Name: 재생 연구를위한 고조파 나노 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 고조파 나노입자를 이용한 인간 배아줄기세포 심장 박동 클러스터의 실시간 다광자 현미경 모니터링 방법을. 이 기술은 3D 고해상도 심장 수축 분석과 줄기세포 기반 심장 재생 연구에 활용됩니다.

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저자는 유럽 FP7 연구 프로젝트 NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) 및 INTERREG IV 프랑스 - 스위스 NAOMI 프로젝트에서 일부 자금을 인정하고 싶습니다.

1. 문화와 인간 ESC의 확장 <ol><li> 준비 녹아웃 DMEM을 함유하는 (PM이라고 함) 세포 증식 배지는 20 % 녹아웃 혈청, 1 % MEM 비 필수 아미노산, 1 % L-글루타민 200 mM의 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올이 보충. </li><li> 8 ML의 PM 매체에서 인간의 ESC (hESC의)를 해동 및 DMSO 첨가 된 동결 매체를 폐기 115 XG에서 그들에게 5 분 원심 분리기. </li><li> (만 24 시간 배양)를 해동시 세포 사멸을 방지하고 세포 생존을 개선하기 위해 10 mM의 바위 억제제를 포함하는 PM 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 능성의 유지에 필요한 농도 (4-10 NG / ㎖)에서 PM에 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)를 추가한다. </li><li> 이전 / ㎠ 2 × 10 4 세포의 농도로 도금 피더 세포 포피 조사 인간의 hESC의 (γHFF) (그림 1A)를, 플레이트. </li><li> 필요한 경우 C의 일부를 제거, 중간 매일 변경olonies는 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인 차별화하기 시작했다. </li><li> 효소 주 통로 식민지 번 : <ol><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어. </li><li> 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 PM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다. </li></ol></li><li> 또한, 식민지 긁어 기계적으로 계대 할 수 있습니다 <ol><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> 수동 StemPro EZPassage 롤러 긁는 도구 (그림 1B)를 사용하여 식민지를 다 쳤어요. </li><li> 식민지 조각을 수집하고 뜨는을 제거하기 위해 115 XG에서 3 분 동안 원심 분리 한 후. </li><li> γHFF 또는 플레이트 조각은 배아 체 (교환 사채)로 차별화를 처리합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인간의 ESC 차별화프로토콜 <ol><li> 준비 녹아웃 DMEM을 사용하여 차별화 매체 (DM)는 2 % HyClone 사 혈청, 1.0 % MEM 비 필수 아미노산, 1.0 %의 L-글루타민 200 밀리미터, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올과 보충. </li><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성 : <ol><li> PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어. </li><li> 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 DM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다. </li><li> 사일 (그림 1C) 용 초저 첨부 6 - 웰 플레이트 (물론 당 2 ㎖) 현탁액 문화를. </li><li> 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 /도) (그림 1D)에 새로 설립하는 교환 사채를 접시. </li></ol></li><li> 또한, Aggrewell 판을 사용하여 사채로 단일 세포의 집계를 강제 : <ol><li> 제거 PBS와accutase (0.5 ㎖ /도)를 사용하여 단일 세포로 식민지를 떼어 놓다. </li><li> 1.2 × 10 6 / ㎖에서 DM의 원심 분리기와에 resuspend 세포. </li><li> 일일 (그림 1B &#39;)에 대한 Aggrewell 챔버 당 2 ML을 추가합니다. </li><li> 새로 형성된 사채 (그림 1C &#39;)를 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 / 웰)에 그들을 접시. </li><li> 심근 (15-30 일)가 클러스터를 상회의 모양까지 2-3 일마다 DM을 변경합니다. </li></ol></li></ol> HNPs와 클러스터 및 라벨링 잔 3. 