Name: 안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 정량 프로테오믹스를 위한 안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸화(ReDi) 기법을 사용하여 질량 분석법으로 단백질 농도를 비교하는 방법을 배우세요. 이 기법은 빠르고 비용 효율적이며 다양한 샘플 유형에 적용 가능합니다.

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도움과 안내를 해주신 SP Gygi와 GM Church에 감사드립니다. 이 작업은 ACT에 대한 CNRS chaire d' excellence의 지원을 받았습니다.

참고 :이 방법은 이전에 12를 설명했다. 1. 단백질 분리 바람직하게는 프랑스어 프레스, 구슬 박동, 또는 초음파 등의 물리적 방법에 의해, 용해하는 세포에 의해 세포 단백질의 1 밀리그램을 준비합니다. 효소 질량 분석 측정을 혼동하기 때문에 라이소자임 - 매개 세포 용해를 방지. 단백질의 2. TCA 강수량 단백질을 침전 10 분 동안 얼음에 4 권의 단백질과 진정으로 1 볼륨 트리클로로 아세트산 (TCA)를 추가합니다. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 12,000 XG에 상층 액을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 12,000 XG에 얼음처럼 차가운 아세톤 및 원심 분리기 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁 상층 액을 제거하고 15 분 동안 펠렛을 건조 벤치에 튜브를 반전. -80 ° C에서 저장 단백질 펠렛 3. 변성 단백질과 이황화 채권을 감소 다시단백질을 중단 500 ㎕의 변성 및 감소 버퍼에 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ (50 mM의 HEPES 산도 8.5, 5 mM의 DTT 4 M 요소 또는 3 % SDS 중 하나)에. 선택적으로, 버퍼에있는 단백질 분해 효소 억제제 (가) 있습니다. 실온에서 10 분 뒤에 56 ° C에서 30 분, 위해 단백질을 품어. 4. Aklylate 무료 설 프히 드릴 그룹은 돌이킬 수 이황화 결합 형성을 방해하는 물에 신선한 0.3 M의 요오도 아세트 아미드를 준비합니다. 주의! 요오도 아세트 아미드는 매우 독성이다. 500 ㎕의 단백질을 25 ㎕의 0.3 M 요오도 아세트 아미드 (15 mM의 최종 농도)를 추가하고 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 300 mM의 DTT (5 mM의 DTT 최종 농도)의 10 μl를 추가하여 요오도 아세트 아미드 끄다. C. -80 ° 알킬화 단백질을 저장 5. 단백질 소화 TCA는 단백질을 침전 (2 단계에 설명 된대로), 50 mM의 HEPES (산도 8.2) 1 ㎖, 1 M 요소의에 resuspend. 리실의 endoprotein의 재고 솔루션을 준비합니다2 ㎍ / μL의 농도와 단백질 용액에 5 μl를 추가 물에 ASE (리스-C). 실온에서 16 시간 동안 혼합물을 배양한다. 최종리스-C 농도가 10 NG / μL 및 단백질 - 투 -의 lysC 비율 (W / W) 1 / 200 ~ 1 / 50입니다 확인합니다. 50 mM의 아세트산의 40 μL에 20 μg 시퀀싱 등급 트립신을 재현 탁리스 - C 다이제스트에 5 μL (10 μg 트립신)를 추가하고, 37 ℃에서 6 시간 동안 배양 트립신에 사용되는리스-C에 대해 같은 단백질 분해 효소의 농도와 단백질 분해 효소 - 투 - 단백질 비율을 사용합니다. 6. 역상 펩타이드 추출 <ol><li> 0.5 %의 최종 농도 (산도 ≈ 2)에 트리 플루오로 아세트산 (TFA)를 첨가하여 펩티드를 산성화. 추출 매니 폴드에 C18 컬럼을 연결합니다. 펩티드의로드 및 용출를 제외한 모든 단계에 대한 가장 높은 유량을 사용합니다. </li><li> 6 ㎖의 아세토 니트릴 (ACN) 젖은 열입니다. 6 ㎖의 80 % ACN, 0.1 % TFA로 열을 세척 한 다음 10 ㎖의 0.1 % TFA와 평형. 