Name: 형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용한 세포 이동 연구 방법입니다. 미세 접촉 인쇄와 딥 펜 리소그래피로 접착성 및 가용성 그라디언트를 제작하여 생리적 환경에서 세포 행동을 분석합니다.

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저자는 호주 연구 협의회 및 국민 건강과 호주의 의학 연구 협의회에서 기금을 인정하고 또한 감사드립니다 microcontact 인쇄 SU-8 마스터를위한 호주 국립 제조 시설. SHN는 고등 교육 말레이시아 Universiti Sains 말레이시아의 교육부에 의해 지원됩니다.

1. PLL-PEG-비오틴과 유리 Coverslips의 패시베이션 이 단계는 그 세포가 microcontract 인쇄 (2 단계-3A) 또는 딥 펜 리소그래피 (단계 3B)로 만든 유리 coverslip의 특정 지역에 준수하고 마이그레이션 있도록 표면을 패시베이션하기 위해 설계되었습니다. 패시베이션를 들어, 폴리-L-라이신 (PLL) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공동 폴리머는 PEG 분자의 20 %가 비오틴 (PLL-PEG-비오틴)에 이식되는 사용됩니다. <ol><li> 유리 coverslips (18mm X 18mm), 100 % 에탄올의 랙에 잠수함을 청소하고 30 분에 sonicating 목욕탕에서 랙을 배치합니다. 공기 또는 질소의 흐름에 따라 유리 coverslips를 말린다. </li><li> 다음 1 M NaOH의 30 분의 유리 coverslips를 sonicate. 이후 조심스럽게 1.5 L 밀리 Q H 2 O.로 가득 찬 비커에 랙을 찍어하여 유리 표면을 세정 린스 과정을 신선한 밀리 Q H 2 O 할 때마다 사용을 세 번 반복합니다. 에 유리 coverslips을 건조60 오븐 ° C. </li><li> 깨끗한 유리의 장소 반은 부분적으로 H 2 O.로 가득 찬 24 잘 플레이트로 구성되어 습기 챔버에 개별적으로 coverslips 각 유리 coverslip에 PBS에서 PLL-PEG-비오틴 (1 MG / ML) 15 μl를 버려라. 나머지 깨끗한 유리 coverslips의 다른 반쪽을 가지고주의 깊게 샌드위치 PEG 솔루션을. 습기 챔버에서 1 시간 동안 coverslips 둡니다. PEG-코팅 표면을 스크랩 않고 부드럽게 거리에 서로 끼어 coverslips을 밀고 밀리 Q H 2 O.과 함께 씻어 물은 PEG-처리 측면에 감정 밀어해야합니다. 필요한 경우, 치료를 표면과 종이 타월에 공기 건조 유리 coverslips이 위쪽으로 향하고 있습니다. 자세한 사용까지 진공 건조기에서 유리 coverslips를 저장합니다. </li></ol> 2. Microcontact 인쇄를위한 우표의 제작 우리는 passivated 유리 coverslips에 패턴 streptavidin 트랙 두 프로세스를 설명합니다. 첫 번째, 마이크rocontact 인쇄는 일반적으로 PDMS 스탬프가 캐스팅되어있는 실리콘 마스터의 제조가 필요합니다. 우리의 경우, PDMS 스탬프의 패턴은 25 μm의 기능 높이 290 μm 센터 - 투 - 센터를 간격을두고 아르 100 μm 전체 선입니다. 다음, 우리는 적절한 실리콘 마스터 (단계 2.1-2.3)와 PDMS 스탬프 (단계 2.4) 제조하는 방법을 간단히 설명합니다. 그러나, 유리 coverslips에 단백질 패턴을 인쇄에 적합한 문헌 19-23에 설명 microcontact 인쇄에 대한 여러 프로토콜이 있습니다. 석사도 맞춤 제작과 상업 소스에서 구입하실 수 있습니다. <ol><li> MilliQ H 2 O.으로 철저하게 10 시간 20 분의 웨이퍼를 씻어. : 첫째, 피라냐 솔루션 (황산 산의 V와 30 % 과산화수소 3시 1분 V)에 잠복기하여 실리콘 웨이퍼 (4 &quot;직경)을 청소 150 오븐에 웨이퍼를 건조 ° CO / N. </li><li> 백퍼센트 이소 프로필 알코올에 이어 100 % 아세톤으로 깨끗하고 마른 실리콘 웨이퍼를 씻어. 다음40 초 동안 3,100 rpm으로 웨이퍼 위에 GM1070 SU-8 포토 레지스트 (Gersteltec SARL)의 스핀 코트 2 ML은 25 μm 두께의 레이어를 만들 수 있습니다. 샘플 후 95에서 추가로 5 분 뒤에 5 분 ° C.에 65 ° C에서 핫 플레이트에 구운합니다 </li><li> 원하는 패턴 (Quintel Q6000 마스크 aligner를 사용하는 예를 들어)와 photomask에서 60 초에 UV 빛 SU-8 포토 레지스트를 노출하고 제빵 과정은 2.2에서 설명 반복합니다. 