형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

본 절차의 전반적인 목표는 세포 이동을 연구하기 위해 접착성 및 가용성 구배를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 비특이적 세포 접착을 방지하기 위해 표면을 패시베이션함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로 접촉 인쇄를 통해 스탬프를 제작하는 것입니다.

다음으로, 마이크로 접촉 인쇄법을 통해 처리된 표면에 스트렙타비딘 선 패턴을 형성합니다. 스트렙타비딘은 마이크로 유체 장치의 바닥에 부착된 딥펜 리소그래피를 사용하여 점 형태로 인쇄할 수도 있습니다. 이렇게 수정된 표면은 비오틴 RGD의 접착 구배를 형성하기 위한 기초가 됩니다.

마지막 단계는 수용성 화학 유인 물질 농도 구배가 존재하는 상태에서 접착 단서가 있는 표면에 세포를 로딩하는 것입니다. 최종적으로, 라이브 셀 현미경 관찰을 통해 접착 및 수용성 단서 모두에 반응하는 세포 이동을 보여줍니다. 트랜스웰 또는 보이드 챔버 분석 및 기존의 미세유체 셋업과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 표면 패턴 미세유체 장치의 통합 시스템을 통해 공간적으로 제어된 접착 단서와 접착 농도 구배, 그리고 수용성 농도 구배에 대한 세포 반응을 동시에 관찰할 수 있다는 점입니다.

본 방법은 세포 접착의 중요성이나, 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase), G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptors) 및 접착 수용체와 같은 화학 유인 수용체 간의 상호작용(cross-talk) 등 세포 이동 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 글라스 커버슬립을 랙에 담아 100% ethanol에 침지시킨 후, 해당 랙을 초음파 세척기(sonication water bath)에 30분 동안 넣어 커버슬립을 세척합니다. 세척된 글라스 커버슬립을 공기 중에서 건조시킵니다.

다음으로 1 M 수산화나트륨 용액에서 유리 커버슬립을 30분 동안 초음파 처리합니다. 그 후, 1.5 L의 milli cube water가 채워진 비커에 랙을 조심스럽게 기울여 유리 표면을 헹굽니다. 매번 새로운 milli cube water를 사용하여 세척 과정을 3회 반복합니다.

세 번째 세척 후, 유리 커버 슬립을 60 °C 오븐에서 약 30분 동안 건조합니다. 깨끗한 유리 커버 슬립의 절반을 물이 부분적으로 채워진 24웰 플레이트로 만든 습윤 챔버에 개별적으로 넣습니다. 웰을 물로 채우고 유리 커버 슬립을 웰 위에 올려놓아 코팅을 진행합니다. 이때 polylysine과 polyethylene glycol의 공중합체를 사용하며, peg 분자의 20%가 biotin에 접합되어 있습니다.

PLL Peg biotin으로 약칭하며, 각 유리 커버슬립 위에 PBS에 희석된 PLL Peg biotin 15 µL를 떨어뜨립니다. 남은 깨끗한 유리 커버슬립의 절반을 가져와 PEG 용액을 조심스럽게 샌드위치 형태로 덮습니다. 습윤 챔버에서 커버슬립을 1시간 동안 방치합니다.

1시간 후에 슬라이드를 분리하면, 샌드위치 구조의 커버가 PEG 코팅 표면을 긁지 않고 부드럽게 서로 떨어지며, 이를 UE water로 헹굽니다. PEG 처리된 면에서는 물이 쉽게 흘러내려야 합니다. 필요 시 수행하십시오.

처리된 표면이 위를 향하도록 하여 유리 커버 슬립을 페이퍼 타월 위에서 공기 건조시키십시오. 이후 사용 전까지 유리 커버 슬립을 진공 데시케이터에 보관하십시오. 본 절차에 필요한 실리콘 마스터는 포토리소그래피로 제작하며, 페트리 접시 내의 실리콘 마스터 위에 PDMS 엘라스토머를 약 1cm 높이로 부어 PDMS 스탬프를 캐스팅하고, 오븐에서 70 °C로 1시간 동안 마스터와 PDMS 혼합물을 경화시킵니다.