공기 - 액체 3D 문화 <ol><li> 확인하고 수동으로 일반적으로 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 2 ~ 4 주 후에 나타나는 치는 심근 (그림 1D)의 클러스터를 해부하다. </li><li> 6 잘 플레이트 (그림 1 층)에 배치됩니다 삽입 당 보증금 4 PTFE 필터. </li><li> EAC의 상단에 DM 매체의 1 ML을 추가합니다시간 잘. </li><li> 각 PTFE 필터 (그림 1E)에 하나의 해부 치고 클러스터, 최대 4/well, 플레이트 (그림 1 층 &#39;) 당 즉, 24 집계를 추가합니다. </li><li> 2-3 일마다 DM 매체를 변경합니다. </li><li> 클러스터 레이블을 지정하려면 (170 μm의 두께) 박동 클러스터를 포함하는 PTFE 필터를 제거하고 3.5 cm의 유리 바닥 접시에 넣어. </li><li> 30 분 동안 50 ㎍ / ml의 농도로 HNP 1 ㎖를 추가. </li></ol> 4. 비선형 광학 이미징 <ol><li> 샘플 준비. HNP 라벨 (단계 3.6 참조)를 사용하여 높은 개구 목표의 작동 거리와 호환되는 170 μm의 두께 유리 바닥 접시 위에 PTFE 필터에 전체 분화 초기 HEBS 또는 (수축 모양에 따라 절개) 심장 박동 클러스터 중 하나를 전송 한 후. 또한, 유리 바닥 접시 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅에 클러스터를 상회의 직접 코팅을 적용합니다. </li><li> 로 전송 샘플올인원 안정 온도, 습도 및 시간의 연장 기간 동안 CO 2 제어를 보장하는 실을 배양 장착 현미경. </li><li> 초기 검사, 이미지 후 백색광 조명 아래 넓은 필드 영상을 통해 샘플은 추가 조사를 위해 선택됩니다 차별화 된 사채 또는 활성 박동 클러스터 내에서 그 구조를 식별합니다. </li><li> 세포 NADH의 형광도 및 HNPs에서 SH 동시에 취득 할 수있는 경우, 분자 흡수에 맞게 짧은 레이저 여기 파장 (즉, 720 nm의)을 설정합니다. 반 여기 파장에 중심 한 협 대역 통과 스펙트럼 필터 사용 (즉, λ = 360 ± 10 ㎚) SH를 검출하고, 또 다른 하나는 형광도를 검출하도록. </li><li> 첫째 심장 클러스터의 전체 형태를 재건하고 여러 가지 볼 수 HNP와 클러스터 볼륨 내에서 이미지 평면을 선택하는 빠르고, 낮은 해상도, 입체 검사를 수행의. </li><li> 필요한 경우 유용한 샘플의 광학 특성을 일치하도록 자유롭게 여기 파장을 변경하거나 IR 파장 (즉, 790 nm 정도)을 가진 조직을 깊은 광표백, 사진 손상 및 화상에 않도록하고 (즉, 395 nm의 따라서 제 고조파 필터 교체 ). 샘플에 증착 HNPs의 제 고조파 신호를 최대화함으로써 선택의 작동 파장에서 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화. </li><li> 실시간으로 심장 클러스터의 수축을 모니터링 두 가지 차원 영상의 고속 획득을 허용, 같은 공진 모드와 빠른 모드에서 현미경 광학 스캐너를 설정합니다. </li><li> 같은 이미지의 대비와 수집 속도 사이의 최고의 타협으로 설정을 선택합니다 : <ul type="disc"><li> 스캔 평균 : 4 </li><li> 픽셀 체류 시간 : 0.1 마이크로 초 </li><li> 이미지 속도 : 초당 4,125 프레임 (fps) </li></ul></li><li> 레이저 파워는 초점 스팟의에 따라 조정이지는 스캔 속도. (목적의 입구에서 측정) 50 mW의 0.1 마이크로 초 화소의 정지 시간 및 세포 생존 능력을 보존 계획 APO 20X NA 825 목적의 전형적인 값입니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 축 보정 절차. 베어 기판에 증착 된 단일 HNP를 선택합니다. SH 강도를 극대화 (나노 입자의 축 방향 위치, 즉) 초점을 조정합니다. HNP의 함수로서 SH 강도 관한 검량선을 얻었다 현미경 스테이지의 축 방향 위치는 초점 평면으로부터 오프셋 제어 된 방식으로 변화한다. 계획 APO 20X NA 825 목적이 보정 절차의 출력은 그림 (c)에보고됩니다. </li><li> 모든 비디오 프레임에 존재 HNPs를 선택하고 자신의주기적인 움직임을 결정한다. 이 절차는 쉽게 그 정의 된 영역에서 최대 신호 강도 반점을 추구하는 사용자 지정 코드로 예를 들어, 자동화 할 수 있습니다다른 프레임 사이를 연결 (이미지 처리 도구 상자의 &#39;지역의 소품&#39;기능을 사용하여 B를 Matlab을 R2009로 작성된 예제 코드은 제공됩니다). </li><li> 비 연속적 추적 HNPs 단계 5.1에서 확립 검량선을 이용하여 축 방향 변위로 다른 프레임에 걸쳐 자신의 강도 변조를 변환함으로써, 광축을 따라 이동과 연관된 면외 변위의 정량 평가. 이 절차는 축 방향의 움직임에 대한 액세스를 제공하지만, 절대적인 방향 (위 또는 아래)를 결정하는데 이용 될 수 없습니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