허용하지 않음단계 사이에 건조 실행하는 열입니다. </li><li> 진공 압력을 정지하고 약 1 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 펩타이드 500 μg를로드. 펩티드는 열, 다시 시작 진공에 바인딩 한 다음 (0.09 M 구연산, 0.23 M 나 2 HPO 4, pH를 5.5) 구연산 버퍼의 3 ㎖로, 10 ㎖의 0.1 % TFA로 세척 한 후. 참고 : 높은 펩티드 량이 표시 될 수 있지만 결합능 C18 컬럼이 적어도 샘플 손실을 피하기 위하여 펩티드 양보다 두 배이어야한다. </li></ol> 7.에 열 환원성 디메틸 화에 의해 펩타이드 라벨링 (REDI 라벨링) 시안화 수소는 레테르를 붙이는 과정에서 낮은 농도로 방출 등의 화학 후드에서이 단계를 수행합니다. <ol><li> 펩타이드 무료 아민을 메틸화하는 &quot;빛&quot;과 &quot;무거운&quot;REDI 버퍼 12 ML을 준비합니다. 밝은 REDI 버퍼는 0.8 %의 포름 알데히드 및​​ 번째에 수소를 운반하는 0.12 M 소듐 사이 아 노보로 하이드 라이드로 구성구연산 버퍼에 EIR 천연 동위 원소의 분포. 무거운 REDI 버퍼는 0.8 % 중수 소화 포름 알데히드와 구연산 완충액에 0.12 M 중수 소화 나트륨 시아 노보로 구성된다. </li><li> 1 ㎖ / 분의 유속으로 펩티드 함유 컬럼에 10 ㎖의 광 또는 농후 한 Redi 버퍼 하나를 첨가하여 펩티드를 함유하는 컬럼을 부화하고 완전한 라벨링을 위해 반복한다. 워시 6 ㎖의 0.1 % TFA와 열 한 후 1 ㎖의 0.5 % 아세트산. </li><li> 진공을 중단하고 약 0.5 ㎖ / 분의 유속을 사용하여 다음 1 ㎖의 80 % ACN으로, 0.5 % 초산 1 ml의 40 % ACN, 0.5 % 초산과 제 표지 펩티드​​를 용리 하였다. 원하는 경우, 무겁고 가벼운 샘플을 혼합하기 전에 질량 분석법에 의한 개별 샘플 라벨링 효율을 측정 ( &quot;대표 결과&quot;참조). 질량 분석에 의해 정량화 될 수 1:1 무겁고 가벼운 표지 펩타이드 샘플을 섞는다. </li></ol> 기본 pH를 역상 (BPRP) 크로마토 그래피 &lt;8. 별도의 펩타이드 혼합물/ P&gt; 기본 pH는 독립적으로 프로테옴 범위를 확대하기 위해 LC-MS/MS로 분석되는 여러 개의 분수로 펩타이드 혼합물을 분리하는 단계 (BPRP) 크로마토 그래피를 반전. <ol><li> 10mM의 중탄산 암모늄 (pH가 13)에서 증가 ACN 농도 구배를 적용하여 C18-HPLC 컬럼에서 펩타이드 혼합물을 분별. 5 분 5 % (V / V) ACN 시작, 60 분에 35 % ACN으로 증가하고, 1 분에 다음에 90 % ACN. 9 분 다시 평형 컬럼에 5 % ACN을 감소하기 전에 4 분 동안 90 % ACN을 유지합니다. 96 - 웰 플레이트 (H12에 A1)에 같은 부피의 96 분수를 수집합니다. 펩티드는 열 (여기에 설명 된 조건에 대한 10 ~ 70 분) 떨어져 용출하는 동안 220 nm에서 UV 검출기를 사용하여 분별을 모니터링합니다. </li><li> 우물 A2, C2, E2, 및 G2 (분수 A2)에서하고 그에 따라 들어, 우물 B1, D1, F1 및 H1 (분수 B1)에서, 우물 A1, C1, E1, 및 G1 (분수 A1)에서 분수를 결합 나머지 분수. solven를 제거진공 원심 분리기를 이용하여 t. 분수에서 재현 탁 펩티드는 A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 및 B12 1 M urea/0.5 %의 TFA의 130 μL와 9 단계에 설명 된대로 StageTips을 사용하여 정제. 저장 분수 B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, -20에서 A12 º C. </li></ol> 9. 정지 및 이동 추출로 정제 펩티드 (StageTips) 1.07 mm의 내부 직경 (ID)와 두 개의 C18 디스크 200 μL 피펫 팁을 포장하여 C18-StageTip 7 마이크로 컬럼을 준비합니다. 에펜 도르프 튜브에 무대 팁을 넣어. 