Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators의 식별 및 특성화를 위한 고처리량 호환 FRET 기반 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 경쇄 억제인 보툴리눔 신경독에 대해 소분자를 스크리닝하는 것입니다. 이것은 먼저 높은 정확도와 정밀도를 가진 화합물 희석 시리즈를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 화합물 희석액을 검은색 96웰 플레이트로 옮기는 것입니다.

다음으로 희석된 경쇄 효소를 플레이트에 첨가하고 효소를 실온에서 5분 동안 화합물과 함께 배양합니다. 마지막 단계는 반응을 시작하기 위해 경쇄 프렛 기질을 추가하는 것이며, 이는 형광 플레이트 리더로 모니터링됩니다. 궁극적으로, 비형광 펩타이드 기질을 활용하는 2차 스크리닝을 사용하여 화합물 활성을 확인하고 억제제 해리 상수 또는 ki와 같은 보다 엄격한 운동 상수를 측정해야 합니다.

HPLC 기반 또는 세포 기반 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 분석의 주요 장점은 수행이 간단하고 자동화가 쉬우며 여러 화합물의 상대적 효능을 비교하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 개인은 이 방법을 처음 사용할 때 복합 희석 시리즈를 준비하고 모든 구성 요소가 추가되면 플레이트를 적절하게 혼합할 때 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼와 시약을 준비하여 이 절차를 시작합니다.

플레이트 리더를 구성하여 10초 동안 중간 속도로 플레이트를 흔든 다음 실온에서 1시간 30분 동안 키네틱 모드에서 5분마다 490나노미터의 여기 파장과 523나노미터의 방출 파장에서 형광을 모니터링하도록 구성합니다. 화합물 농도 범위를 결정한 후 적절한 화합물 이름과 농도로 Eloqua, 100% 디메틸 설프 옥사이드 또는 DMSO를 모든 튜브에 부착하여 복합 시리얼 희석을 준비합니다. 다음으로, 표준 1 - 3 희석 시리즈에 대한 화합물의 연속 희석을 준비합니다.

희석 시리즈의 첫 번째 튜브에 있는 4마이크로리터의 DMSO에 2마이크로리터의 희석되지 않은 화합물을 추가하고 새 피펫 팁과 잘 혼합합니다. 첫 번째 희석액 2마이크로리터를 제거하고 두 번째 튜브 혼합물에 DMSO 4마이크로리터를 추가합니다. 나머지 희석액에 대해 반복하십시오.

화합물 농도가 정확한지 확인하기 위해 화합물 희석액을 잘 혼합하십시오. 복합 튜브를 덮고 따로 보관하십시오.실온에서 바닥이 평평하고 불투명한 검은색 96웰 플레이트를 얻습니다. 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있는 권장 플레이트 설정을 사용합니다.

웰 1에서 9까지 각 해당 웰의 바닥에 각각 화합물 희석액 1마이크로리터를 직접 수동으로 분배하고, 웰에 테스트할 화합물의 농도가 가장 높은 1마이크로리터를 분배합니다.11. 화합물 고유 형광 제어 역할을 합니다. 이 제어는 화합물 자체가 형광성인지 및/또는 기질 가수분해에 영향을 미치는지 확인하기 위한 것입니다.

수동으로 알려진 강력한 억제제 1 마이크로 리터를 웰에, 12 마이크로 리터는 양성 대조군으로, 1 마이크로 리터는 100 % DMSO를 웰에 분배합니다. 10은 자동 피펫 투주를 통한 음성 대조군으로 분배합니다. 웰 측면에 79 마이크로 리터의 분석 버퍼, 웰 측면에 1 - 10 및 12 및 89 마이크로 리터, 11.

우물의 교차 오염을 방지하기 위해 화합물이 있는 우물 바닥에 팁을 만지지 않도록 하십시오. Vortex, 희석된 경쇄 효소를 사용하고 자동 피펫터를 사용하여 웰 11을 제외한 각 웰의 측면에 10마이크로리터의 효소를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 추가된 효소의 총 부피가 웰 바닥으로 이동하도록 하고 플레이트를 부드럽게 혼합하고 덮고 실온에서 5분 동안 배양합니다.

이 배양은 화합물이 경쇄에 결합할 수 있는 사전 평형 단계를 제공합니다. 기질을 추가하기 전에 보툴리눔 신경독을 경쇄 기질로 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 자동 피펫을 사용하여 각 측면에 10마이크로리터의 기질을 추가합니다.

글쎄, 효소가 이전에 첨가된 곳의 반대쪽 웰 측면에 기질을 추가해야 합니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 시약을 즉시 혼합합니다. 형광 마이크로타이터 플레이트 리더에 플레이트를 놓고 이전에 구성한 프로그램을 시작합니다.