그런 다음 샘플 100 % 이소 프로필 알코올에 헹구어 및 질소 흐름 하에서 건조 4 분에 대한 SU-8 개발자 (Gersteltec SARL)에 웨이퍼를 immersing에 의해 개발되었습니다. UV 빛에 노출되지 SU-8 포토 레지스트의 영역은 따라서 PDMS 스탬프의 역 패턴을 생성, 삭제됩니다. </li><li> 다음 단계는 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 캐스팅하는 것입니다. 첫째, 철저하게 엘라스토머 성 예비 중합체의 10 부품 (Sylgard 184)와 경화 에이전트 한 부분을 (w / w) 섞는다. 진공 라인에 부착 된 건조기에서 가스를 제거하다에게, 혼합물을 공기 방울을 제거하려면1 시간에. 다음, 높이 약 1cm에 페트리 접시 안에 실리콘 마스터에 PDMS 엘라스토머을 부어 1 시간 70에서 오븐 ° C에서 마스터와 PDMS 혼합물을 치료. 마지막으로, PDMS 스탬프는 실리콘 마스터에서 제거하고 크기로 절단됩니다. </li></ol> 3. Passivated 유리 Coverslips로 패턴의 Streptavidin 또는 접착제 큐 유리 coverslips을 부동화 한 후, 단백질 패턴은 microcontact 인쇄 (단계 3A) 또는 딥 - 펜 리소그래피 (단계 3B)로 인쇄됩니다. 우리의 경우, streptavidin는 RGD의 기울기 (4 단계)을위한 기반을 형성 선,로 인쇄됩니다. 동일한 절차는 접착제 패턴을 만들 매트릭스 단백질을 인쇄에 사용할 수 있습니다. 표면 위에 분자의 패터닝을위한 microcontact 인쇄에 대한 대안 방법은 딥 펜 리소그래피입니다. 딥 펜 리소그래피에서 캔틸레버는 표면에 솔루션의 작은 볼륨을 전송하는 데 사용됩니다. cantilevers의 크기, V솔루션의 점성이 표면에 캔틸레버 시간에 문의 인쇄 챔버의 표면과 습도의 소수성는 인쇄 기능의 크기를 확인합니다. 이 방법의 장점은 주인과 우표를 조작 할 필요가 없습니다에 따라 다른 패턴이 각 실험 인쇄 할 수 있다는 것입니다. 단점은 주어진 패턴을 인쇄 딥 펜 리소그래피는 많은 실험실에서 사용하지 못할 수 있습니다 전문 악기를 요구하는 데 시간이 오래 걸립니다 있다는 것입니다. 우리가 사용하는 딥 펜 리소그래피 장비는 Bioforce Nanoscience에서 NanoeNabler했다. 여기, 우리가 SPT10 cantilevers를 사용하는, 직경 &lt;10 μm이었다 작은 점을 출력한다. 3A. Microcontact 인쇄 (μCP) 기술 <ol><li> 세척 및 PDMS 스탬프가 더 친수성 ​​수 있도록, 1.5 시간에 대한 UV와 오존 (Bioforce Nanoscience에서 예를 들어, UV 오존 Procleaner)의 PDMS 스탬프의 패턴 측면을 취급합니다. 또한, 플라즈마를 사용하여같은 목적을 위해 짧은 시간에 청소기. 이 과정은 인쇄 과정을 개선 산화 PDMS 표면 24, 만듭니다. </li><li> 오존 또는 플라즈마 치료, 장소와는 PDMS 스탬프에 10 μl streptavidin을 (PBS 1 MG / ML) 확산과 습윤 챔버 (예 : 부분적으로 채워진 6 잘 판으로, 단계 1.3 참조) 1 시간에 출발 후 즉시 . 트랙 형광 현미경으로 볼 수 있어야 경우, 해당 streptavidin-AlexaFluor350 같은 형광에 복합이다 streptavidin을 사용합니다. </li><li> 조직 종이와 공기를 약 1 분 동안 우표를 건조와 도장에서 초과 streptavidin을 제거합니다. 살짝 PLL-PEG-비오틴 - 코팅 유리 coverslip에 도장을 누릅니다. </li><li> 형광 streptavidin이 단계 3.a2에 사용 된 경우 epifluorescence 현미경을 사용하여 패턴을 검사합니다. 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다. </li></ol> 3B. 수영 펜 리소그래피 <ol><li> 먼저, 1 MG / ML streptavidin 또는 stre의 1 부분을 혼합글리세롤의 10 부분 (V / V)와 ptavidin - AlexaFluor350하고 캔틸레버에 혼합물의 5 μl를로드합니다. 딥 펜 리소그래피 장비의 작동 설명서에 설명 된대로 다음 인쇄 작업을 시작합니다. 약 5 μm의 스폿 사이즈를 줄이기 위해 인쇄 속도를 조정하고, 표면에 캔틸레버의 표면 또는 수직 거리에 캔틸레버의 시간을 문의하십시오. 그림 2C에 표시된 예에서, 점 행과 10-15 μm로 설정 열 분리와 라인에 인쇄되었습니다. 