안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

이 프로시저의 전반적인 목표는 ready proteomics를 이용한 질량 분석법을 통해 여러 샘플 간의 단백질 농도를 비교하는 것입니다. 이는 먼저 각 샘플의 단백질을 소화시켜 펩타이드 혼합물을 생성함으로써 수행됩니다. 다음으로, 두 샘플을 혼합한 후 혼합 샘플 내의 펩타이드를 분획하고 탈염합니다.

다음으로, 혼합된 시료를 질량 분석법으로 분석합니다. 마지막으로, MS2 스펙트럼을 시료 내의 모든 잠재적 펩타이드가 포함된 타겟 디코이(target decoy) 데이터베이스와 비교하여 펩타이드를 식별하고, 시료 간 펩타이드의 상대적 함량을 정량화합니다. 결과적으로, ready proteomics를 통해 복잡한 시료 간의 수많은 단백질의 상대적 함량을 정량화할 수 있습니다.

iLite와 같은 다른 안정 동위원소 표지 방법과 비교하여 환원적 탈메틸화(reductive demethylation)의 주요 장점은, 이 방법이 빠르고 저렴하며 정확하며, 특정 유도체나 합성 배지를 필요로 하지 않아 거의 모든 유형의 샘플에 적용 가능하다는 점입니다. 먼저, 초음파 처리(sonication)나 프렌치 프레스(French press)를 사용하여 세포를 용해하고 단백질을 침전시켜 1 mg의 세포 단백질과 500 µL의 용액을 준비합니다. 4 부피의 단백질에 1 부피의 trichloroacetic acid를 첨가하고 10분 동안 얼음 위에서 냉각합니다.

4 °C에서 12,000 Gs로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하십시오. 그 다음, 얼음처럼 차가운 아세톤 1 mL를 사용하여 펠릿을 재현탁한 후 다시 한번 원심분리하십시오.

상청액을 흡입하여 제거한 후, 56 °C 히팅 블록에서 펠렛을 건조시켜 단백질을 변성시키고 이황화 결합을 환원시킵니다. 변성 및 환원 버퍼 500 µL를 사용하여 재현탁합니다. 단백질을 약 2 mg/mL 농도로 재현탁하십시오.

단백질을 56 °C에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상온에서 10분 동안 둡니다. 다음으로 유리 설파이드기를 알킬화하기 위해, 500 µL의 단백질에 갓 조제한 0.3 M IDO 아세트아마이드 수용액 25 µL를 첨가하고 상온의 암소에서 20분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 3 mM DTT 10 µL를 첨가하여 반응을 정지시킵니다.

알킬화된 단백질을 -80 °C에서 보관하십시오. TCA 침전 후 알킬화된 단백질을 소화시키기 위해 50 mM HEIS pH 8.2에 1 M urea를 사용하여 단백질을 재현탁하십시오. Lysol, endoproteinase 또는 ly C의 스톡 용액을 물에 2 µg/µL 농도로 준비하고, 소화된 단백질에 효소를 최종 농도 10 ng/µL가 되도록 첨가하십시오. 샘플은 상온에서 6시간 또는 하룻밤 동안 방치합니다. 시퀀싱 등급의 trypsin 20 µg을 50 mM acetic acid 40 µL에 현탁한 후, lyce 소화 반응액에 5 µL를 첨가하십시오.

알킬화된 단백질을 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 최종 농도가 0.5%가 되도록 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가합니다. 추출 매니폴드에 C 18 컬럼을 장착합니다. 그런 다음 6 mL의 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 컬럼을 적십니다.

다음으로, 가능한 가장 높은 유속으로 80% AC N 0.1% TFA 6 mL를 사용하여 컬럼을 세척한 후, 0.1% TFA 6 mL를 사용하여 컬럼을 평형화합니다. 진공 압력을 멈추고 약 1 mL/min의 유속으로 500 µg의 펩타이드를 컬럼에 로딩합니다. 펩타이드가 컬럼에 결합되면 진공을 다시 시작하고, 가능한 가장 높은 유속으로 0.1% TFA와 이어서 3 mL의 구연산 완충액을 사용하여 컬럼을 세척함으로써 onco, 환원적 dim methylation 또는 ready labeling을 수행합니다. 화학 흄 후드 아래에서, 펩타이드의 methylate 처리를 위해 light 및 heavy ready 버퍼를 각각 12 mL씩 준비합니다.

컬럼에 가벼운 또는 무거운 준비 버퍼 10 milliliters를 1 milliliter/min의 유속으로 첨가합니다. 두 번째 10 milliliter 분량을 적용한 후, 라벨링을 보장하기 위해 0.1% TFA 6 milliliters를 사용하고, 이어서 0.5% acetic acid 1 milliliter를 사용합니다.

단백질을 용출시키기 위해 컬럼을 세척하려면, 진공을 중단하고 0.5 mL/min의 유속으로 40% a CN 0.5% acetic acid 1 mL를 처리합니다. 그 다음 80% a CN 0.5% acetic acid 1 mL를 첨가하며, 필요한 경우 5 mL 시린지로 용출합니다. 중쇄 및 경쇄 표지 펩타이드 샘플을 1:1 비율로 혼합하고 질량 분석법으로 정량하여 중쇄와 경쇄 표지가 모두 효과적으로 이루어졌는지 확인합니다. 그런 다음 펩타이드 혼합물을 C 18 HPLC 컬럼에 먼저 적용하여 펩타이드 혼합물을 분획합니다.

