재생 연구를위한 고조파 나노 입자

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한 심장 구슬 클러스터를 3D 실시간 및 높은 공간 해상도로 체외 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 배아 줄기 세포를 배양하고 배아체를 형성할 때까지 확장함으로써 달성됩니다. 다음으로, 박동 클러스터를 해부하고 POLYTETRAFLUOROETHYLENE 또는 PTFE 다공성 필터에 도금하여 장기간 공기로 유지할 수 있습니다.

그런 다음 고동 클러스터는 실시간 다중 광자 현미경을 수행하기 위해 고조파 나노 입자로 라벨링됩니다. 얻은 결과를 통해 미시적 규모에서 심장 수축의 공간 신장과 빈도를 분석할 수 있습니다. 따라서 이러한 나노 입자의 주요 장점은 모든 파장, 특히 적외선을 사용할 수 있으므로 조직 깊숙이 들어갈 수 있고 시간이 지남에 따라 매우 안정적이라는 것입니다.

따라서 우리는 긴 시간 프레임에 걸쳐 긴 프로세스를 모니터링 할 수 있습니다. 이 줄기세포 배양 방법은 심근세포 기능 수축 분야의 주요 질문에 3차원으로 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 심장 성숙 및 조직 공학이 있습니다.

새로운 질병 방법을 사용하는 개인은 고조파 나노 입자를 사용한 라벨링 절차는 다광자 현미경 검사에만 사용할 수 있으며 다른 종류의 이미징 시스템으로 전송할 수 없다는 점을 알고 있어야 합니다. 우리는 2005년에 처음으로 고조파 나노입자를 사용한다는 아이디어를 얻었습니다. 이러한 나노 입자는 형광 염료 및 양자점과 관련하여 이점을 제공합니다.

사실, 그들의 신호는 시간이 지나도 사라지지 않으며 장기간에 걸쳐 개발 중인 샘플을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플 준비의 시각적 시연은 특히 약물 테스트를 수행할 때 여러 단계의 효율성과 재현성에 매우 중요하며 다른 조직이나 질병에도 적용될 수 있습니다. 조직 모델링.

텍스트 프로토콜에 따라 인간 배아 줄기 세포 또는 배아줄기세포를 배양 및 증식시키고 따뜻한 콜라겐 분해 효소로 10분 동안 4개 배양한 후, 2ml의 신선한 분화, 중간 또는 DM으로 콜로니 단편을 수집하고 3분 동안 115배 중력에서 원심분리합니다. 문화, 식민지 파편은 매우 낮은 부착물에 현탁되어 있습니다. 배아 몸체 또는 ebs를 형성할 수 있도록 4일 동안 6개의 웰 플레이트.

그런 다음 새로 형성된 EBS를 0.1% 젤라틴 코팅된 24웰 플레이트에 고동 클러스터가 나타날 때까지 15-30일 동안 플레이트합니다. PBS를 제거하고 acutus를 사용하여 원심분리 및 소생 후 콜로니를 단일 세포로 해리하고 DM 배지 플레이트에 세포를 agro당 2ml씩 현탁시킵니다. 웰 챔버를 만들고 하루 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.

새로 형성된 EBS를 수집하고 배양에서 2-4주 후에 0.1%젤라틴으로 코팅된 24웰 플레이트에 웰당 3개의 플레이트를 만듭니다. 박동하는 심근세포의 클러스터를 식별하고 길쭉하고 날카롭게 자른 페이스트 피펫을 사용하여 수동으로 해부합니다. 인서트당 4개의 PTFE 필터를 배치하고 각각 6개의 웰 플레이트의 웰에 넣습니다.

각각에 1ml의 DM을 첨가한 후 각 PTFE 필터에 하나의 절개된 박동 클러스터를 추가합니다. 클러스터에 레이블을 지정하려면 고동 클러스터가 있는 PTFE 필터를 3.5cm 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 밀리리터당 50마이크로그램에서 1밀리리터의 2차 고조파 생성 나노 입자를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 비선형 광학 이미징을 수행합니다.

