シーケンシャル

本手順の全体的な目的は、骨折修復における内因性骨形成幹細胞および前駆細胞の遊走、増殖、および分化を逐次的に追跡し、定量化することである。これはまず、ポリシニルポリイノシン酸（poly I:C）の注入により、in vivoでMx1陽性細胞を標識し、次いで放射線照射によって常在性のMx1陽性造血細胞を除去することで達成される。第2ステップでは、野生型骨髄細胞を放射線照射したマウスに系統的に投与する。

次に、ニードルドリリングによりマウスのCal領域に微小骨折を誘発させます。最後に、微小骨折の修復過程を連続的な生体内イメージングで観察します。最終的に、これらの生体内イメージング画像を用いて、骨折部位への骨形成幹細胞および前駆細胞の流入と増殖のダイナミクスを評価することができます。

したがって、本手法の主な利点は、骨折治癒の過程において、骨芽細胞系幹細胞および前駆細胞のin vivoでの反復イメージングが可能になることです。本手法の意義は、骨折治癒および骨粗鬆症の治療へと展開されます。これにより、骨の再生および修復における内在性骨芽細胞系幹前駆細胞をモニタリングするための新たなツールが提供されます。

組織損傷を最小限に抑えてマイクロフラクチャーを形成し、かつ重度の瘢痕形成を誘発せずに骨折損傷のin vivoイメージングを繰り返し行うことは、本手法において重要であり、技術的な困難を伴うため、視覚的な実演が不可欠です。in vivoでMX1陽性細胞を標識するには、まずMX1 Creリポーターマウスの体重20 gあたり200 µLのポリ酸性ポリシトイリ酸を、10日間、1日おきに1回腹腔内投与します。次に、常在するMX1陽性造血細胞を除去するため、投与したマウスに9.5 Gyを単回照射します。24時間後、野生型骨髄細胞1×10⁶個をマウス1匹につき静脈内移植します。

4～6週間後、ケタミン・キシラジン50 µLを腹腔内投与してマウスを麻酔します。足趾をつねって鎮静を確認した後、骨髄細胞を移植したマウスの頭皮をバリカンで剃り、露出した皮膚を70%アルコール綿で消毒します。角膜の乾燥を防ぐためにティアジェルを塗布し、片方の耳からもう一方の耳にかけて、頭皮に1 cm未満の横切開を加えます。次に、動物を約60度回転させ、ピンセットを用いて鼻から約2～3 mmのところまで切開を続けます。

皮膚を動物の両側へ引き寄せ、前頭骨および矢状縫合と冠状縫合の交点が見えるように露出させます。露出した表面を滅菌PBSで洗浄し、綿棒で残った被毛を優しく拭き取ります。次に、頭蓋骨にマイクロフラクチャーを作成するため、片手でマウスの頭部を固定し、もう一方の手で30ゲージの針を持ちます。

30ゲージの針先を用いて、矢状縫合と冠状縫合の交差付近の前頭骨の一側に、小さな穿刺孔を慎重に作成します。脳を貫通させないよう、より太いゲージの針に切り替え、新しい針を回転させて穿刺孔の直径を約0.5 mmまで広げます。反対側の前頭骨にも同様に2つ目の穿刺孔を作成した後、出血が止まるまで各部位にPBSを滴下しながら拭き取ります。

次に、乾燥を防ぐため、Vidal画像を取得する領域を完全に覆うのに十分な量の滅菌生理食塩水を頭蓋骨上に滴下します。まず、ポリゴンベースのレーザースキャナーを起動し、30 frames per secondのビデオレートで同時マルチチャンネル画像取得を可能にします。次に、マルチフォトニクスイメージング用のフェムト秒チタンサファイアレーザーを起動します。