줄기 세포 연구에 나노 기술의 응용 프로그램은 비교적 새로운하지만 빠르게 확장 필드입니다. 주제에 대한 다양한 리뷰 기사에서 지적한 바와 같이, 나노 입자의 사용은 적어도 창조의 단백질 및 유전자의 세포 내 전달에, (시험 관내 및 생체 내에서 모두) 추적 세포에 이르기까지 다양한 연구 작업을 수행하기 위해 적용 할 수있는 특정 분화 우선 자극 / 억제를위한 생체 모방 세포 환경은 19, 20를 경로. 적외선 음원의 사용 가능성을, 형광 기반 기술에 대하여 증가 된 투과 깊이에 이르게되지만이 프로토콜에서 설명한 방법은, 광 추적 및 제한된다; 광학 영상은 몸 전체로 확장 될 수 없으므로 자기 검출부 (21)에 의해 보완 될 것이다. 이전 출판 작업은 몇 가지 방법이있는, 심장 세포 클러스터의 구조와 움직임을 평가했다형광 염료 (22), 양자 점 (23, 24)에 의해 cluding에 라벨은 슈퍼 성체의 산화철 나노...

비선형 현미경 시스템은 고유의 입체 단면 처리 능력 덕분에, 점점 근적외선의 이광자 흡수 밴드를 가진 광 안정 형광체에 대한 수요를 유발 하였다. 단지 지난 몇 년에, 형광 기반의 라벨 (염료, 양자 점, 최대 변환 나노 입자), 다른 이미징 방법은 레이블과 같은 본질적으로 비선형 나노 입자의 새로운 가족의 사용을 악용 한, 즉 개발을 보완하는 특히 다 광자 현미경을 위해 개발 된 고조파 나노 입자 (HNPs). 무기 noncentrosymmetric 결정에 따라 이러한 레이블은 여기 주파수의 SH를 생성 광학 대비를 발휘 : 근적외선 펄스 여기 빛의 일부를 변환하여 예를 볼 푸른 빛으로 (λ = 800 nm의) (λ / 2 = 400 nm의) . 최근 과거에 여러 저자는 철 요오드 철 (IO를 포함하여, 다른 재료를 테스트 한 <suB&gt; 3) 3 일, 칼륨 니오 베이트 (KNbO 3)이, 니오브 산 리튬 (의 LiNbO3) 3, 티탄산 바륨 (BaTiO3를) 4,5, 칼륨 티 타닐 포스페이트 (KTiOPO4, KTP) 6-8, 및 산화 아연 (ZnO의 ) 5,9,10. 형광 프로브에 비해 HNPs는 완전한 표백의 부재 점멸, 좁은 발광 밴드 (적외선하는 자외선에서) 여기 파장 조정 기능, 방향 검색 기능 및 일관성있는 광학 응답으로 매력적인 특성의 시리즈를 가지고있다. 이러한 독특한 특성은 최근 두 가지 종합적인 검토 논문 11, 12에 설명되어있다. 또한, 산란 및 흡수를 최소화하여 영상의 깊이를 증가 적외선 스펙트럼 영역에서 작업의 가능성이 크게 샘플 사진 저하 (13, 14)을 제한한다. 또한, HNPs 보장 무한 사진 안정 신호는 장기 세포 추적하기에 적합한 프로브를 만드는 전특히 재생 의학 응용 프로그램을 15 호소이야. 이 시각 실험에서, 프로토콜 세부 사항은 작용 화 HNPs으로 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 콜로이드 현탁액의 합성 및 제조는 이전 책에서 및 참조 거기에 16에서 설명하고이 범위에있다. (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터에 다 광자 현미경과 분화에 의해 hESC의 조사에 대한 방법론이 제시된다. 인간의 ESC 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성하거나 그림 1A에 도시 된 바와 같이, 대안, Aggrewell 판을 사용하여 사채에 단일 세포의 응집을 강제하거나 두 가지 방법으로 소위 배아 체 (교환 사채) 내에서 차별화 할 수 있도록 할 수 있습니다 . 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 심장 세포의 클러스터를 치고 배양 (PTFE) 다공성 필터 FAC추가 연구 (활동 전위의 예를 들어 전기 생리학 측정)에 대한 자신의 장기적인 유지 관리를 ilitates. 주사 현미경의 여진 원은 HNPs의 차 고조파 이미징을 수행하기 위해 필요한 최대 전력에 도달하기 위해 (샘플에서 300 FSEC보다 작은 펄스 시간) 초단 펄스를 제공 할 수 있어야한다. 예를 들어, 이미징에 사용되는 가장 일반적인 FSEC 소스는 가변 티 아르 : 사파이어 레이저. 사파이어 펌핑 적외선 광 파라 메트릭 발진기 : 또는 다른 초고속 레이저는 인스턴스 에르븀 이온 17, 크롬 포스 테 라이트 (18) 또는 티를 위해, 이용 될 수있다. 현미경은 바람직 다소 높은 개구 수 대물 탑재 될 수있다. 아주 중요한 것은, 앞서 측정 한 목적이 대체 될 때마다, 그것은이 운동에 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화하여 셋업 (렌즈)의 분산액의 존재를 최소화하기 위해 필수선택의 파장. 