한 시약을 상용화했다.

이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 56, 60와 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수정은 특정한 샘플 조성 및 원하는 애플리케이션에 따라 요구 될 수있다. 행렬은 식품 샘플 (예 : 식품 도전 테스트) 또는 제약 부형제 버퍼 (예 : 본트 기반 약물 제품 테스트)를 포함 할 수 있습니다. 단지 비 식품 (예를 들어, 동물 조직 또는 환경) 액체와 고체 시료는 식품 샘플로 취급되어야한다. 이 프로토콜은 200 μL / 잘 샘플 볼륨을 사용하지만, 적은 50 μL / 잘 배 Bindin의 볼륨에 해당하는 조정으...

보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / 1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 3-5 인코딩 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 7-14 선도. 일반적으로 질병 &quot;보툴리누스 중독,&quot;본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다. 인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 (15, 16)의 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 (17, 18) 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 22 일을 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 (23, 24). 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다. 본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 &quot;오프 라벨&quot;응용 프로그램은 심각한 근육 장애 25-28를위한 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS 29-31. 본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A (34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다. BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 56, 60에있는 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬​​을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 (56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다. BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 56, 60과 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 56, 60 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A 보툴리눔 신경독소 검출 키트</td>, <td>BoNT/B 및 F용</td> <td>BioSentinel</td><td>A1015</td> 검출 키트도 사용할 수 있습니다.</tr><tr><td>Varioskan 플래시 형광 마이크로플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>434nm 여기와 470nm 및 526nm 방출 기능을 갖춘 대부분의 모노크로메이터 또는 필터 기반 장치를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>96웰 마그네틱 비드 분리 플레이트</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>다른 자성판을 사용할 수 있지만 플레이트는 비드를 우물 측면으로 분리하도록 설계되어야 합니다.</td></tr><tr><td>마그네틱 비드 호환 플레이트 워셔</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>선택 사항, 자동 플레이트 워싱에만 필요합니다.&nbsp; 다른 마그네틱 비드 호환 플레이트 와셔도 사용할 수 있지만 사용하기 전에 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td>옵션, 원심분리가 필요한 샘플에만 필요합니다.</td></tr><tr><td>MixMate 플레이트 믹서</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>실온 또는 25°C; C 온도 제어가 가능한 경우</td></tr><tr><td>EDTA가 없는 프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>식품 또는 환경 테스트에만 필요합니다. 프로테아제 억제제는 EDTA가 없어야 합니다.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>메타생물학제는</td><td></td><td>선택 사항, 표준화 및 정량화 목적으로만 필요</td></tr>함 <tr><td>검은색, 바닥이 평평한 96웰 플레이트</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>플레이트는 처리해서는 안 됨</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 밀봉 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

botest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 - 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.

설명 된 프로토콜의 단계를 요약 한 도면이도 2에 도시된다. 분석은 샘플의 종류와 원하는 분석 감도에 따라 완료하는 데 4-26 시간 사이에 필요하지만 만 ~ 2 시간 시간 실습. 어 세이는 96 - 웰 플레이트에서 수행하고, 테스트가 수행되는 분류에 따라서는, 접시 당 표준을 포함​​하여 최대 20 샘플 중으로 시험한다. 그림 3은 본트를 사용하는 대표적인 분석 결과를 보여줍니다 / A holotoxin는 PBS로 아군 및 A / E 기자 2, 4, 24 시간 배양 한 다음 설명 프로토콜 테스트. 정제 BONT / A holotoxin는 ~ 150 kDa의 그것의 정의 분자량이 독소 복합체에 대한보다 광범위하게 정의 된 700 ~ 900 kDa의 비교 때문에이 실험을 위해 선택하고, 순도는 정확한 농도에서 매우 정확한 스파이크를 허용했다. 발광 비율, 470 ㎚에서의 그것과 526 nm에서의 방출의 비는 (434)...