頭蓋骨の第二高調波発生（SHG）イメージング用に波長を880 nmに設定し、GFPおよびtdTomatoの励起用に440 nmに設定します。次に、491 nmおよび561 nmの固体レーザーを点灯させます。続いて、各信号の光電子増倍管（PMT）検出器をオンにします。フィルターは、第二高調波発生用に435 ± 20 nmのバンドパスフィルターを、GFP用に528 ± 19 nmのバンドパスフィルターを、そしてtdTomato用に590 ± 20 nmのバンドパスフィルターを使用します。その後、37 °Cに設定した電気加熱パッドの上に設置されたXYZ軸電動顕微鏡ステージに動物を配置します。

テープを用いてマウスを固定し、温めた2% Methylcelluloseベースのゲルを頭蓋骨上に一滴滴下します。乾燥を防ぐため、イメージング領域にカバーガラスを載せます。次に、開口数0.9の30倍水浸対物レンズとXY・Z軸コントローラーを用いて、骨からのSHG信号を検出します。

calverの表面を見つけるために、正中矢状縫合と冠状縫合の交差などの重要なランドマークとなる位置を特定し、画像を撮影します。ランドマークのXYおよびZ座標を記録し、SHG信号と蛍光信号をガイドにして損傷部位の探索を続けます。各関心領域が見つかったら、目的の細胞からのSHG信号および蛍光信号を含む最適な焦点面の画像を撮影します。

矢状縫合と冠状縫合の交点までの距離およびXY、Z座標を保存し、次回のイメージングのために正確な位置を定義します。次に、骨折部位の3次元的な細胞および骨構造を収集します。内骨表面から約100 µmの深さまで、およそ2〜5 µmのZスタック間隔で画像を記録してください。

最後に、両方の損傷部位のイメージング後、滅菌生理食塩水を数滴滴下して、頭蓋骨から2%Methylcelluloseゲルを除去します。次に、表面に抗生物質を塗布し、皮膚弁で頭蓋骨を覆い、低アレルゲン性の縫合糸で頭皮を再閉鎖し、動物が十分な意識を取り戻すまで保温リカバリーチャンバー内で保持します。3〜5日後、骨折の治癒過程における細胞変化を追跡するため、生体イメージングの手順を繰り返します。

この代表的な実験では、放射線照射および骨髄置換後のTomato-osteocalcin-GFPマウスの前頭骨に2箇所の微小骨折を作製しました。微小骨折の連続的な3D生体内イメージングにより、骨折部位において2日目にTomato陽性の骨形成幹細胞および前駆細胞の再配置が起こり、5日目にそれらが拡大していることが示されました。この時点ではGFP陽性の骨芽細胞は検出されませんでしたが、12日目には、矢印で示されるように骨折表面付近の骨前駆細胞の一部がTomato陽性かつGFP陽性の骨芽細胞への分化を開始しました。21日目の新しい骨芽細胞の蓄積と新骨形成は、骨形成前駆細胞の遊走と増殖が、骨折治癒のための新しい骨芽細胞を供給する主要なメカニズムであったことを示しています。この手法が骨折治癒過程における骨前駆細胞数の一定かつ定量的な出力を提供するかを確認するため、損傷後14日間にわたりMX1-YFP陽性の骨形成幹細胞および前駆細胞を追跡しました。

少数の前駆細胞が、受傷後3日までに損傷部位で一貫して検出されました。細胞数は7日目に継続的に増加し、10日目に集団のピークに達し、その状態が14日目まで維持されました。骨前駆細胞の生成キネティクスは、YFP信号強度の経時的な測定によって定量化され、生体内顕微鏡観察の結果と相関しました。

前駆細胞はまず3日目に観察され、10日目にピークに達し、14日目まで同様に高い強度を維持しました。この手順を行う際は、熟練した縫合技術を用い、出血を最小限に抑えることで、瘢痕形成を軽減し、背景の自家蛍光を下げることができる点に留意することが重要です。このビデオを視聴することで、骨折修復過程における内因性骨形成幹前駆細胞の遊走、増殖、および分化のイメージングと追跡方法について十分な理解が得られるはずです。