프로토콜에 설명이 절차는, 레이저 펄스가 초점면에서 한정된 지속 기간을 변형 (즉, 최단 등)에 최대한 가깝게하고 샘플 비선형 응답을 최대화하는 것을 보장한다. 프로토콜의 끝 부분에 설명 된 이미지 분석의 목적은 파악하고 심장 클러스터를 상회의 리듬 수축과 관련된 3D HNPs의 움직임에 추적 할 수 있습니다. 이미지면에서 추적 나노 입자는 단순히 연속 동영상 프레임에서 자신의 위치를​​ 파악하여 실현된다. 축 방향 이동에 대한 정보를 추출하기 위해, 축 방향 변위의 함수로서 비선형 강도 응답의 사전 보정이 필수적이다. 장기 측정 샘플 축 위치의 활성 간섭계 컨트롤을주지는 열 및 / 또는 기계적 감도의 존재 검량선의 유효성을 유지하는 것이 요구된다. TRAC에 여기에 사용 HNPs집합 내의 전자 박동 세포는 니오븀 산 칼륨 산화물 (KNbO 3)을 기반으로하지만, 다른 가능한 비선형 나노 물질은 Staedler 등 (16)의 작품에서 자세히 검토하고 있습니다. 지금까지 조사 된 나노 물질의 대부분의 비선형 광학 효율이 매우 비교할 수 있습니다. KNbO 3의 선택은 본질적으로 콜로이드 용액의 좋은 안정성과도 상당히 높은 농도와 긴 박람회 16 배에서 몇 사람의 세포주의 좋은 생체 적합성에 의해 좌우되었다. 이 작업에 사용되는 나노 물질의 새로운 감안할 때, 형광 / 발광 바이오 마커에 비해 HNPs의 주요 특성은 저자에 의해 실현 짧은 원래 컴퓨터 비디오 애니메이션에 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>현미경 인큐베이터</td><td>OKO LAB</td><td>UNO 패키지(상단 스테이지)</td><td>37 &deg; C, 5% CO2, 보습</td></tr><tr><td>다광자 현미경</td><td>Nikon</td><td>AR1-MP</td><td></td></tr><tr><td>빠른 스캐닝, 네 개의 비광증전자 디스캔 검출기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 SHG 및 자가형광</td><td>Semrock</td><td>FF01-360/12-25</td><td></td></tr><tr><td>FF01-395/11-25&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FF02-485/20-25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td><td></td><td>NA 0.30, WD 16mm</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo 20X</td><td></td><td></td><td>NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td></tr><tr><td>CFI Apo 40X</td><td></td><td></td><td>NA 1.25, WD 0.18 mm &lambda; S, 나노 크리스탈 코트</td></tr><tr><td>Rhock 억제제&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 세럼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1140</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로젠</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>롤러 스크레이퍼 도구&nbsp;</td><td>StemPro EZPassage, Invitrogen</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>S11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 시스템&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 세럼&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트&nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터</td><td>Millipore</td><td>NA76/25</td><td></td></tr><tr><td>인서트</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