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

본 절차의 전반적인 목적은 의약품, 환경 및 식품 샘플과 같은 복잡한 매질 내 보툴리눔 신경독소의 단백질 분해 활성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 필요한 경우 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플을 처리하여 적절한 pH 및 점도 조건을 설정함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, 항체가 코팅된 자기 비드를 사용하여 샘플로부터 보툴리눔 신경독소를 면역 침전시킵니다.그 후, 방해 화합물을 제거하기 위해 자성 비드(magnetic beads)를 충분히 세척하고 최적화된 반응 버퍼에 재현탁합니다. 마지막으로, 세척된 비드를 단백질 리포터와 함께 배양하고 시간에 따른 리포터의 절단을 분광학적으로 측정합니다. 최종적으로, 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플의 리포터 절단 정도를 비교하여 테스트 샘플 내 보툴리늄 독소의 활성을 마우스 수준 또는 마우스 생물학적 분석법에 근접한 감도로 정량화합니다.마우스, 생물학적 분석, 면역학적 분석 및 기타 형광법과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 동물 사용이 필요하지 않으며, 식품, 환경 및 제약 시료에서 발견되는 매우 복잡한 매트릭스에서도 사용할 수 있음이 입증되었다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 세밀한 시료 처리와 희석 과정이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 실험 절차는 Bio Sentinel의 과학자인 Dr.Mark Dunning이 시연할 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 버퍼를 준비하여 테스트 시료 정량을 위한 표준 곡선을 생성합니다. 50 mL 원추형 튜브에 10 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣고 따로 둡니다. 이 시료는 희석제로 사용됩니다. 두 번째 튜브에 2 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣습니다. 2 g의 식품 시료 표면에 보툴리눔 신경독소(BoNT)를 첨가하여 식품 1 g당 최종 농도가 30,000 MLD₅₀이 되도록 합니다. BoNT가 식품 매질과 상호작용할 수 있도록 희석제와 스파이킹된 시료를 실온 또는 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다.천연 오염 상태를 모방하기 위해, 추가 시료 유형에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 스파이킹된 시료와 스파이킹되지 않은 시료의 식품 1 g당 1 mL의 GPB를 첨가하고, 유발을 사용하여 완전히 혼합될 때까지 균질화하십시오. 10 g 희석 시료의 대략적인 총 부피를 바탕으로, 2 g 스파이킹 시료의 총 부피를 추산하십시오.그 다음, 10g의 희석액 시료와 2g의 스파이크 시료에 각각 전체 부피의 1/10에 해당하는 10 x 중화 완충액을 첨가합니다. 시료를 뒤집어 잘 섞은 후, 4°C에서 6,000 ×g로 10분 동안 원심분리하여 두 시료를 부분적으로 투명하게 만듭니다. 그 후 즉시 상층액을 제거하여 새 튜브로 옮기며, 이때 스파이크 시료를 D1으로, 스파이크하지 않은 시료를 희석액으로 사용합니다. 나머지 표준 곡선 시료들을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 제조합니다.고체 식품 시료를 준비하려면 먼저 50 mL 원뿔형 튜브에 미지의 고체 시료 2 ± 0.01 g을 정밀하게 측정하여 넣습니다. GPB 2 mL를 첨가하고 유발을 사용하여 시료를 균질화합니다. 다음으로, 시료 부피의 1/10에 해당하는 10 x 중화 완충액을 첨가하고 도립 혼합하여 잘 섞어줍니다. 6,000 ×g, 4 °C에서 10분간 원심분리를 하여 시료를 부분적으로 투명하게 만든 후, 상층액 중 최소 750 µL를 즉시 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.이것은 미지 희석액 1입니다. 미지 희석액 2와 3으로 라벨이 붙은 두 개의 튜브에 희석액 675 µL를 추가하십시오. 희석액은 표준 곡선 생성에 사용된 것과 동일한 처리된 물질을 사용합니다.희석액 1의 75 µL를 희석액 2 튜브에 옮겨 섞어 연속 희석을 수행합니다. 그런 다음 희석액 2의 75 µL를 희석액 3 튜브에 옮기고 섞습니다. 시료를 투명하게 하기 위해 최소 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 즉시 제거하여 새 튜브로 옮겨 샘플 플레이트를 준비하고, 각 미지 샘플과 표준 곡선 샘플 D1부터 D8까지는 웰당 3개씩, 샘플 D9은 웰당 6개씩 배치한 후 각 웰에 10 x 결합 버퍼 20 µL를 추가합니다. 각 웰에 해당 샘플 200 µL를 넣고 마이크로플레이트 믹서를 사용하여 10초 동안 혼합합니다. IPA 비즈를 최고 속도로 10초 동안 또는 완전히 재현탁될 때까지 볼텍싱합니다.그런 다음 각 샘플 웰에 비드 20 µL를 피펫으로 넣고 플레이트를 30초 동안 혼합합니다. 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하기 위해, 회전 플레이트 인큐베이터에서 750 RPM, 25 °C 또는 실온으로 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 프라임 프로그램을 실행한 후, 플레이트 세척기의 96웰 자성 비드 분리 플레이트 위에 플레이트를 놓습니다.그 다음 마스터 세척 프로그램을 실행하십시오. 프로그램이 완료되면 세척기에서 플레이트를 꺼냅니다. 각 샘플 웰에 1x 반응 버퍼 50 µL를 넣고 30초 동안 혼합하십시오.