라벨링된 HEB 또는 심박 클러스터를 이미징 챔버로 전송한 후 백색광 조명 아래에서 광시야 이미징을 사용하여 차별화된 EBS 또는 활성 박동 클러스터 내에서 관심 구조를 식별합니다. 빠르고 저해상도 3차원 스캔을 수행하여 심장 클러스터의 전체 형태를 재구성하고 실시간으로 모니터링할 여러 개의 가시적인 2차 고조파 생성 나노 입자가 있는 클러스터 볼륨 내의 이미지 평면을 선택합니다. 심장 클러스터 수축은 현미경 광학 스캐너를 가장 빠른 모드로 설정하여 2차원 이미지를 멀티 헤르츠로 획득할 수 있도록 합니다.

박동 활동을 평가하기 전에 여기에 설명된 텍스트 프로토콜에 따라 MATLAB을 사용하여 이미지를 분석합니다. PTFE 필터의 비선형 광학 반응의 특성화는 광자 형광에 대한 노출된 기판이 매우 약하고 관련 생물학적 샘플과 분리로 인한 방출을 측정하는 것을 방해할 수 없도록 하기 위해 수행됩니다. 2차 고조파 생성 나노입자는 epi 검출 모드에서 기판을 통해 이미징하여 쉽게 획득할 수 있습니다.

이 그림에서는 심장 구조와 EBS로 표시된 2차 고조파 세대 나노 입자가 블레이드로 표시됩니다. 빨간색, 노란색 및 녹색은 NADH 자가형광에 해당하며, 강렬한 파란색 2차 고조파 반점은 고립된 2차 고조파 생성 나노 입자에서 비롯됩니다. 양호한 광학 대비와 상대적으로 희박한 라벨링이 양자점 또는 상향 변환 나노입자와 비교된다는 점에 주목하십시오.

이 그림은 심장 박동 클러스터라고 표시된 두 번째 고조파 세대 나노 입자의 슬라이스 보기를 보여줍니다. 이 동영상에서 볼 수 있듯이 3D 구조는 두 번째 셀의 수축 패턴을 모니터링하기 위해 고속으로 기록됩니다. 고조파 생성 나노 입자가 응집되어 NP 모션을 분해하기 위한 높은 획득 속도를 유지합니다.

전체 획득 감도는 2차 고조파 생성에서 2차 고조파 방출로 세포 자가형광을 기록하기에 충분하지 않았습니다. 영화 프레임에서 수행된 나노 입자 이미지 분석은 동일한 심장 클러스터 내에서 변위가 수 마이크로미터 정도이며 주파수는 일반 2차 고조파 생성 나노 입자 운동의 안팎에 대해 일정하다는 것을 나타냅니다. 세포 준비 기술을 마스터하면 베팅 클러스터, 해부, 공기, 액체 배양 및 새끼 양치기는 적절하게 수행되면 24-36 시간 내에 완료 할 수 있습니다.

특히 이 기술에서는 오염을 방지하기 위해 개방된 공기 접촉을 피해야 합니다. 이 절차에 따라 3차원에서 활동 전위 프로파일과 박동 주파수의 상관 관계와 같은 추가 질문에 답하기 위해 여러 전극 어레이를 사용하는 전기 생리학적 기록과 같은 다른 방법을 적용할 수 있습니다. 고조파 나노 입자에 의한 비선형 신호 검출을 기반으로 하는 당사의 새로운 기술은 생체 내 연구를 위해 더욱 개발될 수 있으며, 이미징에 사용되는 파장을 감염시켜 조직에 더 깊은 침투를 가능하게 합니다.

한 가지 가능한 개발은 재생 의학 응용을 위한 줄기세포 유래 구조의 통합을 따르는 것일 수 있습니다.