이 시각 실험에서, 프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자 (HNPs)와 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 후자는 최근 다중 광자 이미징을위한 생체 시료 라벨 도입 프로브의 새로운 가족입니다. HNPs는 여기 파장에 아무런 제한이 제 고조파 발생의 비선형 광학적 프로세스에 의해 여기 광의 주파수를 두배로 할 수있다. 다 광자 (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터로 hESC의 차별화를위한 방법론을 기반으로 상세하게 제공됩니다. 특히, 3D로 심장 조직을 구타의 3D 모니터링 동안 고립 HNPs의 강렬한 두 번째 고조파 (SH) 배출을 극대화하는 방법에 대한 증거가 표시됩니다. 3D 변위 패턴을 검색 결과 이​​미지의 분석은 또한 상술된다.

이전 촛점 촬상함에 고해 활성을 평가하기에, PTFE 필터의 비선형 광학 응답의 신중한 특성화 고농도 (1 ㎎ / ㎖)에서 단독으로 또는 HNPs의 존재 하에서도 수행 하였다. ⅰ) 상기 베어 기판 이광자 여기 형광이 미약하며 관련 생물학적 시료 측정을 방지 할 수 있고, ⅱ) 절연 HNPs로부터 SH 방출 쉽게 에피 검출 모드에서 상기 기판을 촬상하여 취득 할 수있다 : 그것은 것이 보장되었다 (그림 2). 목표는 3 차원 변위의 정량화에 대한 참조 컨트롤을하는 것이 었습니다. 그림 3에서, HNP-표지 심장 구조와 교환 사채가 표시됩니다. 강렬한 푸른 SH 명소 격리 HNP에서 줄기 동안 빨강 (그림 3A), 노란색 (그림 3B 및 3C) 및 녹색 (그림 3D) 색상, NADH의 형광도에 해당합니다. 그것은 포...