그 후 5% ACN으로 5분 동안 컬럼을 세척하고, 60분 동안 5%에서 35% ACN 농도 기울기(gradient)를 사용하여 펩타이드를 동일한 분획으로 용출합니다. 96-웰 플레이트에 수집하며, 이어서 1분 동안 90% ACN을 흘려줍니다. 추가로 4분 동안 90% ACN을 더 흘려준 후, 5% ACN을 사용하여 컬럼을 재평형화합니다.

그런 다음 진공 원심분리기를 사용하여 다음과 같은 방식으로 분획을 결합합니다. 결합된 분획에서 용매를 제거합니다. 그 후 1M urea 0.5%TFA 130 µL를 사용하여 재현탁합니다.

다음 분획의 펩타이드를 현탁하고, 재현탁된 분획에 대해 간헐적 추출을 수행할 수 있도록 해당 분획 세트를 -20 °C에서 보관하십시오. 내경 1.07 mm의 C 18 디스크 2개를 사용하여 200 µL 피펫 팁으로 C 18 스테이지 팁 마이크로 컬럼을 제작하십시오. 스테이지 팁을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 130 µL의 메탄올을 추가한 후 원심분리하십시오.

그 후 0.1% TFA 130 µL를 사용하여 팁을 평형화한 다음, 펩타이드 혼합물을 팁으로 옮기고 세척합니다. 먼저 0.1% TFA 130 µL로 세척한 후, 이어서 0.1% TFA 40 µL로 세척합니다. 그다음 다시 스핀하기 전 80% CN 0.5% acetic acid 130 µL를 첨가합니다. 마지막으로 펩타이드를 용출시키기 위해 0.5% acetic acid 40 µL를 사용합니다.

먼저, 0.5% acetic acid에 40% CN 20 µL를 첨가합니다. 그다음 0.5% acetic acid에 80% CN 20 µL를 첨가합니다. IIT를 혼합하고 진공 여과하여 건조시킨 후 마이크로 모세관 액체 크로마토그래피를 수행합니다.

텐덤 질량 분석법 또는 LC-MS/MS는 5% formic acid와 5% ACN을 사용하여 단백질을 약 1 µg/µL 농도로 재현탁하는 것으로 시작합니다. 약 1 µg의 펩타이드를 100 µm x 20 cm C18 역상 HPLC 컬럼에 로딩하고, 0.1% formic acid 내 ACN 농도를 6%에서 22%까지 구배(gradient)하여 약 300 nL/min의 유속으로 75~100분 동안 용리합니다.

고해상도 및 고질량 정확도를 갖춘 질량 분석기를 사용하여, SEquest와 같은 알고리즘으로 MS/MS 스펙트럼 원시 파일을 정방향 및 역방향 오픈 리딩 프레임 데이터베이스와 비교하여 샘플 내 펩타이드를 식별하십시오. 이때 여기에 표시된 파라미터를 사용하십시오. target decoy와 같은 방법으로 펩타이드의 위양성률(false discovery rate)을 1%로 필터링하십시오. 식별된 펩타이드를 정량화하려면, MS1 추출 이온 크로마토그램의 중쇄 및 경쇄 쌍의 면적과 펩타이드 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)를 계산하십시오. 평균 신호 대 잡음비가 5 이상인 펩타이드 쌍만 포함하십시오. 두 샘플에서 펩타이드의 상대적 풍부도는 동일한 펩타이드의 중쇄 및 경쇄 버전의 MS1 피크 면적 비율로 정량화하십시오. 단백질의 상대적 풍부도는 펩타이드 위양성률을 1%로 필터링했을 때 해당 단백질 내 모든 펩타이드의 MS1 피크 면적 비율의 중앙값으로 계산하십시오.

11,194개의 고유한 펩타이드 서열을 포함하는 중표지 및 경표지 배양 세포의 c phyto 발효물 혼합물의 라벨링 효율은 98%였다. 분별하지 않은 시각 단백질 용해물 또한 유사하게 분석되었다. 단백질 발현 차이는 광범위한 혼합 비율에 걸쳐 중표지와 경표지 시료가 혼합된 비율을 재현성 있게 반영하였다. 구체적으로, 1:1 혼합 시료, 1:10 혼합 시료 및 10:1 혼합 시료에서 단백질의 99%에 대한 변화율(fold change)은 1.6보다 작았다.

단백질의 99%가 예상 비율의 3.8배 이내에 있었으며, 이는 1:1 혼합물에서 거리가 멀어질수록 표준 편차가 증가함을 보여주었습니다. Clostridium phytoferment 프로테옴에 ready labeling을 적용했을 때 2,000개 이상의 단백질이 정량화되었으며, 포도당 단백질 배지에서 성장한 반복 배양액의 단백질 중 94%가 2배 수준 이내에서 측정되었습니다. 배양액 중복 쌍 간의 변화 또한 매우 높은 상관관계를 보였습니다.

이러한 실험들을 통해 Ready proteomics가 복잡한 시료 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 정확하고 재현 가능한 방법임을 입증하였습니다. 이 기술은 사실상 거의 모든 유형의 시료에 적용할 수 있으므로, 프로테오믹스 분야의 연구자들이 새로운 미생물, 어류 및 포유류 세포를 포함한 모든 종류의 시료에서 단백질 발현 변화를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.