이 거리가 서로 병합에서 점을 방지하기 위해 충분하지만 대부분의 현미경 설정보기의 단일 필드에 여러 점의 볼 수 있습니다. </li><li> 건조기에 인쇄 된 표면을 저장합니다. </li></ol> 4. Streptavidin-패턴 표면 위에 접착제 그라디언트를 만들기 우리는 streptavidin (그림 3) 또는 공동으로 코팅되어 유리 coverslips에 비오틴-RGD의 접착제 그라디언트를 만들passivated 유리 coverslips에 ntain streptavidin 패턴 (그림 5). 표면 기울기를 만들려면, 우리는 수동적 확산에 의해 안정적인 솔루션 기울기를 만들어 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D이라고도 함) 사용됩니다. streptavidin 구속력이 사이트에 대해 경쟁하기 위해, 우리는 (그림 1 참조) RGD에 복합 아니었다 비오틴-RGD과 비오틴의 두 반대 그라디언트를 고용. <ol><li> 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D 장치의 끈적한면에 streptavidin - 코팅 또는 패턴 유리 coverslips을 준수합니다. 몇 시간에 대한 누설이없는 것을 확인하려면, 장치의 가장자리는 따뜻하게 바셀린의 얇은 층으로와 파라핀 왁스의 1 부분 (w / w)에 바세린 1 부분의 혼합물의 두 번째 층으로 밀봉되어 있습니다. </li><li> 채널 6 μl PBS로 장치의 채널을 입력합니다. 그런 다음 PBS 70 &amp; m에서 0.03 μg / μl 비오틴-4-fluorescein의 70 μl로 두 저수지를 작성U, 0.03 μg의 L / μl 비오틴-RGD 각각 PBS 인치 1 시간에 어둠 속에서 RT의 샘플을 품다. </li><li> 비오틴 솔루션을 제거하고 여전히 PBS로 두 번 마이크로 유체 장치에 부착 동안주의 깊게 표면을 씻어. 접착제 그라디언트의 방향을 표시하고 필요한 경우에 대해 4 ° C에서 PBS로 가득 장치를 저장하지만 장치가 밖으로 건조하지 않도록. 필요한 경우, 형광 현미경으로 접착제 기울기를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 라이브 셀 이미징에 대한 Fluorophores과 세포의 Labelling 세포는 형광 현미경으로 세포 추적을 지원 형광 염료로 표시됩니다. 일반 프로브는 형광 세포 기관 마커, 세포 핵을 레이블 등 Syto 64 레드입니다. 이렇게하려면 셀을 먼저 한 다음 45 분을위한 문화 미디어 1 μM Syto 64 레드와 incubated, PBS로 세 번 씻어 마지막으로 PBS를 추가로 세 번 씻어 수 있습니다. 세포가 아니어야합니다오랜 기간 동안 PBS에 보관. 셀 추적의 대체 염료는 세포질에 얼룩 CellTracker 시리즈이며, 세포 마이그레이션 및 부서 동안 유지됩니다. 형광 융합 단백질과 세포의 Transfection는 마이그레이션하는 동안 관심의 단백질의 subcellular 배포판을 기록 할 특히 유용합니다. 그러나, 유기 염료보다 일반적으로 사진 표백제를 빠르게 형광 단백질은 장기 관찰 있도록 할 수없는 경우가 있습니다. 6. Microfluidics 장치로 가용성식이 그라데이션으로 셀의로드 <ol><li> 동일한 전화 번호의 두 튜브로 휘황 표시 셀 및 분할을 계산합니다. 이러한 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 낮은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)로 chemoattractant를 포함하는 미디어와 셀 중 하나 관을 씻고 resuspend. 세탁 및 chemoattractant, 0퍼센트 FBS와 즉 DMEM없이 미디어 세포의 다른 튜브를 resuspend. 최종 농도각 튜브에 세포의 5 × 10 5 세포 / ML해야합니다. </li><li> 마이크로 유체 장치 (단계 4.3에서)에서 모든 솔루션을 제거하고 (7 단계 참조) 현미경 스테이지에 배치합니다. 한 저수지와 다른에 HELA 세포의 70 μl (10 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로 세포의 70 μl를 (0 % FBS DMEM 5 × 10 5 세포 / ML)로드합니다. 대충 증발을 방지하기 위해 저수지 위에 테이프를 배치합니다. 표면에 세포가 이전 영상에 대한 사전 incubated 경우,이 세포는 그라디언트없이 성장 미디어 장치에로드하는 것이 좋습니다. 장치는 다음 현미경 스테이지에 배치하고 미디어는 다른에서 10 % FBS와 하나 저수지와 DMEM에 FBS가없는 그라디언트 미디어 즉 DMEM로 대체됩니다. </li></ol> 7. 