프로그램이 완료된 후, 상대 형광 단위 대 시간을 그래프로 표시하고 반응의 선형 기간 동안 라인의 기울기를 계산하여 효소 속도를 계산합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고처리량 스크리닝을 위한 자동 작업을 준비하고, 고처리량 스크리닝 프로토콜의 일부를 시연하는 것은 제 실험실에서 박사 후 연구원이 될 것입니다. 그는 실험실 자동화 장비를 사용하여 고처리량 스크리닝을 위해 화합물이 플레이트로 전달되는 방법을 보여줄 것입니다.희석된 보툴리눔 신경독소, 경쇄 효소를 분석 플레이트에 분배한 후.

Liquid Handler 플랫폼에서 복합 플레이트, 분석 플레이트 및 세척 용액이 있는 용기를 위한 영역을 할당합니다. 리튬-핸들러를 프로그래밍하여 컴파운드 플레이트와 분석 플레이트를 지정된 위치에 배치하고 스탬핑하기 전에 플레이트 뚜껑을 제거합니다. 스탬핑 프로그램 소프트웨어를 보정하고 스탬핑 핀이 물에 잠겨 있지만 분석 플레이트의 바닥이 긁히지 않는지 확인합니다.

50나노리터의 화합물을 8마이크로리터의 보툴리눔 신경독이 들어 있는 분석 플레이트에 직접 스탬프를 찍습니다. 라이트 체인. 각 플레이트 뒤에 있는 핀을 DMSO에 담근 다음 압지에서 말리고 이소프로판올과 메탄올로 이 과정을 반복하여 핀을 청소합니다.

마지막으로, 화합물이 효소로 분석 플레이트에 찍힌 후 팬 위의 핀을 건조시킵니다. 별도로 스톡 복합 플레이트를 쌓고 분석 플레이트는 증발을 방지하기 위해 스택의 상단 분석 플레이트를 덮고 따로 보관합니다. 실온에서 최소 5분 동안 화합물로 경쇄를 배양해야 합니다.

많은 수의 플레이트를 스탬핑할 때 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 기질을 분석 플레이트에 분배하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광을 측정합니다. 경쇄 분석에서 프렛 기반 보툴리눔 신경독소를 저수속 또는 고수질 방식으로 수행하든, 경쇄인 보툴리눔 신경독소가 기질과 함께 배양될 때 시간이 지남에 따라 형광이 증가하는 것을 관찰해야 합니다.

화합물의 연속 희석을 테스트하면 다양한 기울기를 가진 일련의 라인을 얻을 수 있는 경우가 많습니다. 여기. hydroxy ate 기반 화합물의 최종 농도는 마이크로 몰 단위로 나열됩니다. 글쎄요, 여기에 설명된 플레이트 레이아웃의 10은 차량만 추가되는 네거티브 컨트롤 역할을 합니다.

이 반응의 속도는 100% 효소 활성으로 정의되며 화합물이 있는 상태에서의 속도는 이 속도로 정규화되어 상대 속도 또는 퍼센트 억제를 얻을 수 있습니다. 화합물의 연속 희석액으로 분석을 수행할 때, 억제제 농도 대비 반응 속도의 그래프를 사용하여 절반 최대 억제 농도 또는 IC 50을 결정할 수 있습니다. 희석 범위는 플롯이 최적의 곡선 피팅을 위해 시그모이드 모양으로 나타나도록 선택해야 합니다.

IC 50 값은 분석에 존재하는 효소의 농도에 따라 달라지기 때문에 겉보기 KI 값으로 가장 잘 설명되는 효능의 상대적 측정입니다. 그런 다음 이 값을 사용하여 테스트한 경우 여러 화합물의 효능을 비교하고 순위를 매길 수 있습니다. 이와 동시에 각 구성 요소를 추가한 후 플레이트를 적절하게 혼합하는 것은 시간이 지남에 따라 형광이 매끄럽게 선형 증가하도록 하는 데 중요하며, 이는 초기 속도를 정확하게 결정하는 데 필요합니다.

이 플롯은 혼합이 충분하지 않고 제품 형성 속도가 시간에 따라 선형이 아닌 대표적인 실험을 보여줍니다. 교란 데이터 분석: 이 기술을 마스터하면 최대 8개의 화합물에 대해 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 실험이 끝나면 비형광 펩타이드 기질로 다른 분석을 수행하여 화합물이 보툴리눔 신경독, 경쇄 및 체세포 활성을 억제하는지 확인할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 보툴리눔 신경독소 경쇄 억제제의 상대적 효능을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 프로토콜은 세 단계에 걸쳐 수행되었습니다. 첫째, 복합 희석 시리즈의 준비.

둘째, 재조합 경쇄 효소의 추가, 셋째, 형광 기질의 추가 및 형광판 판독기에서의 후속 측정.