BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

본 절차의 전반적인 목적은 의약품, 환경 및 식품 샘플과 같은 복잡한 매질 내 보툴리눔 신경독소의 단백질 분해 활성을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 필요한 경우 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플을 처리하여 적절한 pH 및 점도 조건을 설정함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, 항체가 코팅된 자기 비드를 사용하여 샘플로부터 보툴리눔 신경독소를 면역 침전시킵니다.

그 후, 방해 화합물을 제거하기 위해 자성 비드(magnetic beads)를 충분히 세척하고 최적화된 반응 버퍼에 재현탁합니다. 마지막으로, 세척된 비드를 단백질 리포터와 함께 배양하고 시간에 따른 리포터의 절단을 분광학적으로 측정합니다. 최종적으로, 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플의 리포터 절단 정도를 비교하여 테스트 샘플 내 보툴리늄 독소의 활성을 마우스 수준 또는 마우스 생물학적 분석법에 근접한 감도로 정량화합니다.

마우스, 생물학적 분석, 면역학적 분석 및 기타 형광법과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 동물 사용이 필요하지 않으며, 식품, 환경 및 제약 시료에서 발견되는 매우 복잡한 매트릭스에서도 사용할 수 있음이 입증되었다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사용자는 세밀한 시료 처리와 희석 과정이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 실험 절차는 Bio Sentinel의 과학자인 Dr.Mark Dunning이 시연할 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 버퍼를 준비하여 테스트 시료 정량을 위한 표준 곡선을 생성합니다. 50 mL 원추형 튜브에 10 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣고 따로 둡니다. 이 시료는 희석제로 사용됩니다. 두 번째 튜브에 2 ± 0.01 g의 고체 식품 시료를 정밀하게 측정하여 넣습니다. 2 g의 식품 시료 표면에 보툴리눔 신경독소(BoNT)를 첨가하여 식품 1 g당 최종 농도가 30,000 MLD₅₀이 되도록 합니다. BoNT가 식품 매질과 상호작용할 수 있도록 희석제와 스파이킹된 시료를 실온 또는 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

천연 오염 상태를 모방하기 위해, 추가 시료 유형에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 스파이킹된 시료와 스파이킹되지 않은 시료의 식품 1 g당 1 mL의 GPB를 첨가하고, 유발을 사용하여 완전히 혼합될 때까지 균질화하십시오. 10 g 희석 시료의 대략적인 총 부피를 바탕으로, 2 g 스파이킹 시료의 총 부피를 추산하십시오.

그 다음, 10g의 희석액 시료와 2g의 스파이크 시료에 각각 전체 부피의 1/10에 해당하는 10 x 중화 완충액을 첨가합니다. 시료를 뒤집어 잘 섞은 후, 4°C에서 6,000 ×g로 10분 동안 원심분리하여 두 시료를 부분적으로 투명하게 만듭니다. 그 후 즉시 상층액을 제거하여 새 튜브로 옮기며, 이때 스파이크 시료를 D1으로, 스파이크하지 않은 시료를 희석액으로 사용합니다. 나머지 표준 곡선 시료들을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 제조합니다.

고체 식품 시료를 준비하려면 먼저 50 mL 원뿔형 튜브에 미지의 고체 시료 2 ± 0.01 g을 정밀하게 측정하여 넣습니다. GPB 2 mL를 첨가하고 유발을 사용하여 시료를 균질화합니다. 다음으로, 시료 부피의 1/10에 해당하는 10 x 중화 완충액을 첨가하고 도립 혼합하여 잘 섞어줍니다. 6,000 ×g, 4 °C에서 10분간 원심분리를 하여 시료를 부분적으로 투명하게 만든 후, 상층액 중 최소 750 µL를 즉시 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이것은 미지 희석액 1입니다. 미지 희석액 2와 3으로 라벨이 붙은 두 개의 튜브에 희석액 675 µL를 추가하십시오. 희석액은 표준 곡선 생성에 사용된 것과 동일한 처리된 물질을 사용합니다.

