pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

이 절차의 목표는 조절된 exocytosis 중 멤브레인 리모델링 연구를 위해 편광 기반 전반사 형광 현미경 검사가 어떻게 구현되는지 보여주는 것입니다. 이는 먼저 광학 요소, 즉 quarter wave plate 및 polarizing cubes가 개별 p 및 s excitation polarization을 생성하도록 올바르게 배치되도록 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 p 빔과 s 빔이 coline이고, 현미경의 광축을 통과하고, 전반사 형광 또는 TIRF일 때 시야의 동일한 부분을 비추는지 확인하는 것입니다.

다음으로, 이미징할 세포를 카르보 시안화물 다이, 다이 D로 염색하고 탈분극 자극으로 자극하여 엑소사이토시스(exocytosis)를 유발합니다. 마지막 단계는 TIRF에 있는 동안 조밀한 코어 소포를 융합하는 이미지를 캡처하는 것입니다. 궁극적으로 P-T-I-R-F는 크로민 세포 엑소사이토시스(chromin cell exocytosis)로 인한 멤브레인 토폴로지 변화를 모니터링하기 위해 실시간으로 이미지를 획득하는 데 사용됩니다.

고온계 및 멤브레인 커패시턴스와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 ptro F가 멤브레인 곡률을 보고하고 더 나아가 융합 포트 팽창을 직접 보고한다는 것입니다. 이 기술을 사용한 학습 곡선의 가장 가파른 부분은 먼저 p와 s 여기 편광을 정렬하는 방법을 배우는 것인데, 이렇게 하면 현미경의 광축을 통해 coline traveling하고 이미징 필드의 동일한 부분을 비출 수 있습니다. 자주 발생하는 두 번째 문제는 세포 염색, 즉 세포를 dd에 노출시키는 기간과 염색이 잘 된 세포와 염색이 잘 되지 않은 세포를 구성하는 것에 관한 것입니다.

절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 TA square row입니다. 먼저 모든 현미경 구성 요소의 전원을 켜기 위해 레이저와 컴퓨터는 488 나노미터 레이저에서 1.49 개구수 렌즈의 후면 초점면으로 빔을 보냅니다. 레이저 빔이 후방 초점면에 초점을 맞추면 대물렌즈 바로 위의 천장에 작고 잘 정의된 점으로 나타나

그런 다음 X 검류계 미러를 조정하여 레이저 빔이 축에서 벗어나 대물렌즈 법선에 대해 점진적으로 더 가파른 각도로 대물물렌즈에서 나오도록 합니다. 다음으로, 내부 전반사(total internal reflection) 또는 TIR이 달성되었는지 확인합니다. 10마이크로리터의 형광 마이크로스피어를 1ml 부피의 생리식염수와 유리 바닥 접시에 추가하면 TIR 계면에 가장 가까운 접시 바닥에 있는 미세구의 형광만 검출해야 합니다.

떠 다니는 microsphere의 검출은 입사광과 objective normal 사이의 각도가 충분하지 않음을 나타냅니다. 편광 기반 이미징의 경우 정렬된 488 나노미터 빔을 가이드로 사용하고 원시 561 나노미터 레이저 빔의 위치를 조정하여 동일한 광학 경로를 따라 이동하도록 합니다. 561 나노미터 레이저는 시안화 수소 염료의 이미징에 사용됩니다.

오목 렌즈와 미러는 561 나노미터 레이저의 다운스트림에 있습니다. 미러의 조정 손잡이를 사용하여 빔이 488나노미터 빔과 정렬되고 스폿이 천장에 초점이 맞춰지도록 빔을 조정합니다. 검류계 미러가 영점 위치에 있을 때 편광 큐브는 전기장의 수직 성분을 반사하고 수평 성분을 통과합니다.