봇 테스트 매트릭스 분석을 시작하려면, 각 샘플 웰에 0.5 $\mu\text{M}$ AE 리포터 50 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 사용하지 않는 각 웰에 물 100 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 실링 테이프로 플레이트를 밀봉하고, 빛을 차단한 후 750 RPM, 25 ${}^\circ\text{C}$ 또는 상온에서 배양합니다.각 측정 시간마다 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 상단 테이프를 제거하고 즉시 플레이트를 96-웰 자성 비드 분리 플레이트 위에 올려놓은 후, 비드가 분리되도록 2분 동안 둡니다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣고, 약 434 nm에서 여기시킨 후 약 470 nm와 약 526 nm에서 방출광을 측정합니다.추가 판독 시간이 필요한 경우, 마이크로플레이트 믹서에서 비드를 30초 동안 재현탁시킨 후 플레이트를 다시 밀봉하여 인큐베이터로 되돌립니다. 여기 제시된 것은 PBS에 보툴리눔 독소(botulinum toxin)를 첨가하고 AE 리포터와 함께 2시간, 4시간, 24시간 동안 인큐베이션하여 테스트한 분석 결과입니다. 보툴리눔 독소에 의한 리포터의 절단은 플레이트 리더로 측정된 방출 비율의 감소로 측정되며, 온전한 리포터의 경우 약 2.7에서 완전히 절단된 리포터의 경우 약 0.7까지 감소합니다.곡선이 왼쪽으로 이동한 것에서 볼 수 있듯이, 플레이트 리더(plate reader)마다 특정 값은 다를 수 있으며, 리포터와 함께 배양 시간을 연장하면 리포터 절단이 증가합니다. 세 번 반복 측정된 데이터 포인트는 평균의 표준 편차가 낮게 나타나며, 독소 부하가 감소함에 따라 방출률이 증가하는 예상된 경향을 따릅니다. 분석 결과가 이러한 예상 경향을 따르지 않는 경우, 희석액 제조 또는 데이터 플로팅 과정에서 오류가 있었음을 나타낼 수 있으며, bot A가 포함되지 않은 대조군의 방출률은 배양 중에도 일정하게 유지되어 비특이적 프로테아제 활성이 없음을 나타냅니다.이 그림은 표준 곡선을 사용하여 미지 시료를 검출하거나 정량화하는 일반적인 방법론을 보여주며, 제약 bot a 시료를 정량화합니다. 정제된 bot, a holo toin을 포함하는 PBS로 표준 곡선을 생성하였으며, 0.9% saline으로 재수화한 동결건조 Botox 100 unit 바이알 하나에서 생성된 약물 제품의 희석액과 병행하여 처리하였습니다. 본 분석에서 표준 곡선의 선형 구간은 방출 비율 2.11에서 1.05 사이이며, 그림의 점선 상자로 표시되어 있습니다. 이후 이 선형 범위 내에 있는 세 가지 미지 시료의 농도를 표준 곡선으로부터 보간법으로 산출하였습니다.본 실험에서는 신선한 토마토와 2% 우유를 각각 고체 및 액체 식품 매질로 사용하였으며, 여기에 핵심 중공 단백질, 헤모라이신 및 신경독소 관련 단백질로 구성된 bot 복합체를 첨가하였습니다. 이러한 조합은 여기에 제시된 바와 같이 자연적인 클로스트리디움 오염 과정에서 생성되는 독소와 유사하기 때문에 선택되었습니다. 두 매질 모두에서 bot A의 회수가 관찰되었습니다.또한, 리포터와의 배양 시간을 늘리면 분석 민감도는 증가하지만, 독소가 없는 대조군에서는 방출 비율이 감소하지 않았습니다. 이는 관찰된 절단이 식품 내의 비특이적 프로테아제 전이에 의한 것이 아니라 bot A에 의해 발생했음을 나타냅니다. 표시된 각 시점별 두 식품에 대한 bot A-L-O-D-L-O-Q 및 EC 50 값은 이 표에 요약되어 있습니다. LOD와 LOQ는 각각 방출 비율이 배경값보다 3표준편차 및 10표준편차 낮은 가장 낮은 농도의 시료로 정의됩니다.매트릭스 효과가 독소의 비드 결합 및 세척 과정 중 비드 회수율에 영향을 줄 수 있으므로, LOD 및 LOQ에서 매트릭스 간의 변동성이 예상됩니다. 데이터상으로는 토마토보다 2% 우유에서 더 많은 독소가 회수된 것으로 보이지만, 이러한 차이의 상당 부분은 GPB 내에서 토마토 샘플을 균질화하기 위해 필요한 추가 희석에서 비롯됩니다. 토마토는 고체 식품 매트릭스일 뿐만 아니라, pH 및 이온 강도 조절이 분석 성공의 핵심이 되는 주목할 만한 샘플 유형입니다.이 그림은 10배 중화 버퍼(neutralization buffer)를 포함하거나 포함하지 않은 토마토를 테스트했을 때의 분석 응답을 보여줍니다. 버퍼를 추가하지 않으면 샘플에서 bot A의 회수율이 낮아지며, 이는 테스트한 모든 bot A 농도에서 방출 비율이 일정하게 나타나는 것으로 입증됩니다. 반면, 10배 중화 버퍼를 추가하면 민감한 독소 검출이 가능합니다. 비특이적 프로테아제는 식품 샘플에 내생적으로 존재하거나, Clostridium 배양액 또는 상층액과 같이 정제되지 않은 bot 제제를 사용할 때 도입될 수 있으며, AE 리포터를 절단하여 위양성 결과를 초래할 수 있습니다. 이 예시는 bot A에 의해 더 이상 절단되지 않는 변형된 리포터를 사용하여 Clostridium bot a 배양 상층액에서 발견되는 비특이적 프로테아제 활성을 보여줍니다. 높은 수준의 리포터 절단은 배양액을 나타냅니다.상층액에는 상당한 프로테아제 활성이 포함되어 있으며, 이는 프로테아제 억제제를 첨가함으로써 효과적으로 무력화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 샘플 유형과 독소 부하량에 따라 총 분석 시간을 4시간에서 26시간 사이로 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 기반 단백질 리포터 시스템 내 면역침전을 이용하여 복잡한 샘플로부터 보툴리눔 신경독소를 분리하고 정량하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.보툴리눔 신경독소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 실험 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험복, 화학 및 생물학적 안전 작업대와 같은 예방 조치를 반드시 준수해야 함을 잊지 마십시오.

