재생 연구를위한 고조파 나노 입자

다음 실험의 전반적인 목적은 인간 배아줄기세포 유래 심장 박동 클러스터를 3D 실시간 및 고해상도 공간 분해능으로 체외 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 배아줄기세포를 배양 및 확장하여 배아체(Embryoid bodies)를 형성함으로써 이루어집니다. 그다음, 박동하는 클러스터를 분리하여 폴리테트라플루오로에틸렌(POLYTETRAFLUOROETHYLENE) 또는 PTFE 다공성 필터 위에 도말하며, 이를 통해 장기간 공기 중에 유지할 수 있습니다.

그 후 액체 배양 중인 박동 클러스터를 조화 나노입자로 표지하여 실시간 다광자 현미경 관찰을 수행합니다. 얻어진 결과는 미시적 규모에서 심장 수축의 공간적 신장과 빈도 분석을 가능하게 합니다. 따라서 이러한 나노입자의 주요 장점은 모든 파장, 특히 적외선을 사용할 수 있어 조직 더 깊은 곳까지 관찰이 가능하며 시간 경과에 따라 매우 안정적이라는 점입니다.

따라서 장기간에 걸쳐 진행되는 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 이러한 줄기세포 배양 방법은 3차원적으로 일어나는 심근세포의 기능적 수축 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 심장 성숙과 조직 공학 분야가 이에 해당합니다.

새로운 질병 분석법을 사용하는 연구자들은 하모닉 나노입자를 이용한 라벨링 절차가 다광자 현미경에만 적용 가능하며, 다른 종류의 이미징 시스템에는 전이될 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 당사는 2005년에 하모닉 나노입자를 사용하는 아이디어를 처음 고안하였습니다. 이러한 나노입자는 형광 염료 및 양자점과 비교하여 여러 가지 장점을 제공합니다.

실제로 이들의 신호는 시간이 지나도 사라지지 않으므로, 장기간에 걸쳐 발달 중인 샘플을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 약물 테스트를 수행할 때, 샘플 준비 과정을 시각적으로 시연하는 것은 각 단계의 효율성과 재현성을 위해 매우 중요하며, 이는 다양한 조직이나 질환의 조직 모델링에도 적용될 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 인간 배아줄기세포(ESCs)를 배양 및 증식시킨 후, 따뜻한 collagenase four와 함께 10분 동안 배양하고, 2 mL의 신선한 분화 배지(DM)로 콜로니 조각들을 수집하여 115 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 콜로니 조각들을 초저부착(ultra low attachment) 6-웰 플레이트에 부유 상태로 4일 동안 배양하여 배아체(ebs)를 형성하도록 합니다.

그 다음, 새로 형성된 EBS를 0.1% 젤라틴이 코팅된 24-웰 플레이트에 도말하고 박동하는 클러스터가 나타날 때까지 15~30일 동안 배양합니다. PBS를 제거하고 acutus를 사용하여 콜로니를 단일 세포로 해리한 후, 원심분리하여 DM 배지에 다시 현탁합니다. 각 웰 챔버당 2 mL씩 분주하고 37 °C에서 하루 동안 배양합니다.

배양 후 2~4주가 지나면 새로 형성된 EBS를 수집하고, 0.1% 젤라틴이 코팅된 24-well 플레이트의 well당 3개씩 플레이팅합니다. 박동하는 심근세포 군집을 확인하고, 끝을 길고 날카롭게 자른 페이스트 피펫을 사용하여 이를 수동으로 박리합니다. 인서트당 4개의 PTFE 필터를 배치하고, 각각을 6-well 플레이트의 well에 넣습니다.

각각에 1 mL의 DM을 넣은 후, 적출된 박동성 클러스터를 각 PTFE 필터 위에 하나씩 올립니다. 클러스터를 표지하기 위해, 박동성 클러스터가 있는 PTFE 필터를 3.5 cm 유리 바닥 배양 접시로 옮깁니다. 50 µg/mL 농도의 제2고조파 생성(second harmonic generation) 나노입자 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양하여 비선형 광학 이미징을 수행합니다.

표지된 HEB 또는 심장 박동 클러스터를 이미징 챔버로 옮긴 후, 백색광 조명 하에서 광시야 이미징을 사용하여 분화된 EB 또는 활성 박동 클러스터 내에서 관심 구조를 식별합니다. 빠르게 저해상도 3차원 스캔을 수행하여 심장 클러스터의 전체적인 형태를 재구성하고, 실시간으로 관찰할 수 있도록 여러 개의 제2고조파 생성 나노입자가 보이는 클러스터 부피 내의 이미지 평면을 선택합니다. 심장 클러스터의 수축 속도에 맞춰 현미경 광학 스캐너를 가장 빠른 모드로 설정하여, 2차원 이미지를 수 헤르츠(multi hertz) 속도로 획득합니다.

박동 활성을 평가하기 전, 여기에서 시연된 텍스트 프로토콜에 따라 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하십시오. PTFE 필터의 비선형 광학 반응 특성 분석을 수행하여, 베어 기판의 광자 형광이 매우 약하며 관련 생물학적 샘플의 측정 및 분리된 제2 고조파 생성 나노입자의 방출 획득을 방해하지 않는지 확인합니다. 기판을 통한 에피 검출 모드 이미징을 통해 이를 쉽게 획득할 수 있습니다.

이 그림에서는 제2고조파 생성 나노입자로 표지된 심장 구조와 EBS가 표시되어 있습니다. 빨간색, 노란색, 초록색은 NADH 자가형광에 해당하며, 강한 파란색 제2고조파 반점은 분리된 제2고조파 생성 나노입자에서 기인합니다. 양자점이나 상향변환 나노입자와 비교했을 때 우수한 광학적 대비와 상대적으로 희소한 표지 상태에 주목하십시오.

이 그림은 제2고조파 발생 나노입자로 표지된 심장 박동 클러스터의 슬라이스 뷰를 보여줍니다. 이 영상에서 보는 바와 같이, 두 번째 세포의 수축 패턴을 모니터링하기 위해 3D 구조가 고속으로 기록되었습니다. 제2고조파 발생 나노입자는 나노입자의 움직임을 분해하기 위한 높은 획득 속도를 유지하기 위해 응집됩니다.

전체적인 획득 감도는 제2조화 생성(second harmonic generation)으로 인한 제2조화 방출의 세포 자가형광을 기록하기에 충분하지 않았습니다. 동영상 프레임을 통해 수행한 나노입자 이미지 분석 결과, 동일한 심장 클러스터 내의 변위는 수 마이크로미터 수준이며, 평면 내 및 평면 외 제2조화 생성 나노입자 운동의 빈도는 일정함을 나타냅니다. 세포 준비 기술을 숙달하면, 적절히 수행될 경우 베타 클러스터 절제, 공기-액체 배양 및 램빙(lambing) 작업을 24~36시간 이내에 완료할 수 있습니다.

특히 이 기술에서는 오염을 방지하기 위해 외부 공기와의 접촉을 피해야 합니다. 이 절차 이후에는 3차원 상에서 활동 전위 프로파일과 박동 빈도의 상관관계와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다중 전극 어레이를 이용한 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법을 적용할 수 있습니다. 고조파 나노입자에 의한 비선형 신호 검출을 기반으로 한 당사의 새로운 기술은 생체 내(in vivo) 연구를 위해 더욱 발전시킬 수 있으며, 영상 촬영에 사용되는 파장이 조직 내 더 깊은 침투를 가능하게 하기 때문입니다.

가능한 발전 방향 중 하나는 재생 의학 응용을 위해 줄기세포 유래 구조체의 통합 과정을 추적하는 것입니다.