BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 제약, 환경 및 식품 샘플과 같은 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경독의 단백질 분해 활성을 정량화하는 것입니다. 이는 적절한 pH 및 점도 조건을 설정하기 위해 필요한 경우 첫 번째 공정 테스트 및 표준 곡선 샘플을 통해 수행됩니다. 다음으로, 보툴리눔 신경독소는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 샘플에서

그런 다음 마그네틱 비드를 철저히 세척하여 간섭 화합물을 제거하고 최적화된 반응 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로, 세척된 비드는 단백질 리포터와 함께 배양되고 시간이 지남에 따라 리포터의 분열을 분광법으로 측정합니다. 궁극적으로, 테스트 샘플과 표준 곡선 샘플의 리포터 절단을 비교하여 마우스에서 마우스에 가까운 생물학적 검정 민감도를 사용하여 테스트 샘플에서 보툴리눔 독소의 활성을 정량화하는 데 사용됩니다.

마우스, 생물학적 분석, 면역학 및 기타 형광 방법과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 분석이 동물을 사용할 필요가 없으며 식품, 환경 및 제약 샘플에서 발견되는 매우 복잡한 매트릭스에 사용하는 것으로 입증되었다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 신중한 검체 처리 및 희석이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Bio Sentinel의 과학자인 Mark Dunning 박사입니다.

테스트 샘플을 정량화하기 위한 표준 곡선을 생성하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼를 준비하고, 10g을 더하거나 뺀 0.01g의 고체 식품 샘플의 무게를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 이 샘플을 따로 보관하고 두 번째 튜브의 희석제로 사용하여 2개의 고형 식품 샘플을 2개 플러스 또는 마이너스 0.01g의 무게를 측정합니다. 보툴리눔 신경독을 추가하거나 2 그램 식품 샘플의 표면에 구입하여 식품 그램 당 30, 000 MLD 50의 최종 농도를 얻습니다. 희석제 및 스파이크가 첨가된 샘플을 실온 또는 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양하여 봇이 식품 매트릭스와 상호 작용할 시간을 제공합니다.

자연 오염을 모방하여 추가 샘플 유형에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 스파이크 및 스파이크가 없는 샘플에 식품 1g당 GPB 1ml를 추가하고 유봉을 사용하여 완전히 혼합될 때까지 균질화합니다. 2g bot의 총 부피를 10g 희석제 샘플의 대략적인 총 부피에서 스파이크 샘플로 외삽합니다.

그런 다음 10g 희석제 샘플에 10 x 중화 버퍼의 10번째 부피를 추가하고 총 부피를 기준으로 2g의 스파이크 샘플을 구입합니다. 반전에 의하여 잘 섞인 표본은, 부분적으로 6의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 분리기해서 두 표본 다 명백하게 한다. 그런 다음 즉시 상층액을 제거하고 봇을 사용하여 스파이크 시료를 D 샘플로, 스파이크가 없는 시료를 희석액으로 사용하여 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 나머지 표준 곡선 샘플을 생성합니다.

고체 식품 샘플을 준비하려면 먼저 2g을 빼거나 빼서 0.01g의 알려지지 않은 고체 샘플을 50ml 원추형 튜브에 넣는 것으로 시작합니다. GPB 2ml를 넣고 유봉을 사용하여 샘플을 균질화합니다. 다음으로, 1개의 10분의 1을 표본에 10의 x 중립화 완충액의 양 추가하고 6의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 원심 분리에 의하여 표본을 부분적으로 명백하게 한 후에 반전에 의하여 잘 섞으십시오 즉각 마이크로 분리기 관에 상등액의 적어도 750 마이크로리터를 옮깁니다.

이것은 알 수 없는 희석 하나입니다. 675마이크로리터의 희석제를 알 수 없는 희석 2 및 3이라고 표시된 두 개의 튜브에 추가합니다. 희석제는 표준 곡선 생성에 사용되는 것과 동일한 가공 재료가 될 것입니다.