메탄올 130 μL, 다음 130 UL 80 % ACN, 0.5 % 아세트산과 팁을 씻어 마이크로 원심을 사용합니다. (130) 0.1 μL % TFA로 StageTips을 평형. StageTips에 펩티드 혼합물을 전송하고 40 ㎕의 0.5 % 초산 후, 40 ㎕의 0.1 % TFA 후, 130 ㎕의 0.1 % TFA로 세척. 20 ㎕의 40 % ACN, 0.5 % 아세트산, 다음 20 ㎕의 80 % ACN, 0.5 % 아세트산으로 제 펩타이드 용출. 용출액 결합차 진공 여과하여 건조. 10. 마이크로 캐 필러 LC-MS/MS <ol><li> 약 1 ㎍ / ㎕의 농도에 1 ~ 5 ㎕의 5 % 포름산, 5 % ACN의 펩티드를 녹인다. 에서 ~ 1 μg 펩티드를 해결 100 μM × C18 반전 0.125 % 포름산에서 6~22% ACN의 구배로 위상 HPLC 컬럼 ~ 300 NL / 분의 유속으로 75 또는 100 분에 걸쳐 적용될 20cm. </li><li> LTQ Orbitrap VELOS (12) 또는 질량 분석계는 고해상도 및 높은 질량 정확도를 제공하는 것과 유사한 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 플랫폼을 사용하여 펩티드를 식별한다. Orbitrap 분석기에서 획득 한 전체 MS 스캔 (60,000의 해상도)과 데이터 종속 모드에서 질량 분석기를 사용하십시오. 전체 MS 스펙트럼에서 검출 된 20 가장 풍부한 이온 선형 이온 트랩 MS / MS 스펙트럼을 생성합니다. MS / MS에 1 × 10의 전체 MS 6 2,000에 자동 이득 제어 (AGC) 목표를 설정합니다. 1000 밀리 초에 최대 이온 축적 시간을 설정할MS 및 MS / MS 150 밀리 초에 대한. 20 ~ 60 초 동안 MS / MS에서 추가 선택에서 조각난 펩타이드 전구체 이온을 제외합니다. </li></ol> 11. MS / MS 데이터 수집 이러한 매개 변수 (표 1)를 사용하여 같은 SEQUEST 8과 같은 알고리즘을 이론적으로 데이터베이스에 MS / MS 스펙트럼 RAW 파일을 비교하여 펩티드를 확인합니다. 표 1. 펩타이드 데이터베이스 검색 매개 변수를. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> 일반 매개 변수 </td><td> 최대 2와 완벽하게 트립신 소화 분열을 놓친 </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm의 전구체 이온 허용 </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 다 조각 이온 허용 </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> 정적 수정 </strong&gt; </td><td> 시스테인, carboxyamidomethylation에 57.02146 다 </td></tr><tr height="19"><td> 라이신과 펩타이드 N-말단에 28.03130 다, 빛 디메틸 화 라벨 </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> 동적 수정 </td><td> 메티오닌, 산화에 15.99491 다 </td></tr><tr height="19"><td> 라이신과 펩타이드 N-말단, 무거운 디메틸 화 라벨 6.03766 다 </td></tr></tbody></table><ol><li> 실제와 반대 방향에서 오픈 리딩 프레임의 데이터베이스를 사용하여 이러한 목표 미끼 9 전략 등의 방법으로 1 %의 거짓 발견 속도에 필터 펩티드. </li></ol> 12. 펩티드 정량 계산 MS1의 중사 슬 및 경 쌍의 영역은 이온 크로마토 그램 (MS1의 피크 면적)을 추출하고, 펩티드 신호 대 잡음 (S / N) 비 10. 펩타이드 쌍을 포함하는 경우에만 자신의 평균 신호 - 대 - 노이SE 비율은 다섯 이상입니다. 동일한 펩티드 (MS1 피크 면적비)의 중사 슬 및 경 버전의 MS1의 피크 면적의 비율로서 두 개의 샘플에서 펩티드의 상대적인 풍부함을 계량화한다. 단백질의 모든 펩티드에 대한 평균 MS1의 피크 면적 비율로 상대적으로 단백질의 개체수를 계산합니다.