세포 이미징 및 데이터 분석 라이브 <ol><li> 현미경 (니콘 티-E)에 전환하고 실험을 시작하기 전에 적어도 1 시간을 무대를 따뜻하게. </li><li> 확인이 micr의 채널ofluidic 장치가 시야에 있으며 셀이 초점에 있습니다. 이러한 노출 시간과 형광 필터, 셀 및 트랙을 캡처 시야 및 형광의 이미지 시퀀스뿐만 아니라 시간 포인트 및 녹화 길이 (예 : 16 시간마다 15 분) 등의 이미지 수집 매개 변수를 선택합니다. </li><li> 이러한 ImageJ 수동 추적 또는 Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 적절한 소프트웨어와 데이터를 분석합니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 할 상업적 이익이 없습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 세포 이주에 대한 화학적으로 수정 표면과 chemoattractant 그라디언트의 효과를 연구하기 (Ibidi에서 끈적 - 슬라이드 Chemotaxis 3D) 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 장치를 사용했습니다. 그라디언트는 채널의 길이를 따라 확산에 의해 설립되기 때문에 이러한 마이크로 유체 설정은 흐름을 필요로하지 않습니다. 흐름이 differentially 등 안정적인 초점 adhesions 작은 초점 단지와 시냅스 26을 형성 대부분의 백혈구와 같은 빠른 마이그레이션 세포를 형성 섬유 아세포로 천천히 마이그레이션 세포에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다. 층류에서 전단 응력은 수용성 신호 27,28에 대한 접착제 신호와 세포 chemotaxis에 세포 접착의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 느린 이동 헬러 세포함으로써 마이크로 유체 설치가 모두 자기편 덜 자기편 세포 유형에 대한 적용을 보여 빠르게 움직이는 J77...

감독 세포 이주는 많은 세포의 기본 특성이며, 배아 개발, 감염에 대한 방어와 상처 치유 등 많은 정상적인 생리 과정의 핵심 부분입니다. 또한, 세포 마이그레이션은 또한 혈관 질환, 종양 세포의 전이 및 만성 염증의 1,2 등 여러 질병에 눈에 잘 띄는 역할을합니다. 클래식 세포 마이그레이션 상태 동안 - 편광, 돌출부 확장, 부착, 힘 생성 및 후면 철회 형성은 - 일반적으로 3,4를 사용할 수 있습니다, 신호 통합 조정하는이 spatiotemporal 메커니즘의 해설이 더 도전했습니다. 세포 외 기질 (ECM)은 세포 접착을위한 기판으로 제공하며, 고유의 화학 5 물리적 여섯 다양성을 통해, 셀 탐색 7,8에 대한 방향 신호를 제공합니다. 이러한 접착제 단서 9, 수용성 요소 10-12 외에도 &lt;/ 저녁을 먹다&gt; 같은 chemokines 및 성장 요인으로 할 수 chemoattractant 수용체 및 하류 motogenic 신호를 통해 직접 세포 이주를 유도. 현재, 그것은 참여와 유착 수용체 (즉, integrins) 또는 수용체 티로신 키나제의 (RTK)와 같은 chemoattractant 수용체를 통해 신호가 지배적인지 알 수 없습니다. 또한이 수용체 시스템의 계층 셀 타입 특정 있는지 여부 알려져 있습니다. 라이브 세포 현미경은 대량 assays에 액세스 할 수 있으며, 고정 13,14 및 가용성 단서 15 16의 그라디언트를 생성하기 위해 마이크로 유체 장치와 결합 될 수있는 정보의 풍부한을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 쉽게 세포 생물학 연구실 (그림 1)으로 구현 될 수있는 세포 마이그레이션에 대한 이미지 분석을 만들 수있는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 유체 챔버와 함께 표면 변형에 대한 간단하고 안정적인 일련의 단계를 사용합니다. 조립마이크로 유체 장치는 유리 17 비교하고 diffusible 분자의 기울기는 최소 16 시간을위한 안정적인 광학 특성이 있습니다. 이 시스템은 epifluorescence 및 고급 현미경 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 chemotaxis 설정에서 18과는 달리,이 시스템은 천천히 마이그레이션, 자기편 세포를 녹음에 적합합니다. 중요한 시스템은 모듈 방식이며, 쉽게 대체 접착제 또는 용해 마이그레이션 단서 및 다양한 세포 유형의 시험의 소개가 있습니다.