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

다음 실험의 전반적인 목적은 인간 배아줄기세포 유래 심장 박동 클러스터를 3D 실시간 및 고해상도 공간 분해능으로 체외 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 배아줄기세포를 배양 및 확장하여 배아체(Embryoid bodies)를 형성함으로써 이루어집니다. 그다음, 박동하는 클러스터를 분리하여 폴리테트라플루오로에틸렌(POLYTETRAFLUOROETHYLENE) 또는 PTFE 다공성 필터 위에 도말하며, 이를 통해 장기간 공기 중에 유지할 수 있습니다.그 후 액체 배양 중인 박동 클러스터를 조화 나노입자로 표지하여 실시간 다광자 현미경 관찰을 수행합니다. 얻어진 결과는 미시적 규모에서 심장 수축의 공간적 신장과 빈도 분석을 가능하게 합니다. 따라서 이러한 나노입자의 주요 장점은 모든 파장, 특히 적외선을 사용할 수 있어 조직 더 깊은 곳까지 관찰이 가능하며 시간 경과에 따라 매우 안정적이라는 점입니다.따라서 장기간에 걸쳐 진행되는 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 이러한 줄기세포 배양 방법은 3차원적으로 일어나는 심근세포의 기능적 수축 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 심장 성숙과 조직 공학 분야가 이에 해당합니다.새로운 질병 분석법을 사용하는 연구자들은 하모닉 나노입자를 이용한 라벨링 절차가 다광자 현미경에만 적용 가능하며, 다른 종류의 이미징 시스템에는 전이될 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 당사는 2005년에 하모닉 나노입자를 사용하는 아이디어를 처음 고안하였습니다. 이러한 나노입자는 형광 염료 및 양자점과 비교하여 여러 가지 장점을 제공합니다.실제로 이들의 신호는 시간이 지나도 사라지지 않으므로, 장기간에 걸쳐 발달 중인 샘플을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 약물 테스트를 수행할 때, 샘플 준비 과정을 시각적으로 시연하는 것은 각 단계의 효율성과 재현성을 위해 매우 중요하며, 이는 다양한 조직이나 질환의 조직 모델링에도 적용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 인간 배아줄기세포(ESCs)를 배양 및 증식시킨 후, 따뜻한 collagenase four와 함께 10분 동안 배양하고, 2 mL의 신선한 분화 배지(DM)로 콜로니 조각들을 수집하여 115 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 콜로니 조각들을 초저부착(ultra low attachment) 6-웰 플레이트에 부유 상태로 4일 동안 배양하여 배아체(ebs)를 형성하도록 합니다.그 다음, 새로 형성된 EBS를 0.1% 젤라틴이 코팅된 24-웰 플레이트에 도말하고 박동하는 클러스터가 나타날 때까지 15~30일 동안 배양합니다. PBS를 제거하고 acutus를 사용하여 콜로니를 단일 세포로 해리한 후, 원심분리하여 DM 배지에 다시 현탁합니다. 각 웰 챔버당 2 mL씩 분주하고 37 °C에서 하루 동안 배양합니다.배양 후 2~4주가 지나면 새로 형성된 EBS를 수집하고, 0.1% 젤라틴이 코팅된 24-well 플레이트의 well당 3개씩 플레이팅합니다. 박동하는 심근세포 군집을 확인하고, 끝을 길고 날카롭게 자른 페이스트 피펫을 사용하여 이를 수동으로 박리합니다. 인서트당 4개의 PTFE 필터를 배치하고, 각각을 6-well 플레이트의 well에 넣습니다.각각에 1 mL의 DM을 넣은 후, 적출된 박동성 클러스터를 각 PTFE 필터 위에 하나씩 올립니다. 클러스터를 표지하기 위해, 박동성 클러스터가 있는 PTFE 필터를 3.5 cm 유리 바닥 배양 접시로 옮깁니다. 50 µg/mL 농도의 제2고조파 생성(second harmonic generation) 나노입자 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양하여 비선형 광학 이미징을 수행합니다.표지된 HEB 또는 심장 박동 클러스터를 이미징 챔버로 옮긴 후, 백색광 조명 하에서 광시야 이미징을 사용하여 분화된 EB 또는 활성 박동 클러스터 내에서 관심 구조를 식별합니다. 빠르게 저해상도 3차원 스캔을 수행하여 심장 클러스터의 전체적인 형태를 재구성하고, 실시간으로 관찰할 수 있도록 여러 개의 제2고조파 생성 나노입자가 보이는 클러스터 부피 내의 이미지 평면을 선택합니다. 심장 클러스터의 수축 속도에 맞춰 현미경 광학 스캐너를 가장 빠른 모드로 설정하여, 2차원 이미지를 수 헤르츠(multi hertz) 속도로 획득합니다.박동 활성을 평가하기 전, 여기에서 시연된 텍스트 프로토콜에 따라 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하십시오. PTFE 필터의 비선형 광학 반응 특성 분석을 수행하여, 베어 기판의 광자 형광이 매우 약하며 관련 생물학적 샘플의 측정 및 분리된 제2 고조파 생성 나노입자의 방출 획득을 방해하지 않는지 확인합니다. 기판을 통한 에피 검출 모드 이미징을 통해 이를 쉽게 획득할 수 있습니다.이 그림에서는 제2고조파 생성 나노입자로 표지된 심장 구조와 EBS가 표시되어 있습니다. 빨간색, 노란색, 초록색은 NADH 자가형광에 해당하며, 강한 파란색 제2고조파 반점은 분리된 제2고조파 생성 나노입자에서 기인합니다. 양자점이나 상향변환 나노입자와 비교했을 때 우수한 광학적 대비와 상대적으로 희소한 표지 상태에 주목하십시오.이 그림은 제2고조파 발생 나노입자로 표지된 심장 박동 클러스터의 슬라이스 뷰를 보여줍니다. 이 영상에서 보는 바와 같이, 두 번째 세포의 수축 패턴을 모니터링하기 위해 3D 구조가 고속으로 기록되었습니다. 제2고조파 발생 나노입자는 나노입자의 움직임을 분해하기 위한 높은 획득 속도를 유지하기 위해 응집됩니다.전체적인 획득 감도는 제2조화 생성(second harmonic generation)으로 인한 제2조화 방출의 세포 자가형광을 기록하기에 충분하지 않았습니다. 동영상 프레임을 통해 수행한 나노입자 이미지 분석 결과, 동일한 심장 클러스터 내의 변위는 수 마이크로미터 수준이며, 평면 내 및 평면 외 제2조화 생성 나노입자 운동의 빈도는 일정함을 나타냅니다. 세포 준비 기술을 숙달하면, 적절히 수행될 경우 베타 클러스터 절제, 공기-액체 배양 및 램빙(lambing) 작업을 24~36시간 이내에 완료할 수 있습니다.특히 이 기술에서는 오염을 방지하기 위해 외부 공기와의 접촉을 피해야 합니다. 이 절차 이후에는 3차원 상에서 활동 전위 프로파일과 박동 빈도의 상관관계와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다중 전극 어레이를 이용한 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법을 적용할 수 있습니다. 고조파 나노입자에 의한 비선형 신호 검출을 기반으로 한 당사의 새로운 기술은 생체 내(in vivo) 연구를 위해 더욱 발전시킬 수 있으며, 영상 촬영에 사용되는 파장이 조직 내 더 깊은 침투를 가능하게 하기 때문입니다.가능한 발전 방향 중 하나는 재생 의학 응용을 위해 줄기세포 유래 구조체의 통합 과정을 추적하는 것입니다.