그 후, 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 마이크로 접촉 인쇄 기술을 사용하여 단백질 패턴을 인쇄할 수 있도록 적절한 크기로 자릅니다. 먼저 UV-오존 세척기에서 패턴 면을 1.5시간 동안 처리하여 PDMS 스탬프를 세척하고 더 친수성으로 만듭니다. 오존 처리 직후에, 스트렙타비딘 10 µL를 PDMS 스탬프 위에 떨어뜨리고 펴 바릅니다. 형광 현미경 하에서 트랙이 보여야 하는 경우에는 streptavidin- Alexa Fluor 647과 같이 형광체와 결합된 스트렙타비딘을 사용하십시오.

습윤 챔버에서 1시간 동안 둡니다. 조직지, 종이 및 공기를 이용하여 스탬프에서 과량의 strep din을 제거합니다. 스탬프를 약 1분 동안 건조합니다.

스탬프를 PLL peg biotin 코팅 유리 커버슬립 위에 살짝 누릅니다. 형광 strep din을 사용한 경우, 에피 형광 현미경으로 패턴을 관찰합니다. 단백질 패턴은 딥 펜 리소그래피를 사용하여 인쇄할 수도 있습니다.

먼저 1 mg/mL 농도의 strippin 또는 stripped avidan elif Fluor three 50 한 부분을 글리세롤 10부분과 혼합한 후, 혼합물 5 µL를 캔틸레버에 로딩합니다. 프린팅 속도를 조절하십시오. 점 크기를 줄이려면 표면과 캔틸레버의 접촉 시간 또는 표면과 캔틸레버 사이의 수직 거리를 조정하십시오.

딥 펜 리소그래피 장비 보관함의 사용 설명서에 기술된 대로 약 5 µm부터 프린팅 공정을 시작합니다. 프린팅된 모든 표면은 데시케이터에 보관합니다. 표면 구배를 생성하기 위해 상용 마이크로플루이딕 소자를 사용합니다.

수 시간 동안 누출이 발생하지 않도록 tritin이 코팅되거나 패턴화된 유리 커버슬립을 장치의 접착면에 부착하십시오. 장치의 가장자리를 가온된 바셀린의 얇은 층으로 밀봉한 후, 바셀린과 파라핀 왁스를 1:1 비율로 혼합한 두 번째 층으로 다시 밀봉하십시오. 장치의 채널에 6 µL의 PBS를 채워 두 개의 대립되는 구배를 생성하십시오.

두 개의 저장조 중 하나에는 70 µL의 biotin-fluorescein을 채우고, 다른 하나에는 biotin이 결합된 biotinylated peptide arginine glycine spartic acid(RGD) 70 µL를 채운 후, 샘플을 상온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 미세유체 장치 내의 biotin, RGD 및 biotin-fluorescein을 세척하는 과정은 기포가 갇히거나 마이크로 컨택 프린팅된 트랙이 손상될 위험이 있어 본 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공적인 수행을 위해 biotin과 PBS는 매우 조심스럽고 천천히 제거해야 합니다.

비오틴 용액을 제거하고, 미세유체 장치에 부착된 상태에서 표면을 PBS로 조심스럽게 두 번 세척합니다. 형광 표지된 세포를 미세유체 장치에 로딩하기 전, 접착제 구배의 방향을 표시합니다. 세포 수를 측정하여 세포 수가 동일하도록 두 개의 튜브에 나누어 담습니다.

세척 및 재부유. 한 개의 세포 튜브는 10% FBS가 포함된 저포도당 DMEM과 같은 화학 유인 물질이 포함된 배지에 부유시키고, 다른 세포 튜브는 0% FBS DMEM과 같이 화학 유인 물질이 없는 배지에 부유시킵니다. 각 튜브 내 세포의 최종 농도는 5 × 10⁵ cells/mL가 되어야 합니다.

미세유체 장치에서 모든 용액을 제거하고 예열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 0% FBS DMEM에 재현탁된 세포 70 µL를 한쪽 리저버에 주입합니다. 10% FBS DMEM에 재현탁된 세포 70 µL를 다른 쪽 리저버에 주입합니다.

증발을 방지하기 위해 리저버 위에 테이프를 느슨하게 붙입니다. 미세유체 장치의 채널이 시야 내에 있고 세포의 초점이 맞았는지 확인합니다. 노출 시간 및 형광 필터와 같은 이미지 획득 파라미터를 선택합니다.