<table><tbody><tr><td>커버글라스 얼룩 아웃핏</td><td>토마스 사이언티픽</td><td>8542 E40</td><td>커버슬립 랙</td></tr><tr><td>오븐</td><td>바인더</td><td></td><td>ED 53 시리즈</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>실리콘 퀘스트</td><td>708-007</td><td>보론 도핑 < 100쪽> 웨이퍼, 4 "직경, 500 &mU; m, 단면 광택</td></tr><tr><td>GM1070 SU-8 포토레지스트</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 현상액</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 경화제</td><td>다우 코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 프리폴리머</td><td>다우 코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-비오틴(20%)</td><td>SuSos AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-비오틴(20%)</td><td>1 mg/ PBS</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>46955</td><td>중 ml PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor350</td><td>Invitrogen</td><td>S-11249</td> 중 <td>1 mg/ml PBS</td></tr><tr><td>Biotin-4-fluorescein</td><td>Invitrogen</td><td>B-1370</td><td>0.03 &mu; 지/&무; PBS</td></tr><tr><td>비오틴-RGD</td><td>GenScript</td><td>SC1208</td><td>0.03 mg/ml의 PBS</td></tr><tr><td>Syto 64 Red</td><td>Invitrogen</td><td>S-11346</td><td>1 &mu; PBS</td></tr><tr><td>끈적 끈적한 슬라이드 화학 주성 3D</td><td>Ibidi</td><td>80328</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu의 M; l Greiner 노란색 비스듬한 팁</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739261</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 왁스, mp 55-57 &deg; C</td><td>시그마</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>나노 eNabler 10 &mu; m 캔틸레버 </td><td>BioForce</td><td>SPT-S-C-10s</td><td></td></tr><tr><td>이미지 J 소프트웨어</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>Manual Tracking plugin</td><td>Fabrice Cordeli&#232; res</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td></tr><tr><td>화학요법 및 마이그레이션 도구</td><td>Ibidi GmbH</td><td></td><td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td></tr></tbody></table>

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

세포는 세포 외 기질 및 성장 요인과 같은 수용성 신호의 glycoproteins와 같은 접착제 신호의 높은 농도를 향해 감지하고 마이그레이션 할 수 있습니다. 여기, 우리는 라이브 세포 이미징와 호환되는 마이크로 유체 챔버에 접착제 및 가용성 신호의 반대 그라디언트를 만드는 방법을 설명합니다. 폴리-L-라이신 및 폴리에틸렌 글리콜 (PLL-PEG)의 공중 합체는 유리 coverslips을 패시베이션 및 분자 및 세포의 비 특정 흡착을 방지하기 위해 사용된다. 다음 microcontact 인쇄 또는 딥 펜 리소그래피는 접착제 단서로 biotinylated 펩타이드 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 (RGD)에 포인트를 고정 역할을 passivated 표면에 streptavidin의 트랙을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 유체 장치는 수정 표면에 배치하고 streptavidin 트랙에 접착제 신호 (100 % 0 % RGD에 RGD)의 기울기를 만드는 데 사용됩니다. 마지막으로, 같은 마이크로 유체 장치는 chemoattractant suc의 기울기를 만드는 데 사용됩니다접착제 신호의 기울기의 반대 방향으로 용해 신호로 태아 소 혈청 (FBS)과 같은 H.

셀 철새 신호를 25 통합 방법을 이해하기 위해, 우리는 경쟁 접착제 및 가용성 그라디언트 (그림 1) 환경에서 마이그레이션하는 형광 현미경으로 이미지 셀에 방법을 개발했습니다. 형광 streptavidin과 biotinylated RGD를 포함 접착제 트랙이 microcontact 인쇄 트랙과 딥 펜 리소그래피 (그림 2)로 만들어졌습니다. 성공적인 microcontact 인쇄는 접착제 트랙과 안티 오염 지역 명확하게 (그림 2B) 구별 할 수있는 트랙에서 형광 강도의 라인 프로파일로 표시됩니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄 점 반올림, 성공적인 인쇄 프로세스를 나타냅니다 모양 찢어 지지도 않아요 나타납니다. 표면 화학 및 습도는 인쇄 프로세스의 결과에 영향을 미칩니다. 일반적으로, 더 소수성 표면은, 인쇄 결과수록 좋습니다. 접착제 신호의 기울기인쇄 트랙에 비오틴-4...