희석 1을 사용하여 75마이크로리터의 희석 1을 희석 2 튜브에 옮기고 혼합하여 연속 희석을 만듭니다. 그런 다음 75 마이크로 리터의 희석 2를 희석 3 튜브에 옮기고 혼합합니다. 표본을 명백하게 하기 위하여는, 5 분 동안 그(것)들을 적어도 14, 000 시간 원심분리하십시오. 중력.

즉시 상층액을 제거하고 새 튜브로 옮겨 샘플용 플레이트를 설정하고, 각 미지 샘플에 20마이크로리터의 10 x 결합 완충액을 추가하고 표준 곡선 샘플 D 1에서 D 8에는 3개의 웰이 필요하고 샘플 D 9에는 6개의 웰이 필요합니다. 각 샘플 200마이크로리터를 각 웰에 추가하고 마이크로플레이트 믹서를 사용하여 10초 동안 플레이트를 혼합합니다. IPA 비드를 최고 속도로 10초 동안 또는 완전히 재현될 때까지 소용돌

그런 다음 20마이크로리터의 비드를 각 샘플에 잘 피펫팅하고 플레이트를 30초 동안 혼합합니다. 750RPM과 섭씨 25도 또는 실온에서 2시간 동안 회전하는 플레이트 인큐베이터에서 플레이트를 배양한 후 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척합니다. 프라임 프로그램을 실행한 후 플레이트 와셔의 96웰 마그네틱 비드 분리 플레이트에 플레이트를 놓습니다.

그런 다음 마스터 세척 프로그램을 실행합니다. 프로그램이 완료되면 와셔에서 플레이트를 제거합니다. 각 샘플 웰에 50마이크로리터의 1x 반응 완충액을 추가하고 30초 동안 혼합합니다.

봇 테스트 매트릭스 분석을 시작하려면 50마이크로리터의 0.5마이크로몰 AE 리포터를 추가합니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 각 샘플 웰에 사용하지 않은 각 웰에 100마이크로리터의 물을 추가합니다. 천장 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 빛으로부터 보호한 다음 750RPM 및 섭씨 25도 또는 실온에서 배양합니다.

읽을 때마다 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 천장 테이프를 제거하고 즉시 플레이트를 96웰 마그네틱 비드 분리 플레이트에 놓고 비드가 2분 동안 분리되도록 합니다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더에 놓고 약 434나노미터의 여기 상태에서 약 470 및 약 526 나노미터에서 방출을 측정합니다.

추가 판독 시간이 필요한 경우, 마이크로플레이트 믹서에서 비드를 30초 동안 매달아 놓은 후 플레이트를 다시 밀봉하고 인큐베이터로 다시 넣습니다. 다음은 봇을 사용하여 홀로그램을 PBS에 스파이크하고 AE 리포터와 함께 2시간, 4시간 및 24시간 배양 후 테스트한 분석 결과입니다. 봇에 의한 리포터의 분열은 플레이트 리더기로 측정한 방출 비율의 감소로 측정되며, 온전한 리포터의 경우 약 2.7, 완전히 절단된 리포터의 경우 약 0.7로

곡선의 좌측 이동에서 볼 수 있듯이 특정 값은 플레이트 리더마다 다르며, 리포터와의 배양 시간이 길어지면 리포터 분열이 증가합니다. 삼중으로 테스트된 데이터 포인트는 평균의 낮은 표준 편차를 나타내며 독소 부하가 감소함에 따라 배출 비율이 증가할 것으로 예상되는 추세를 따릅니다. 이러한 예상 추세를 따르지 않는 분석의 실패는 희석 생성 중 오류를 나타낼 수 있으며, 봇 A를 포함하지 않는 대조군의 방출 비율도 배양 중에 일정하게 유지되는 데이터를 표시하여 비특이적 단백질 분해 효소 활성의 부족을 나타낼 수 있습니다.