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Plasmonic 핀셋 및 광자 크리스탈 nanostructures는 광학 트래핑 마이크로 및 나노 입자의 효율성과 방향 제어에 유용 향상을 생산하기 위해 표시됩니다.

향상된 마이크로 및 Nanoparticle 조작에 대한 Plasmonic 및 광자 크리스탈 Nanostructures 활용

nanohelical 구조의 정확한 모델링은 새로운 나노 기술의 응용으로 이어지는 예측 시뮬레이션 연구에 중요하다. 현재 소프트웨어 패키지와 코드는 원자의 나선형 모델을 만드는 데 제한됩니다. 우리는 시뮬레이션 원자의 nanohelical 모델을 만들 수 있도록 설계 두 가지 절차를 제시하고, 그래픽 인터페이스는 시각화를 통해 연구를 강화하기 위해.

예측 연구 확장 Nanohelices 향상된 3D 시각화

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

이 프로토콜은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 사용하여 신경 세포의 분화 및 세포 내 칼슘 활성을 자극하는 방법을 설명합니다. 이러한 결과는 잠재적으로 신경 보철물 및 신경 과학의 기초 연구에 대한 새로운 응용 분야를 열 수 있습니다.

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

이 프로토콜은 언 바운드 입자의 효율적인 고갈과 마이크로 / 나노 입자 설계 세포를 정화하는 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략의 사용을 설명합니다.

간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

여기에 제시된 자기 조립을 통한 산화철 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)의 제조를 위한 프로토콜이 제시되어, 자기 고열증 및 광열 병용 암 치료를 위한 하나의 나노치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 낼 수 있다.

자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

여기에서는 시험관 내에서 Schwann 세포를 자극하기 위해 나노초 펄스 전기장(nsPEF)을 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 관련 인자의 합성 및 분비 능력과 세포 거동 변화는 nsPEF를 사용하여 성공적인 자극을 검증했습니다. 이 연구는 말초 신경 재생 방법에 대한 긍정적인 견해를 제공합니다.

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro(체외 말초 신경 재생을 위한 나노초 펄스 전기장에 의한 Schwann 세포 성장 조절)

학습하세요 고조파 나노입자를 이용한 인간 배아줄기세포 심장 박동 클러스터의 실시간 다광자 현미경 모니터링 방법을. 이 기술은 3D 고해상도 심장 수축 분석과 줄기세포 기반 심장 재생 연구에 활용됩니다.

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

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