형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 절차의 전반적인 목표는 세포 이동을 연구하기 위해 접착성 및 용해성 그래디언트를 만드는 것입니다. 이것은 비특이적 세포 접착을 방지하기 위한 표면인 첫 번째 부동태화(passivating)에 의해 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로 연락처 인쇄에서 우표를 제작하는 것입니다.

다음으로, ated 표면은 마이크로 접촉 인쇄에 의해 연쇄상구균 avid 라인으로 패터닝됩니다. Strapped din은 미세유체 장치의 바닥에 부착된 딥 펜 리소그래피를 사용하여 점으로 인쇄할 수도 있습니다. 변형된 표면은 비오틴 RGD의 접착 구배를 위한 기초로 작용합니다.

마지막 단계는 용해성 화학 유인 구배(soluble chemo attractant gradient)가 있는 상태에서 접착 신호(adhesive cue)를 사용하여 세포를 표면에 로드하는 것입니다. 궁극적으로, 라이브 셀 현미경 검사는 접착성 및 용해성 단서에 반응하는 세포 이동을 보여주는 데 사용됩니다. transwell 공허 약실 분석 및 전통적인 microfluidic 체제와 같은 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 표면 본 Microfluidic 장치의 분해된 체계가 공간으로 통제되는 접착성 단서 및 접착성 기온변화도 및 녹는 기온변화도에 세포의 반응을 동시에 관찰할 수 있다 입니다.

글쎄요, 이 방법은 세포 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 세포 접착의 중요성 및 화학 요법 텍사스 수용체(예: 수용체로 보이는 키나아제 G-단백질 결합 수용체)와 RIN과 같은 접착 수용체 사이의 뇌졸중을 유발합니다. 먼저 커버 슬립을 100% 에탄올이 든 랙에 담그고 랙을 아들 스케이트 수조에 30분 동안 넣어 청소합니다. 유리 덮개가 공기 중에서 미끄러지도록 말리십시오.

다음으로 유리 덮개를 1 몰 수산화 나트륨에서 30 분 동안 미끄러 뜨립니다. 그런 다음 1리터 반의 밀리 큐브 물을 채운 비커에 랙을 조심스럽게 기울여 유리 표면을 헹굽니다. 매번 신선한 밀리 큐브 물을 사용하여 헹굼 과정을 3회 반복합니다.

세 번째 헹굼 건조 후 유리 덮개는 섭씨 60도의 오븐에서 약 30분 동안 미끄러집니다. 깨끗한 유리 덮개의 절반을 부분적으로 물로 채워진 24웰 플레이트로 만들어진 습한 챔버에 개별적으로 놓습니다. 우물에는 물이 채워지고 유리 덮개 슬립이 우물 위에 놓여 있으며, 폴리리신과 폴리에틸렌 글리콜의 공중 합체가 사용되며 페그 분자의 20 %가 비오틴에 접목됩니다.

PLL Peg 비오틴으로 약칭되며, 각 유리 커버 슬립에 PBS에 PLL Peg 비오틴 15마이크로리터를 떨어뜨립니다. 나머지 깨끗한 유리 커버 슬립의 나머지 절반을 잡고 PEG 용액을 조심스럽게 끼웁니다. 덮개 슬립을 습한 챔버에 1 시간 동안 그대로 두십시오.

한 시간 동안 미끄러진 후 끼워진 덮개는 PEG 코팅 표면을 긁지 않고 UE 물로 헹구지 않고 서로 부드럽게 미끄러집니다. 물은 페그 처리된 쪽에서 쉽게 미끄러져야 합니다. 필요한 경우.

유리 커버를 종이 타월에 걸고 처리된 표면이 위쪽을 향하도록 공기 건조합니다. 유리 덮개는 진공 상태에서 미끄러져 더 사용할 때까지 건조됩니다. 이 절차에 필요한 실리콘 마스터는 PDMS 엘라스토머용 A-P-D-M-S 스탬프를 페트리 접시 내부의 실리콘 마스터에 약 1cm 높이로 주조하고 마스터와 PDMS 혼합물을 섭씨 70도의 오븐에서 1시간 동안 경화시키기 위해 포토리소그래피로 제작됩니다.