이 그림은 표준 곡선에 대해 알려지지 않은 시료를 검출하거나 정량화하는 데 사용되는 일반적인 방법론을 보여주고 제약 봇 샘플을 정량화합니다. 표준 곡선은 정제된 봇, 홀로토인을 사용하여 PBS에서 생성되었으며 0.9% 식염수로 재수화된 동결건조된 보톡스의 단일 100 단위 바이알에서 생성된 의약품의 희석액과 병렬로 처리되었습니다. 이 분석에서 표준 곡선의 선형 부분은 2.11과 1.05의 배출 비율 사이에 있으며 그림에서 점선 상자로 표시됩니다. 이 선형 범위에 속하는 세 가지 미지수의 농도는 그런 다음 표준 곡선에서 보간되었습니다.

이 실험에서는 신선한 토마토와 2%의 우유를 고체 및 액체 식품 매트릭스로 사용하고 핵심 홀로, 토인 및 신경독 관련 단백질로 구성된 복합체를 봇으로 스파이크했습니다. 이 조합은 여기에서 볼 수 있듯이 자연적인 클로스트리듐 오염 중에 생성된 독소와 유사하기 때문에 선택되었습니다. 봇 A의 복구는 두 매트릭스 모두에서 관찰됩니다.

또한, 리포터와의 배양 시간이 증가하면 분석 감도가 증가하지만 무독성 대조군에 대한 배출 비율이 감소하지는 않으며, 이는 봇 A에서 관찰된 절단 결과를 나타내며 분석에서 식품에서 비특이적 단백질 분해 효소가 전달되지 않음을 나타냅니다. 표시된 각 시점에서 두 식품에 대한 봇 A-L-O-D-L-O-Q 및 EC 50이 이 표에 요약되어 있습니다. LOD 및 LOQ는 방출 비율이 각각 배경보다 3 및 10 표준 편차 미만인 가장 낮은 농도 샘플로 정의됩니다.

LOD 및 LOQ의 일부 매트릭스 간 변동성은 매트릭스 효과가 독소와 비드의 결합과 세척 중 비드의 회수에 영향을 미칠 수 있으므로 예상됩니다. 데이터에서는 토마토보다 우유 2%에서 독소 회수율이 더 높은 것으로 보이지만, 이러한 차이의 대부분은 GPB에서 토마토 샘플을 균질화하는 데 필요한 추가 희석에서 비롯됩니다. 토마토는 고체 식품 매트릭스일 뿐만 아니라 pH 및 이온 강도 조정이 분석 성공에 중요한 주목할 만한 샘플 유형입니다.

이 그림은 10 x 중화 완충액을 포함하거나 포함하지 않고 토마토를 테스트할 때의 분석 반응을 보여줍니다. 완충액을 추가하지 않으면 샘플에서 bot A의 회수율이 저하되고 테스트된 모든 bot A 농도에서 10 x 중화 완충액이 첨가되어 일정한 방출 비율로 입증되지만, 민감하게 독소가 검출되고, 비특이적 프로테아제는 식품 샘플에 내인성이거나 클로스트리듐 배양과 같은 정제되지 않은 봇 제제를 사용할 때 도입될 수 있습니다. 상층액, AE 리포터를 절단하여 위양성 결과를 초래할 수 있습니다. 이 예는 봇 A에 의해 더 이상 절단되지 않는 변형된 리포터를 사용하는 배양 상층액인 클로스트리듐 봇에서 발견되는 비특이적 프로테아제 활성을 보여줍니다.

상등액에는 상당한 프로테아제 활성이 포함되어 있으며, 이는 프로테아제 억제제의 첨가에 의해 효과적으로 무효화됩니다. 이 기법을 마스터하면 시료 유형과 독소 부하에 따라 총 4시간에서 26시간 이내에 분석할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 기반 단백질 리포터 시스템에서 면역침전을 사용하여 복잡한 샘플에서 보툴리눔 신경독을 분리하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

보툴리눔 신경독소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 코드, 화학 및 생물학적 안전 캐비닛과 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.