안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

이 절차의 전반적인 목표는 준비된 단백질체학을 사용하여 질량 분석법을 통해 샘플 간의 많은 단백질 농도를 비교하는 것입니다. 이는 먼저 각 샘플에서 단백질을 분해하여 펩타이드 혼합물을 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 두 샘플을 혼합하고 혼합된 샘플의 펩타이드를 분획 및 탈염합니다.

다음으로, 혼합된 샘플은 질량 분석법으로 분석됩니다. 마지막으로, MS 두 스펙트럼을 샘플의 모든 잠재적 펩타이드의 표적 미끼 데이터베이스와 비교하여 펩타이드를 식별하고 샘플 간의 펩타이드의 상대적 풍부도를 정량화합니다. 궁극적으로, 준비된 단백질체학(proteomics)은 복잡한 시료 사이에 있는 많은 단백질의 상대적 풍부도를 정량화할 수 있게 해줍니다.

iLite와 같은 안정 동위원소 라벨링을 위한 다른 방법에 비해 환원성 탈메틸화의 주요 장점은 ready가 특정 트로아 또는 합성 매체가 필요하지 않은 빠르고 저렴하며 정확한 방법이라는 점이며, 이는 거의 모든 유형의 샘플에 적용할 수 있다는 것을 의미합니다. 시작하려면 초음파 처리 또는 프렌치 프레스를 사용하여 세포 단백질을 침전시키기 위해 1mg의 세포 단백질과 500 마이크로 리터를 준비하십시오. 단백질 4 부피에 트리클로로산(tri chlorotic acid) 1 부피를 넣고 얼음에서 10분 동안 식힙니다.

12, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 GS에 분리기는 상등액을 제거한다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 아세톤 1ml를 Resus에 사용합니다. 두 번째로 회전하기 전에 펠릿을 매달아 두십시오.

스내트를 흡인시킨 후 펠릿을 섭씨 56도의 열 블록에서 건조시켜 단백질을 변성시키고 황화 염료 결합을 줄입니다. 500 마이크로 리터의 변성 및 환원 완충액을 사용하여 재사용하십시오. 단백질을 밀리리터당 약 2mg으로 재현탁합니다.

단백질을 섭씨 56도에서 30분 동안 배양한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 알킬레이트 유리 황화물 그룹 옆에 단백질 500마이크로리터에 갓 준비한 0.3몰 IDO 아세트아미드 25마이크로리터를 물에 넣고 실온에서 20분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 배양 후 10 마이크로 리터의 3 밀리 몰 DTT를 첨가하여 반응을 끕니다.

알킬화된 단백질을 섭씨 음의 80도에서 보관하여 TCA 침전 후 알킬화된 단백질을 소화하고 50밀리몰 heis pH 8.2의 1몰 요소를 사용하여 단백질을 재현탁합니다. 라이솔(Lysol), 엔도 프로테라아제(endo proteinase) 또는 ly C를 마이크로리터당 2마이크로그램의 농도로 물에 넣고 효소를 마이크로리터당 10나노그램의 최종 농도로 소화된 단백질에 첨가합니다. 샘플을 실온에서 6시간 또는 하룻밤 동안 방치합니다. 40마이크로리터의 50밀리몰 아세트산에 20마이크로그램의 염기서열분석 등급 트립신을 현탁시키고 라이스 분해 반응에 5마이크로리터를 첨가합니다.

섭씨 37도에서 6시간 동안 알킬화된 단백질을 배양합니다. 최종 농도 0.5%에 tri Fluor acetic acid 또는 TFA를 추가합니다.추출 매니폴드에 C 18 컬럼을 부착합니다. 그런 다음 6ml의 아세토 니트릴 또는 CN을 사용하여 컬럼을 적십니다.

다음으로, 가능한 가장 높은 유속으로 6ml의 80%a CN 0.1%TFA를 사용하여 컬럼을 세척한 후 6ml의 0.1%TFA를 사용하여 컬럼을 평형화하고 진공 압력을 정지한 다음 분당 약 1ml의 유속으로 500μg의 펩타이드를 컬럼에 로드합니다. 펩타이드가 컬럼에 결합되면 진공을 다시 시작하고 가능한 가장 높은 유속으로 0.1% TFA를 사용한 후 3ml의 구연산 완충액을 사용하여 컬럼을 세척하여 종양, 환원성, 희미한 메틸화 또는 준비된 라벨링을 수행합니다. 화학 후드 아래에서 가볍고 무거운 준비 완충액 Tom Methylate 펩타이드를 각각 12 밀리리터씩 준비합니다.

A means 10 ml의 경량 또는 중량 준비 버퍼를 분당 1 밀리리터의 유속으로 컬럼에 추가합니다. 두 번째 10ml 분취액을 적용한 후. 라벨링을 보장하려면 6 밀리리터의 0.1 % TFA를 사용한 다음 1 밀리리터의 0.5 % 아세트산을 사용하십시오.

단백질을 용리시키기 위해 컬럼을 세척하려면 진공을 중지하고 분당 0.5ml의 유속으로 CN 0.5% 아세트산에 40% 1ml를 적용합니다. 그런 다음 원하는 경우 5 밀리리터 주사기로 80 % CN 0.5 % 아세트산 용리 1 밀리리터를 추가합니다. 중량 및 경량 표지 펩타이드 시료를 일대일 비율로 혼합하고 질량 분석법으로 정량화하여 펩타이드 혼합물을 먼저 C 18 HPLC 컬럼에 적용하여 펩타이드 혼합물을 효과적으로 분류할 수 있습니다.