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저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 그 밖의 충돌 선언하지 않습니다.

높은 저렴한 라벨 시약 (시약은 샘플 당 1 달러 미만의 비용), 빠른 반응 속도 (~ 10 분), 부산물의 부재 : 몇 가지 점은 양적 proteomics의 매력적인 방법 환원 디메틸 화 (REDI 라벨)를 사용하여 펩티드의 안정 동위 원소 라벨링을 재현성 (도 3,도 4), 안정적인 반응 생성물, 임의의 단백질 분해 효소를 사용하는 능력 및 표지 된 펩티드의 높은 이온화 효율. 이 합성 중간에 특정 아미노산 auxotrophies 또는 성장 균주 또는 세포 라인을 필요로하지 않기 때문에 REDI으로 화학 라벨은 또한 신진 대사 라벨에보다 유리하다. 이와 같이, 한 Redi 근소 돌연변이 균주가 다른 15 사이, 13과 인간 줄기 세포 14 사용할 수있는 신규 한 미생물 (12)를 포함하여 단백질 시료의 거의 모든 타입에 적용될 수있다. REDI 라벨의 한계는 오티에...

복잡한 시료 사이에 많은 단백질의 농도 차이를 측정하는 것은 단백질 체학의 중심 과제이다. 점점이 서로 다른 동위 원소의 태그를 각 샘플에서 단백질을 라벨 샘플을 결합하고, 농도의 차이를 정량화하기 위해 질량 분석기를 사용하여 수행되고있다. 몇 가지 방법은 단백질과 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 존재한다. ICAT 3, iTRAQ 4, 환원 디메틸 화 5 단백질 추출 및 소화 후 안정 동위 원소의 태그를 추가하는 반면 15 N 표시 1 SILAC 2, 생체 내에서 대사 동위 원소 라벨을 소개합니다. 이러한 방법 중에서, 환원 디메틸 화 (REDI 라벨링)는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질 농도 차이를 정량화 할 수있는 저렴하고 재현성있는 방법으로 인기를 얻고있다. REDI 라벨은 감소 쉬프 기반을 형성하는 포름 알데히드와 반응 펩티드를 포함노보로 하이드 라이드로. 이 반응은 N-말단 및 리신 측쇄 monomethylates 및 N-말단에 프롤린 자유 아미노기를 dimethylates. 여기에 설명 된 프로토콜은 중수 소화 포름 알데히드와 노보로 하이드 라이드 (그림 1)를 사용하여 &quot;무거운&quot;레이블이 자연 동위 원소 분포와 샘플 2의 수소 원자와 시약을 사용하여 &quot;빛&quot;라벨 샘플 1 펩티드를 methylates. 빛과 질량 분석기를 이용하여 두 형태를 구별하기 위해 사용되는 무거운 형태 사이 6.0377 다의 질량 차이로 펩티드 결과의 각 dimethylated 아미노기. 구체적으로는, 상대 펩티드 존재비는 광의 MS1 추출 이온 크로마토 영역 비율 (MS1 피크 면적비) 및 각 펩티드 이온 쌍 무거운 버전으로 정량화된다. 단백질의 상대적인 풍부함이 단백질에있는 펩티드들 중앙값 MS1 피크 면적의 비율로서 계산된다. 이 보고서에서, 우리는 행위에 대한 강력한 프로토콜을 설명역상 펩타이드 고체상 추출에 열 REDI 라벨링, 펩티드 분획 염기성 pH 기준 위상 (BPRP) 크로마토 그래피를 반전하고 StageTips를 이용 펩타이드 혼합물의 정제 (도 2)를 포함 LC-MS/MS에 의해 REDI 라벨링 실험을 보내고 . 우리는 정량 프로테오믹스에 대한 REDI 라벨 사용의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>트리클로로 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>단백질 침전</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>단백질 침전</td></tr> 도<tr><td>데실 황산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>변성, 단백질 감소</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>변성, 단백질</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td> <td>감소Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>변성, 감소, 알킬레이트 단백질</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 완전한 미니 칵테일</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>변성, 단백질</td></tr><tr><td>감소 요오도아세트아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>알킬레이트 단백질</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H7523</td><td>재현탁, 추출물, 라벨 단백질</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5670</td><td>단백질 재현탁</td></tr><tr><td>Lysyl Endoprotease</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>단백질 분해</td></tr> 시<tr><td>퀀싱 등급 