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

이 동영상은 샘플에서 여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석을 보여줍니다. 사이토카인 특이적 항체에 접합된 별개의 미세구체의 혼합물을 사용하여 샘플에 존재하는 사이토카인을 결합합니다. Streptavidin이 태그된 기자는 비오틴화 검출 항체를 사용하여 결합 사이토카인에 고정됩니다. 유세포 분석은 미세구의 고유한 크기와 내부 형광 강도를 기반으로 결합된 사이토카인을 식별하며, 리포터의 형광 강도는 사이토카인의 수를 나타냅니다.

여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법

보툴리눔 신경독소 A형 경쇄(BoNT/A LC)는 운동 뉴런에 들어가 기질 SNAP-25를 절단하고 신경 전달을 방해하여 이완 마비를 일으키는 금속프로테아제입니다. 고처리량 호환 FRET 기반 분석을 활용하여 작은 분자의 대규모 라이브러리를 BoNT/A LC 효소 활성에 미치는 영향을 스크리닝할 수 있습니다.

Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators의 식별 및 특성화를 위한 고처리량 호환 FRET 기반 플랫폼

보툴리눔 신경독소는 A급 생물위협제 중 가장 강력한 독소 중 하나이지만, 노출 후 치료제는 이용할 수 없다. High Content Imaging 접근법은 이 독소의 주요 표적인 생물학적으로 관련된 운동 뉴런을 사용하여 다중 매개변수 스크리닝을 가능하게 하기 때문에 새로운 억제제를 식별하기 위한 강력한 방법론입니다.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 프로토콜은 최근 발표된 EU Commission Regulation 2023/915에 따라 식품 내 맥각 알칼로이드의 존재를 결정하기 위해 검증된 액체 크로마토그래피-이온 이동성-고분해능 질량 분석 방법을 제공합니다.

액체 크로마토그래피-트랩 이온 이동성 분광법-비행 시간 질량 분석법을 통한 식품 매트릭스에서 조절되는 맥각 알칼로이드 검출

이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에...

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

배우세요 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소의 분리 및 정량화 방법을. 면역침전과 형광 단백질 리포터 시스템을 사용하여 식품 및 환경 샘플에서 BoNT 활성을 측정하는 기술입니다.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

더 많은 동영상 탐색