이미지 획득 프로그램을 시작하여 세포와 트랙, 시간점 및 기록 길이를 설정하는 명시야 및 형광 이미지 시퀀스입니다. 이 비디오는 경쟁적인 접착성 및 용해성 구배가 있는 환경에서 이동하는 세포의 라이브 셀 이미징 방법을 시연합니다. 형광 strippin과 biotinylated RGD가 포함된 접착성 트랙은 마이크로 접촉 인쇄 또는 딥펜 리소그래피를 사용하여 제작되었습니다.

성공적인 마이크로 접촉 인쇄는 접착 트랙과 방오 영역이 명확하게 구분되는 트랙 가로 방향의 형광 강도 선 프로파일로 확인할 수 있습니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄된 도트는 눈물 모양이 아닌 둥근 형태로 나타나며, 이는 인쇄 과정이 성공적이었음을 나타냅니다. 본 예시에서는 행과 열의 간격을 10 to 15 micrometers로 설정하여 도트를 일렬로 인쇄하였습니다.

이 거리는 점들이 서로 융합되는 것을 방지하기에 충분하면서도, 단일 시야 내에서 여러 개의 점을 관찰할 수 있게 합니다. 대부분의 현미경 설정에서, 단순한 미세유체 장치를 통해 인쇄된 트랙 상에 접착 큐의 구배(Grady)가 생성되었습니다. 이는 미세유체 챔버 패널의 반대편에 biotin four fluorescein과 biotin RGD를 각각 로딩함으로써 이루어졌습니다.

A는 총 이미지 길이가 3072 micrometers인 60장의 모자이크 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서는 전체 모자이크 길이에 걸쳐 형광 강도를 측정하였습니다. 채널 내의 RGD 구배를 나타내기 위해 형광 강도에 선형 추세선을 맞추었습니다.

비오틴 RGD 용액을 제거한 후, 동일한 챔버를 사용하여 가용성 구배를 도입할 수 있습니다. 패널 A는 T=0일 때 PBS 및 플루오레세인 충전 리저버 근처와 채널 전체의 플루오레세인 염료 형광 강도를 보여줍니다. 패널 B는 가용성 큐의 형광 강도를 보여줍니다.

16시간 배양 후, 비교 결과는 구배가 최소 16시간 동안 안정적이었음을 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 서로 반대되는 구배가 형성된 미세유체 챔버 내의 세포 이동을 관찰하였으며, 대표 동영상을 여기에 제시합니다. 접착 구배는 strep avidan 트랙 상에 고정된 RGD였으며, 가용성 구배는 0~10% FBS였습니다.

이미지는 총 20시간 동안 15분 간격으로 촬영되었습니다. 보여지는 이미지 전환 속도는 초당 8프레임입니다. 두 번째 영상은 FBS 공급원을 향해 이동하는 단일 heli cell의 모습입니다.

표시된 이미지 전환 속도는 초당 8프레임입니다. 세포 궤적을 나타내는 파란색 선은 세포 추적 소프트웨어를 통해 얻었습니다. 마지막 그래픽은 첫 번째 영상의 이미지에서 추출한 세포 궤적을 보여줍니다.

가용성 FPS의 고농도 방향으로 이동한 세포 궤적은 빨간색으로, 부착성 RGD의 고농도 방향으로 이동한 세포 궤적은 검은색으로 표시되어 있습니다. 이러한 궤적을 통해 더 많은 HeLa 세포가 부착성 RGD의 고농도 방향보다 화학 유인 물질의 공급원 방향으로 이동했음을 알 수 있었습니다. 이 절차를 수행할 때 주의할 점은, 접착제 농도 기울기 준비 및 타임랩스 이미징 과정 동안 미세유체 소자 내의 PBS 또는 배지가 증발하지 않도록 하는 것이 중요하므로, 필요한 경우 점착 테이프를 사용하여 미세유체 소자의 모든 입구를 덮어 이 절차를 진행하십시오.

단백질에 의해 작용하는 세포골격의 생체역학, 세포 이동 중의 초점 접착 단백질 및 수용체와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 형질전환 및 하이브리드 솔루션 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.