그런 다음 5%a CN을 사용하여 5분 동안 컬럼을 세척한 후 60분 동안 5-35%a CN의 그래디언트를 사용하여 펩타이드를 동일한 분수로 용리합니다. 96 웰 플레이트에서 1 분 동안 90 % A CN에 이어집니다. 추가로 4분 동안 90%A CN을 사용한 후 5%A CN을 사용하여 컬럼을 다시 평형화합니다.

그런 다음 진공 원심분리기와 다음과 같은 방법으로 분획을 결합합니다. 결합된 분획에서 용매를 제거합니다. 그런 다음 130마이크로리터의 1몰 요소 0.5%TFA를 Resus에 사용합니다.

뒤에 오는 분획에서 펩티드를 중단하고, 재suspended 분획에 적출을 실행하고, 멈추고 가기 위하여 음의 20 섭씨 온도에 분획의 세트를 저장하십시오. 내부 직경이 1.07mm인 C 18 디스크 2개를 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁에서 C 18 스테이지 팁 마이크로 컬럼을 준비합니다. 스테이지 팁을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 130마이크로리터의 메탄올을 넣고 회전시킵니다.

그런 다음 130 마이크로 리터의 80 % CN 0.5 % 아세트산을 첨가하고 130 마이크로 리터의 0.1 % TFA를 사용하여 팁을 평형을 이루고 펩타이드 혼합물을 팁으로 옮기고 세척 한 후 다시 회전합니다. 먼저 130마이크로리터의 0.1%TFA가 그 다음을 40마이크로리터의 0.1%TFA로 공급합니다. 그런 다음 40 마이크로 리터의 0.5 % 아세트산을 사용하여 펩티드를 용리시킵니다.

먼저 CN 0.5% 아세트산에 20마이크로리터의 40%를 첨가합니다. 그런 다음 80 % CN 0.5 % 아세트산 20 마이크로 리터. IIT와 진공 여과액을 결합하여 건조시켜 마이크로 모세관 액체 크로마토그래피를 수행합니다.

탠덤 질량 분석 또는 L-C-M-S-M-S는 5% 포름산, 5% A CN을 사용하여 단백질을 마이크로리터당 약 1마이크로그램의 농도로 재현탁시키는 것으로 시작합니다. 약 1마이크로그램의 펩타이드를 100마이크로미터 x 20센티미터 C 18에 도포합니다. 역상 HPLC 컬럼을 사용하여 분당 약 300나노리터의 유속으로 0.1 25% 포름산에서 CN의 6-22% 구배를 사용하여 용리하고 75-100분에 걸쳐 적용합니다.

고분해능 및 높은 질량 정확도를 가진 질량 분석기를 사용하고 SE 퀘스트와 같은 알고리즘을 통해 Ms.Ms Spectra 원시 파일을 이론적 데이터베이스와 비교하여 샘플의 펩타이드를 식별하고, 실제 및 역 방향의 열린 판독 프레임 데이터베이스와 함께 여기에 표시된 매개변수를 사용하여 표적 미끼와 같은 방법으로 펩타이드를 1% 거짓 발견률로 필터링합니다. 식별된 펩타이드를 정량화하기 위해 MS 1에서 추출된 이온 크로마토그램 및 펩타이드 신호 대 잡음비의 중경량 쌍 영역을 계산하면 평균 신호 대 잡음비가 5 이상인 경우에만 펩타이드 쌍이 포함됩니다. 두 샘플에서 펩타이드의 상대적 존재량을 동일한 펩타이드의 무거운 버전과 가벼운 버전의 MS 피크 면적의 비율로 정량화하고, 1% 펩타이드 거짓 발견률로 여과할 때 단백질의 모든 펩타이드에 대한 MS, 하나의 피크 면적 비율 중앙값으로 상대적 단백질 존재량을 계산합니다.

11, 194개의 고유한 펩타이드 서열을 포함하는 무겁고 가벼운 표지된 배양액에서 추출한 c phyto ferment 혼합물의 준비 라벨링 효율은 98%Unfractionated visier protein lysate도 유사하게 분석되었습니다. 단백질 발현 차이는 무거운 샘플과 가벼운 샘플이 광범위한 혼합 비율에 걸쳐 혼합된 비율을 재현 가능하게 반영합니다. 구체적으로, 단백질의 99%의 fo 변화는 1 대 10 및 10 대 1 샘플에서 일대일 혼합 샘플의 경우 1.6보다 작았습니다.

단백질의 99%가 예상 비율의 3.8배 이내였으며, 이는 1:1 혼합물에서 더 먼 거리에서 표준 편차의 증가를 보여주었습니다. 준비된 라벨링이 Clostridium phyto ferment proteome에 적용되었을 때, 2000개 이상의 단백질이 정량화되었으며, 포도당 단백질 폴드에서 자라는 복제 배양에 대해 94% 단백질이 2배 수준 내에서 측정되었습니다. 중복된 배양 쌍에 대한 변화도 높은 상관관계가 있었습니다.

이러한 실험은 Ready 단백질체학이 복잡한 시료 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 정확하고 재현 가능한 방법임을 뒷받침합니다. 이 기술은 거의 모든 유형의 샘플에 적용할 수 있기 때문에 단백질체학 분야의 연구자들이 새로운 미생물, 어류 및 포유류 세포를 포함한 모든 종류의 샘플에서 단백질 발현 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.