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

본 절차의 전반적인 목표는 세포 이동을 연구하기 위해 접착성 및 가용성 구배를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 비특이적 세포 접착을 방지하기 위해 표면을 패시베이션함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로 접촉 인쇄를 통해 스탬프를 제작하는 것입니다.다음으로, 마이크로 접촉 인쇄법을 통해 처리된 표면에 스트렙타비딘 선 패턴을 형성합니다. 스트렙타비딘은 마이크로 유체 장치의 바닥에 부착된 딥펜 리소그래피를 사용하여 점 형태로 인쇄할 수도 있습니다. 이렇게 수정된 표면은 비오틴 RGD의 접착 구배를 형성하기 위한 기초가 됩니다.마지막 단계는 수용성 화학 유인 물질 농도 구배가 존재하는 상태에서 접착 단서가 있는 표면에 세포를 로딩하는 것입니다. 최종적으로, 라이브 셀 현미경 관찰을 통해 접착 및 수용성 단서 모두에 반응하는 세포 이동을 보여줍니다. 트랜스웰 또는 보이드 챔버 분석 및 기존의 미세유체 셋업과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 표면 패턴 미세유체 장치의 통합 시스템을 통해 공간적으로 제어된 접착 단서와 접착 농도 구배, 그리고 수용성 농도 구배에 대한 세포 반응을 동시에 관찰할 수 있다는 점입니다.본 방법은 세포 접착의 중요성이나, 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase), G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptors) 및 접착 수용체와 같은 화학 유인 수용체 간의 상호작용(cross-talk) 등 세포 이동 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 글라스 커버슬립을 랙에 담아 100% ethanol에 침지시킨 후, 해당 랙을 초음파 세척기(sonication water bath)에 30분 동안 넣어 커버슬립을 세척합니다. 세척된 글라스 커버슬립을 공기 중에서 건조시킵니다.다음으로 1 M 수산화나트륨 용액에서 유리 커버슬립을 30분 동안 초음파 처리합니다. 그 후, 1.5 L의 milli cube water가 채워진 비커에 랙을 조심스럽게 기울여 유리 표면을 헹굽니다. 매번 새로운 milli cube water를 사용하여 세척 과정을 3회 반복합니다.세 번째 세척 후, 유리 커버 슬립을 60 °C 오븐에서 약 30분 동안 건조합니다. 깨끗한 유리 커버 슬립의 절반을 물이 부분적으로 채워진 24웰 플레이트로 만든 습윤 챔버에 개별적으로 넣습니다. 웰을 물로 채우고 유리 커버 슬립을 웰 위에 올려놓아 코팅을 진행합니다. 이때 polylysine과 polyethylene glycol의 공중합체를 사용하며, peg 분자의 20%가 biotin에 접합되어 있습니다.PLL Peg biotin으로 약칭하며, 각 유리 커버슬립 위에 PBS에 희석된 PLL Peg biotin 15 µL를 떨어뜨립니다. 남은 깨끗한 유리 커버슬립의 절반을 가져와 PEG 용액을 조심스럽게 샌드위치 형태로 덮습니다. 습윤 챔버에서 커버슬립을 1시간 동안 방치합니다.1시간 후에 슬라이드를 분리하면, 샌드위치 구조의 커버가 PEG 코팅 표면을 긁지 않고 부드럽게 서로 떨어지며, 이를 UE water로 헹굽니다. PEG 처리된 면에서는 물이 쉽게 흘러내려야 합니다. 필요 시 수행하십시오.처리된 표면이 위를 향하도록 하여 유리 커버 슬립을 페이퍼 타월 위에서 공기 건조시키십시오. 이후 사용 전까지 유리 커버 슬립을 진공 데시케이터에 보관하십시오. 본 절차에 필요한 실리콘 마스터는 포토리소그래피로 제작하며, 페트리 접시 내의 실리콘 마스터 위에 PDMS 엘라스토머를 약 1cm 높이로 부어 PDMS 스탬프를 캐스팅하고, 오븐에서 70 °C로 1시간 동안 마스터와 PDMS 혼합물을 경화시킵니다.그 후, 실리콘 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하고 마이크로 접촉 인쇄 기술을 사용하여 단백질 패턴을 인쇄할 수 있도록 적절한 크기로 자릅니다. 먼저 UV-오존 세척기에서 패턴 면을 1.5시간 동안 처리하여 PDMS 스탬프를 세척하고 더 친수성으로 만듭니다. 