그 후, PDMS 스탬프를 실리콘 마스터에서 제거하고 마이크로 콘택트 인쇄 기술을 사용하여 단백질 패턴을 인쇄하기 위해 먼저 청소하고 오존 처리 장소 직후 1시간 30분 동안 UV 및 오존 클리너에서 패턴 면을 처리하여 PDMS 스탬프를 친수성으로 만듭니다. 그리고 10마이크로리터의 벗겨진 아딘을 PDMS 스탬프에 펴 바릅니다. 형광 현미경에서 트랙을 볼 수 있어야 하는 경우 stripped avid 및 LOR three 50과 같은 fluoro four에 접합된 stripped Aden을 사용합니다.

습한 방에서 1시간 동안 그대로 두십시오. 티슈, 종이 및 공기로 스탬프에서 과도한 연쇄상구균 소음을 제거합니다. 스탬프를 약 1분 동안 말리십시오.

스탬프를 PLL 페그 비오틴 코팅 유리 커버 슬립에 가볍게 누릅니다. 형광 연쇄상구균 din을 사용한 경우 epi 형광 현미경으로 패턴을 검사합니다. 단백질 패턴은 딥 펜 리소그래피를 사용하여 인쇄할 수도 있습니다.

먼저 밀리리터당 1밀리그램의 1부, 스트립핀 또는 벗겨낸 avidan elif Fluor three 50을 글리세롤 10부와 혼합하고 혼합물 5마이크로리터를 캔틸레버에 로드합니다. 인쇄 속도를 조정합니다. 표면에 대한 캔틸레버의 접촉 시간 또는 스폿 크기를 줄이기 위해 캔틸레버와 표면의 수직 거리.

약 5마이크로미터는 딥 펜 리소그래피 기기 상점의 사용 설명서에 설명된 대로 인쇄 프로세스를 시작합니다. 건조제에 인쇄된 모든 표면. 시판되는 미세유체 장치는 표면 구배를 생성하는 데 사용됩니다.

이 트리틴 코팅 또는 패턴이 있는 유리 커버 슬립을 장치의 끈적한 면에 부착하여 몇 시간 동안 누출이 없도록 합니다. 따뜻하게 한 바셀린의 얇은 층과 바셀린과 파라핀 왁스 한 부분을 혼합한 두 번째 층으로 장치의 가장자리를 밀봉합니다. 장치의 채널을 6마이크로리터의 PBS로 채워 두 개의 반대 그라디언트를 만듭니다.

두 개의 저장고, 하나는 70마이크로리터의 비오틴, 4개의 플루오레세인, 다른 하나는 비오틴화 펩타이드, 아르기닌 글리신, 스파르트산 또는 RGD에 접합된 70마이크로리터의 비오틴을 채우고 실온에서 암흑 속에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 미세유체 장치의 비오틴, RGD 및 비오틴을 헹구는 것은 기포를 가두고 마이크로 접촉 인쇄 트랙을 방해할 위험이 있기 때문에 이 절차의 가장 어려운 측면입니다. 성공을 위해서는 비오틴과 PBS를 조심스럽고 천천히 제거해야 합니다.

비오틴 용액을 제거하고 미세유체 장치에 부착된 상태에서 PBS로 표면을 두 번 조심스럽게 헹굽니다. 형광 표지된 세포를 미세유체 장치에 로드하기 전에 접착 구배의 방향을 표시합니다. 세포를 세고 세포 수가 동일한 두 개의 튜브로 나눕니다.

씻고 소생시키십시오. 10% FBS 세척을 통한 저포도당 DMEM과 같은 화학 유인 물질이 포함된 배지로 세포의 한 튜브를 현탁시키고 배지의 다른 세포 튜브를 현탁시킵니다. FBS가 0%인 DMEM과 같은 화학유인물질이 없는 경우, 각 튜브에 있는 세포의 최종 농도는 밀리리터당 5번째 세포의 10을 5배로 해야 합니다.

미세유체 장치에서 모든 용액을 제거하고 예열 현미경에 놓습니다. 70%F-B-S-D-M-E-M에 재현탁된 70마이크로리터의 셀을 하나의 저장소에 로드합니다. 10%F-B-S-D-M-E-M에 재현탁된 70마이크로리터의 셀을 다른 저장소로 로드합니다.