희석액 1의 75 µL를 희석액 2 튜브에 옮겨 섞어 연속 희석을 수행합니다. 그런 다음 희석액 2의 75 µL를 희석액 3 튜브에 옮기고 섞습니다. 시료를 투명하게 하기 위해 최소 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 즉시 제거하여 새 튜브로 옮겨 샘플 플레이트를 준비하고, 각 미지 샘플과 표준 곡선 샘플 D1부터 D8까지는 웰당 3개씩, 샘플 D9은 웰당 6개씩 배치한 후 각 웰에 10 x 결합 버퍼 20 µL를 추가합니다. 각 웰에 해당 샘플 200 µL를 넣고 마이크로플레이트 믹서를 사용하여 10초 동안 혼합합니다. IPA 비즈를 최고 속도로 10초 동안 또는 완전히 재현탁될 때까지 볼텍싱합니다.

그런 다음 각 샘플 웰에 비드 20 µL를 피펫으로 넣고 플레이트를 30초 동안 혼합합니다. 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하기 위해, 회전 플레이트 인큐베이터에서 750 RPM, 25 °C 또는 실온으로 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 프라임 프로그램을 실행한 후, 플레이트 세척기의 96웰 자성 비드 분리 플레이트 위에 플레이트를 놓습니다.

그 다음 마스터 세척 프로그램을 실행하십시오. 프로그램이 완료되면 세척기에서 플레이트를 꺼냅니다. 각 샘플 웰에 1x 반응 버퍼 50 µL를 넣고 30초 동안 혼합하십시오.

봇 테스트 매트릭스 분석을 시작하려면, 각 샘플 웰에 0.5 $\mu\text{M}$ AE 리포터 50 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 사용하지 않는 각 웰에 물 100 $\mu\text{L}$를 첨가합니다. 실링 테이프로 플레이트를 밀봉하고, 빛을 차단한 후 750 RPM, 25 ${}^\circ\text{C}$ 또는 상온에서 배양합니다.

각 측정 시간마다 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 상단 테이프를 제거하고 즉시 플레이트를 96-웰 자성 비드 분리 플레이트 위에 올려놓은 후, 비드가 분리되도록 2분 동안 둡니다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣고, 약 434 nm에서 여기시킨 후 약 470 nm와 약 526 nm에서 방출광을 측정합니다.

추가 판독 시간이 필요한 경우, 마이크로플레이트 믹서에서 비드를 30초 동안 재현탁시킨 후 플레이트를 다시 밀봉하여 인큐베이터로 되돌립니다. 여기 제시된 것은 PBS에 보툴리눔 독소(botulinum toxin)를 첨가하고 AE 리포터와 함께 2시간, 4시간, 24시간 동안 인큐베이션하여 테스트한 분석 결과입니다. 보툴리눔 독소에 의한 리포터의 절단은 플레이트 리더로 측정된 방출 비율의 감소로 측정되며, 온전한 리포터의 경우 약 2.7에서 완전히 절단된 리포터의 경우 약 0.7까지 감소합니다.

곡선이 왼쪽으로 이동한 것에서 볼 수 있듯이, 플레이트 리더(plate reader)마다 특정 값은 다를 수 있으며, 리포터와 함께 배양 시간을 연장하면 리포터 절단이 증가합니다. 세 번 반복 측정된 데이터 포인트는 평균의 표준 편차가 낮게 나타나며, 독소 부하가 감소함에 따라 방출률이 증가하는 예상된 경향을 따릅니다. 분석 결과가 이러한 예상 경향을 따르지 않는 경우, 희석액 제조 또는 데이터 플로팅 과정에서 오류가 있었음을 나타낼 수 있으며, bot A가 포함되지 않은 대조군의 방출률은 배양 중에도 일정하게 유지되어 비특이적 프로테아제 활성이 없음을 나타냅니다.