오존 처리 직후에, 스트렙타비딘 10 µL를 PDMS 스탬프 위에 떨어뜨리고 펴 바릅니다. 형광 현미경 하에서 트랙이 보여야 하는 경우에는 streptavidin- Alexa Fluor 647과 같이 형광체와 결합된 스트렙타비딘을 사용하십시오.습윤 챔버에서 1시간 동안 둡니다. 조직지, 종이 및 공기를 이용하여 스탬프에서 과량의 strep din을 제거합니다. 스탬프를 약 1분 동안 건조합니다.스탬프를 PLL peg biotin 코팅 유리 커버슬립 위에 살짝 누릅니다. 형광 strep din을 사용한 경우, 에피 형광 현미경으로 패턴을 관찰합니다. 단백질 패턴은 딥 펜 리소그래피를 사용하여 인쇄할 수도 있습니다.먼저 1 mg/mL 농도의 strippin 또는 stripped avidan elif Fluor three 50 한 부분을 글리세롤 10부분과 혼합한 후, 혼합물 5 µL를 캔틸레버에 로딩합니다. 프린팅 속도를 조절하십시오. 점 크기를 줄이려면 표면과 캔틸레버의 접촉 시간 또는 표면과 캔틸레버 사이의 수직 거리를 조정하십시오.딥 펜 리소그래피 장비 보관함의 사용 설명서에 기술된 대로 약 5 µm부터 프린팅 공정을 시작합니다. 프린팅된 모든 표면은 데시케이터에 보관합니다. 표면 구배를 생성하기 위해 상용 마이크로플루이딕 소자를 사용합니다.수 시간 동안 누출이 발생하지 않도록 tritin이 코팅되거나 패턴화된 유리 커버슬립을 장치의 접착면에 부착하십시오. 장치의 가장자리를 가온된 바셀린의 얇은 층으로 밀봉한 후, 바셀린과 파라핀 왁스를 1:1 비율로 혼합한 두 번째 층으로 다시 밀봉하십시오. 장치의 채널에 6 µL의 PBS를 채워 두 개의 대립되는 구배를 생성하십시오.두 개의 저장조 중 하나에는 70 µL의 biotin-fluorescein을 채우고, 다른 하나에는 biotin이 결합된 biotinylated peptide arginine glycine spartic acid(RGD) 70 µL를 채운 후, 샘플을 상온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 미세유체 장치 내의 biotin, RGD 및 biotin-fluorescein을 세척하는 과정은 기포가 갇히거나 마이크로 컨택 프린팅된 트랙이 손상될 위험이 있어 본 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공적인 수행을 위해 biotin과 PBS는 매우 조심스럽고 천천히 제거해야 합니다.비오틴 용액을 제거하고, 미세유체 장치에 부착된 상태에서 표면을 PBS로 조심스럽게 두 번 세척합니다. 형광 표지된 세포를 미세유체 장치에 로딩하기 전, 접착제 구배의 방향을 표시합니다. 세포 수를 측정하여 세포 수가 동일하도록 두 개의 튜브에 나누어 담습니다.세척 및 재부유. 한 개의 세포 튜브는 10% FBS가 포함된 저포도당 DMEM과 같은 화학 유인 물질이 포함된 배지에 부유시키고, 다른 세포 튜브는 0% FBS DMEM과 같이 화학 유인 물질이 없는 배지에 부유시킵니다. 각 튜브 내 세포의 최종 농도는 5 × 10⁵ cells/mL가 되어야 합니다.미세유체 장치에서 모든 용액을 제거하고 예열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 0% FBS DMEM에 재현탁된 세포 70 µL를 한쪽 리저버에 주입합니다. 10% FBS DMEM에 재현탁된 세포 70 µL를 다른 쪽 리저버에 주입합니다.증발을 방지하기 위해 리저버 위에 테이프를 느슨하게 붙입니다. 미세유체 장치의 채널이 시야 내에 있고 세포의 초점이 맞았는지 확인합니다. 노출 시간 및 형광 필터와 같은 이미지 획득 파라미터를 선택합니다.이미지 획득 프로그램을 시작하여 세포와 트랙, 시간점 및 기록 길이를 설정하는 명시야 및 형광 이미지 시퀀스입니다. 이 비디오는 경쟁적인 접착성 및 용해성 구배가 있는 환경에서 이동하는 세포의 라이브 셀 이미징 방법을 시연합니다. 형광 strippin과 biotinylated RGD가 포함된 접착성 트랙은 마이크로 접촉 인쇄 또는 딥펜 리소그래피를 사용하여 제작되었습니다.성공적인 마이크로 접촉 인쇄는 접착 트랙과 방오 영역이 명확하게 구분되는 트랙 가로 방향의 형광 강도 선 프로파일로 확인할 수 있습니다. 딥 펜 리소그래피로 인쇄된 도트는 눈물 모양이 아닌 둥근 형태로 나타나며, 이는 인쇄 과정이 성공적이었음을 나타냅니다. 