그것은 작은 변환 단계에서 타원형으로 편광 된 빔의 하류에 배치됩니다. 편광의 후속 정렬을 용이하게 하기 위해 빔 경로는 두 번째 편광 큐브와 미러를 사용하여 빔을 재결합합니다. 셔터는 첫 번째 편광 큐브와 수직 구성 요소 미러 사이에 배치됩니다.

두 번째 셔터는 수평 구성 요소 미러와 두 번째 편광 큐브 사이에 배치됩니다. 이 셔터는 이미징 소프트웨어에 의해 제어되므로 사용자가 빔 편광 사이를 빠르게 선택할 수 있습니다. 편광 필터를 사용하여 각 빔 경로의 전기장 방향을 확인합니다.

편광 필터는 필터의 축에 따라서만 전송을 허용합니다. 레이저 빔의 수직 및 수평 구성 요소가 서로 정렬되어 있고 488 나노미터 빔과 정렬되어 있는지 확인하고 필요에 따라 조정합니다. 세 개의 빔은 모두 후면 초점면에 초점을 맞춰야 하며 대물렌즈에서 천장의 동일한 지점으로 정렬되어 나타나야 합니다.

이 지점은 향후 정렬을 용이하게 하기 위해 X로 표시할 수 있습니다. 다음으로 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 형광 마이크로스피어가 들어 있는 접시를 놓습니다.

목표에서 TIR의 미러 이동 소프트웨어에서 X 검류계 미러를 이동하여 TIR을 입력합니다. 빔의 수직 성분은 S 편광이고 빔의 수평 성분은 이제 빔 경로에서 P 편광 중심, A 1/4 파장판 또는 qw입니다. 레이저 조리개의 바로 다운스트림에서 막대 도민 샘플이 있는 각 편광 소멸장을 볼 수 있으며, 이는 무작위 방향이 될 것으로 예측됩니다.

평균 픽셀 강도와 일치하도록 qw 플레이트를 회전합니다. 프로토콜: 혈구분석기를 사용하여 세포 계수 텍스트에 설명된 대로 고양이 부신에서 건강한 크로민 세포를 분리하고, 제조업체의 권장 사항에 따라 전기천공법 시스템을 사용하여 관심 단백질을 인코딩하는 DNA로 transfection 세포를 transfection할 준비를 합니다. transfection 효율과 세포 생존율 사이의 최상의 균형을 제공하는 설정.

이러한 소 크로민 세포의 준비를 위해 1, 100 볼트, 40 밀리 초, 1 펄스 형질 주입 플레이트 세포를 1 밀리리터의 따뜻한 전기 퍼레이딩 매체에서 폴리 드 리신 및 콜라겐 처리 접시에 부드럽게 트랜스펙션 플레이트 세포를 수행합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 각 접시에 2개의 항생제 배지 1ml를 첨가하십시오.6시간 후 다음 날 배지를 일반 배지로 교체하십시오.

크로민 세포는 일반적으로 전기천공법 후 48시간에서 5일 후에 이미징 시스템을 사용하여 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미징합니다. 레이저가 정렬되어 있는지 확인합니다. 마이크로스피어를 사용하여 소멸장 프로파일을 확인합니다.

글로벌 및 로컬 풍요 시스템을 준비합니다. 여과된 탈이온수로 용액 저장소를 청소하고 기초 및 자극 생리식염수로 채웁니다. 이미징 전에 크로민 세포는 P 편광 및 S 편광 여기가 시야의 동일한 영역을 비추는지, 그리고 조명 강도가 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 거의 동일한지 확인합니다.

이제 크로민 세포가 들어있는 접시에서 DD.Rinse 배양 배지로 소 채도 세포를 염색하고 2 밀리리터의 기초 생리 식염수로 교체합니다. 10마이크로리터의 10밀리몰 DD를 세포가 들어 있는 접시에 직접 추가합니다. 용액을 제거하기 전에 2-10초 동안 접시를 부드럽게 저어줍니다.