증발을 방지하기 위해 저장소 위에 느슨하게 테이프를 붙였습니다. 미세유체 장치의 채널이 시야에 있고 세포에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 노출 시간 및 형광 필터와 같은 이미지 획득 파라미터를 선택합니다.

명시야 및 형광의 이미지 시퀀스는 세포와 추적, 시점 및 기록 길이뿐만 아니라 이미지 획득 프로그램을 시작합니다. 이 동영상은 접착제 및 용해성 그래디언트가 경쟁하는 환경에서 이동하는 세포의 살아있는 세포를 이미징하는 방법을 보여줍니다. 형광 스트립핀과 비오틴화 RGD를 포함하는 접착 트랙은 마이크로 콘택트 인쇄 또는 딥 펜 리소그래피로 만들어졌습니다.

성공적인 마이크로 접촉 인쇄는 접착 트랙과 방오 영역을 명확하게 구별할 수 있는 트랙 전체의 형광 강도의 라인 프로파일로 표시됩니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄된 점은 찢어진 모양이 아닌 둥글게 나타나 성공적인 인쇄 과정을 나타냅니다. 이 예에서는 행과 열 간격을 10-15마이크로미터로 설정하여 점을 한 줄로 인쇄했습니다.

이 거리는 도트가 서로 병합되는 것을 방지하기에 충분하지만 단일 시야에서 여러 도트를 볼 수 있습니다. 대부분의 현미경 설정에서 인쇄된 트랙의 점착성 단서가 간단한 미세유체역학 장치로 만들어졌습니다. 비오틴, 4개의 플루오레세인 및 비오틴 RGD를 미세유체 챔버 패널의 반대쪽에 적재합니다.

A는 총 이미지 길이가 3072마이크로미터인 60개의 모자이크 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서 형광 강도는 전체 모자이크의 길이에 걸쳐 측정되었습니다. 선형 추세선은 채널의 RGD 구배를 나타내기 위해 형광 강도에 맞춰졌습니다.

비오틴, 비오틴 RGD 용액을 제거한 후 동일한 챔버를 사용하여 용해성 구배를 도입할 수 있습니다. 패널 A는 PBS 및 플루오레세인 충전 저장소 근처와 T에서 채널 전체에 걸쳐 플루오레세인 염료의 형광 강도를 보여줍니다. 패널 B는 용해성 신호의 형광 강도를 보여줍니다.

16시간 배양 후, 비교 가능한 결과는 그래디언트가 최소 16시간 동안 안정적임을 나타냅니다. 그는, 반대 구배를 가진 미세유체 챔버에서의 세포 이동을 이 방법을 사용하여 관찰되었으며 대표적인 동영상이 여기에 표시됩니다. 접착성 구배는 연쇄상구균 아비단 트랙에서 고정 RGD였으며 용해성 구배는 0 내지 10%FBS였습니다.

이미지는 총 20시간 동안 15분마다 촬영되었습니다. 표시된 이미지 전환은 초당 8프레임입니다. 이 두 번째 동영상은 FBS 소스를 향해 이동하는 단일 헬리 셀입니다.

표시된 이미지 전환은 초당 8프레임입니다. 세포 궤적을 나타내는 파란색 선은 세포 추적 소프트웨어를 통해 얻었습니다. 이 마지막 그래픽은 첫 번째 영화의 이미지에서 세포 궤적을 보여줍니다.

더 높은 농도의 용해성 FPS로 이동한 세포 궤적은 적색 세포 궤적에서 더 높은 농도의 부착 RGD로 이동한 세포 궤적은 검은색으로 표시됩니다. 이러한 궤적은 더 많은 헬라 세포가 더 높은 농도의 부착 RGD로 이동하는 것보다 화학 유인물질의 근원을 향해 이동하는 것을 보여주었습니다. 이 절차를 시도하는 것은 접착 구배 준비 및 라이프 스타일 이미징 중에 미세 유체 장치에서 PBS 또는 매체의 증발을 피하기 위해 기억하는 것이 중요하지만, 필요한 경우 접착 테이프를 사용하여 미세 유체 장치의 모든 입구를 덮으십시오. 이 절차를 따르십시오.

transfection 및 하이브리드 용액 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 이동 중 단백질, 국소 접착 단백질 및 수용체에 의해 작용하는 세포골격의 생체 역학과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.