이 그림은 표준 곡선을 사용하여 미지 시료를 검출하거나 정량화하는 일반적인 방법론을 보여주며, 제약 bot a 시료를 정량화합니다. 정제된 bot, a holo toin을 포함하는 PBS로 표준 곡선을 생성하였으며, 0.9% saline으로 재수화한 동결건조 Botox 100 unit 바이알 하나에서 생성된 약물 제품의 희석액과 병행하여 처리하였습니다. 본 분석에서 표준 곡선의 선형 구간은 방출 비율 2.11에서 1.05 사이이며, 그림의 점선 상자로 표시되어 있습니다. 이후 이 선형 범위 내에 있는 세 가지 미지 시료의 농도를 표준 곡선으로부터 보간법으로 산출하였습니다.

본 실험에서는 신선한 토마토와 2% 우유를 각각 고체 및 액체 식품 매질로 사용하였으며, 여기에 핵심 중공 단백질, 헤모라이신 및 신경독소 관련 단백질로 구성된 bot 복합체를 첨가하였습니다. 이러한 조합은 여기에 제시된 바와 같이 자연적인 클로스트리디움 오염 과정에서 생성되는 독소와 유사하기 때문에 선택되었습니다. 두 매질 모두에서 bot A의 회수가 관찰되었습니다.

또한, 리포터와의 배양 시간을 늘리면 분석 민감도는 증가하지만, 독소가 없는 대조군에서는 방출 비율이 감소하지 않았습니다. 이는 관찰된 절단이 식품 내의 비특이적 프로테아제 전이에 의한 것이 아니라 bot A에 의해 발생했음을 나타냅니다. 표시된 각 시점별 두 식품에 대한 bot A-L-O-D-L-O-Q 및 EC 50 값은 이 표에 요약되어 있습니다. LOD와 LOQ는 각각 방출 비율이 배경값보다 3표준편차 및 10표준편차 낮은 가장 낮은 농도의 시료로 정의됩니다.

매트릭스 효과가 독소의 비드 결합 및 세척 과정 중 비드 회수율에 영향을 줄 수 있으므로, LOD 및 LOQ에서 매트릭스 간의 변동성이 예상됩니다. 데이터상으로는 토마토보다 2% 우유에서 더 많은 독소가 회수된 것으로 보이지만, 이러한 차이의 상당 부분은 GPB 내에서 토마토 샘플을 균질화하기 위해 필요한 추가 희석에서 비롯됩니다. 토마토는 고체 식품 매트릭스일 뿐만 아니라, pH 및 이온 강도 조절이 분석 성공의 핵심이 되는 주목할 만한 샘플 유형입니다.

이 그림은 10배 중화 버퍼(neutralization buffer)를 포함하거나 포함하지 않은 토마토를 테스트했을 때의 분석 응답을 보여줍니다. 버퍼를 추가하지 않으면 샘플에서 bot A의 회수율이 낮아지며, 이는 테스트한 모든 bot A 농도에서 방출 비율이 일정하게 나타나는 것으로 입증됩니다. 반면, 10배 중화 버퍼를 추가하면 민감한 독소 검출이 가능합니다. 비특이적 프로테아제는 식품 샘플에 내생적으로 존재하거나, Clostridium 배양액 또는 상층액과 같이 정제되지 않은 bot 제제를 사용할 때 도입될 수 있으며, AE 리포터를 절단하여 위양성 결과를 초래할 수 있습니다. 이 예시는 bot A에 의해 더 이상 절단되지 않는 변형된 리포터를 사용하여 Clostridium bot a 배양 상층액에서 발견되는 비특이적 프로테아제 활성을 보여줍니다. 높은 수준의 리포터 절단은 배양액을 나타냅니다.

상층액에는 상당한 프로테아제 활성이 포함되어 있으며, 이는 프로테아제 억제제를 첨가함으로써 효과적으로 무력화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 샘플 유형과 독소 부하량에 따라 총 분석 시간을 4시간에서 26시간 사이로 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 기반 단백질 리포터 시스템 내 면역침전을 이용하여 복잡한 샘플로부터 보툴리눔 신경독소를 분리하고 정량하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

보툴리눔 신경독소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 실험 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험복, 화학 및 생물학적 안전 작업대와 같은 예방 조치를 반드시 준수해야 함을 잊지 마십시오.