본 예시에서는 행과 열의 간격을 10 to 15 micrometers로 설정하여 도트를 일렬로 인쇄하였습니다.이 거리는 점들이 서로 융합되는 것을 방지하기에 충분하면서도, 단일 시야 내에서 여러 개의 점을 관찰할 수 있게 합니다. 대부분의 현미경 설정에서, 단순한 미세유체 장치를 통해 인쇄된 트랙 상에 접착 큐의 구배(Grady)가 생성되었습니다. 이는 미세유체 챔버 패널의 반대편에 biotin four fluorescein과 biotin RGD를 각각 로딩함으로써 이루어졌습니다.A는 총 이미지 길이가 3072 micrometers인 60장의 모자이크 이미지를 보여줍니다. 패널 B에서는 전체 모자이크 길이에 걸쳐 형광 강도를 측정하였습니다. 채널 내의 RGD 구배를 나타내기 위해 형광 강도에 선형 추세선을 맞추었습니다.비오틴 RGD 용액을 제거한 후, 동일한 챔버를 사용하여 가용성 구배를 도입할 수 있습니다. 패널 A는 T=0일 때 PBS 및 플루오레세인 충전 리저버 근처와 채널 전체의 플루오레세인 염료 형광 강도를 보여줍니다. 패널 B는 가용성 큐의 형광 강도를 보여줍니다.16시간 배양 후, 비교 결과는 구배가 최소 16시간 동안 안정적이었음을 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 서로 반대되는 구배가 형성된 미세유체 챔버 내의 세포 이동을 관찰하였으며, 대표 동영상을 여기에 제시합니다. 접착 구배는 strep avidan 트랙 상에 고정된 RGD였으며, 가용성 구배는 0~10% FBS였습니다.이미지는 총 20시간 동안 15분 간격으로 촬영되었습니다. 보여지는 이미지 전환 속도는 초당 8프레임입니다. 두 번째 영상은 FBS 공급원을 향해 이동하는 단일 heli cell의 모습입니다.표시된 이미지 전환 속도는 초당 8프레임입니다. 세포 궤적을 나타내는 파란색 선은 세포 추적 소프트웨어를 통해 얻었습니다. 마지막 그래픽은 첫 번째 영상의 이미지에서 추출한 세포 궤적을 보여줍니다.가용성 FPS의 고농도 방향으로 이동한 세포 궤적은 빨간색으로, 부착성 RGD의 고농도 방향으로 이동한 세포 궤적은 검은색으로 표시되어 있습니다. 이러한 궤적을 통해 더 많은 HeLa 세포가 부착성 RGD의 고농도 방향보다 화학 유인 물질의 공급원 방향으로 이동했음을 알 수 있었습니다. 이 절차를 수행할 때 주의할 점은, 접착제 농도 기울기 준비 및 타임랩스 이미징 과정 동안 미세유체 소자 내의 PBS 또는 배지가 증발하지 않도록 하는 것이 중요하므로, 필요한 경우 점착 테이프를 사용하여 미세유체 소자의 모든 입구를 덮어 이 절차를 진행하십시오.단백질에 의해 작용하는 세포골격의 생체역학, 세포 이동 중의 초점 접착 단백질 및 수용체와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 형질전환 및 하이브리드 솔루션 현미경법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 잘 정의된 microenvironment의 공간 및 시간적 그라디언트를 생성할 수있는 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 microfabrication을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 그라디언트 생성 microfluidic 장치가 감독 셀 마이 그 레이션, embryogenesis, 상처 치유, 및 암 전이를 공부하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

화학적 및 산소 구배의 제어는 세포 배양에 필수적입니다. 이 논문은 세포 이동 연구를 위한 화학적 및 산소 구배의 조합을 안정적으로 생성할 수 있는 폴리디메틸실록산-폴리카보네이트(PDMS-PC) 미세유체 장치를 보고하며, 이는 정교한 기기 없이 생물학 실험실에서 실용적으로 활용할 수 있습니다.

셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

배우세요 형광 현미경을 이용한 세포 이동 연구 방법입니다. 미세 접촉 인쇄와 딥 펜 리소그래피로 접착성 및 가용성 그라디언트를 제작하여 생리적 환경에서 세포 행동을 분석합니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

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