기초 생리식염수로 접시를 3-4회 세척하여 잔류 DD를 제거하면 세포가 염색되어 사용할 준비가 됩니다. 대물렌즈에 이멀젼 오일 한 방울을 추가합니다. Dai D 염색 크로민 세포가 들어 있는 접시를 대물렌즈 위에 놓습니다.

국소 관류 바늘을 세포에서 약 100미크론 떨어진 곳에 배치합니다. 세포막에 초점을 맞추고 세포 자극 이미지 획득 직전에 자동 초점 하드웨어를 활성화합니다. 기초 용액으로 10초 동안 이미지 획득 관류 세포를 시작한 다음 탈분극 56밀리몰 염화칼륨 용액으로 60초 동안

561 나노미터 P 편광과 561 나노미터 s 편광 사이에서 빠르게 셔터링하면서 이미지를 획득하여 DD 및 488 나노미터 여기의 p 및 s 방출 변화를 모니터링합니다. transfected vesicle probe를 이미지화하기 위해 이 예에서 Dai를 사용한 간단한 배양 후 chromin 세포의 풍부한 막 라벨링 D.In 세포막이 잘 염색됩니다. 건강한 부착 세포는 p와 s 배출에서 뚜렷한 차이를 보입니다.

P 방출 이미지는 세포의 나머지 부분에 비해 더 밝은 세포 경계를 보여줍니다. S 방출 이미지는 세포 발자국 전반에 걸쳐 대략 균일한 형광을 보여주며, S에 걸쳐 픽셀 P에 대해 픽셀 간에 계산하고 p에 2개의 s를 더한 값을 보여줍니다. 이미지는 각각 멤브레인 곡률과 염료 농도에 민감합니다.

표시된 CHRO 및 세포는 또한 분비 소포를 표지하기 위해 synap OIN 1 florin으로 transfection되었습니다. CHRO와 세포는 염화칼륨으로 자극되어 세포막을 탈분극시키고 엑소사이토시스(exocytosis)를 유발합니다. 촘촘한 코어 소포가 융합됨에 따라 여러 개의 오른쪽 형광 반점이 갑자기 분명해집니다.

하나의 핵융합 이벤트 주위에 흰색 상자가 그려져 있습니다: 이 융합 이벤트를 분석하기 위해 1개의 플로린, 포, VS 및 p의 프레임 별 변화와 2개의 s 이미지 강도를 조사했습니다. CIT One의 형광 형광 강도는 단백질이 융합 부위에서 멀어짐에 따라 빠르게 감소합니다. 융합된 소포 원형질막 복합체를 나타내는 압흔은 상대적으로 느린 속도로 감소합니다.

이 그림은 이러한 측정에 대한 한 가지 해석을 보여줍니다. 빠르고 국소적인 막 변형은 자극, 유발된 칼슘 유입, 막 탈분극으로 인해 G Camp 5G 형광이 크게 증가하여 하위 플라즈마 칼슘 수치가 증가한 결과입니다. 셀의 30 x 20 픽셀 영역이 선택되고 G camp 5G PS 및 p와 2개의 s에서 프레임별로 변경됩니다.

픽셀 강도는 이미지와 그래프에 표시됩니다. 시간 0은 PS의 변화가 분명하기 전의 프레임을 지정합니다. 흰색 화살촉은 멤브레인 변형이 p의 감소와 두 개의 S 방출을 동반한다는 것을 나타냅니다.

세포질 G CAMP 5G 단백질은 융합된 조밀한 코어 소포체에 의해 영역에서 제외됩니다. G 캠프 5G 강도가 0 타임으로 갑자기 감소하는 것도 주목하십시오. POS의 장수명 증가와 p 더하기 2 s의 감소는 그림과 같이 천천히 팽창하는 융합 기공을 암시합니다.

여기: 이 비디오를 시청한 후에는 PTU F 시스템을 구축하고 개발 후 잔디에서 멤브레인 토폴로지 변화를 관찰하기 위해 셀을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 살아있는 세포의 외세포작용, 세포내이입, 사이토키네시스 및 세포 운동성 중 막 모양의 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.