트립신</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>단백질 분해</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>단백질 분해</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>역상 펩타이드 추출</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 카트리지</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>역상 펩타이드 추출</td></tr><tr><td>추출 매니폴드</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td>역상 펩타이드 추출</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>14261</td><td>다양한</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>252549</td><td>" 빛" 펩타이드 라벨링</td></tr><tr><td>시아노보로하이드라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>71435</td><td>" 빛" 펩타이드 라벨링</td></tr><tr><td>중수소화 포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>492620</td><td>" 무거운" 펩타이드 라벨링</td></tr><tr><td>시아노보로듀테리드나트륨</td><td>CDN 동위원소</td><td>D-1797</td><td>" 무거운" 펩타이드 라벨링</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>펩타이드 라벨링</td></tr><tr><td>C18-HPLC 컬럼 (4.6 x 250 mm, 5 &micro; m 입자 크기)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>기본 pH 역상 크로마토그래</td></tr>피 <tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>다양한</td></tr><tr><td>C18 Empore 디스크</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>STAGE 팁</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>494437</td><td>STAGE 팁</td></tr></tbody></table>

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확하게 질량 분석기를 사용하여 샘​​플 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 방법입니다. REDI 라벨은 각각의 유리 아민에 두 개의 메틸 그룹을 추가하기 위해 정기적 (빛) 또는 포름 알데히드와 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드의 중수 (무거운) 양식을 사용하여 수행됩니다. 여기에서 우리는 REDI 표시와 복잡한 단백질 혼합물의 정량 비교를위한 강력한 프로토콜을 보여줍니다. 비교를 위해 단백질 시료는 빛 또는 무거운 메틸 태그, 혼합하고, LC-MS/MS 공동 분석 중 하나를 수행하는 레이블 펩타이드로 분해된다. 상대 단백질의 개체수는 전체 MS 스펙트럼에서 추출 된 성분 펩타이드의 무겁고 가벼운 표시된 버전의 이온 크로마토 그램의 피크 면적을 비교하여 정량화. 여기에서 설명하는 방법은 샘플 역상 고상 추출에 의한 제조, 펩타이드에 열 REDI 라벨, 기본 산도 회전에 의해 펩타이드 분획을 포함ersed 상 (BPRP) 크로마토 그래피 StageTip 펩티드 정제. 우리는 안정 동위 원소의 설립을위한 다른 방법에 대한 REDI 라벨의 장점과 한계에 대해 설명합니다. 우리는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질의 개체수를 비교하는 빠르고, 저렴하고 정확한 방법으로 REDI 라벨을 사용하여 새로운 응용 프로그램을 강조 표시합니다.

우리는 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 사용하여 정확도, 정밀도 및 REDI 라벨의 재현성을 평가하고 클로 스트 리듐 속의 세균은 전체 세포 용 해물을 phytofermentans. 우리는 먼저 C의 혼합의 REDI 라벨의 효율성을 정량화 셀룰로오스 (무거운 표시, H)과 포도당 (빛 라벨, L) 문화에서 단백질 해물을 phytofermentans. 1 %의 펩타이드 거짓 발견의 속도로 여과 할 때,이 샘플은 98 % REDI 라벨 효율 11194 독특한 펩타이드 서열을 포함. 미분 획 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 단백질 용 해물은 마찬가지로, H 또는 L로 표지 시약 다양한 비율로 혼합하고, 분석 하였다. 단백질 발현의 차이 ()이 (중앙값 MS1 피크 구역 로그) 재현성 H 및 L 샘플 비율 (도 3)를 혼합하는 넓은 범위에 걸쳐 혼합 하였다되는 비율을 반영한다. 특히...

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 ready proteomics를 이용한 질량 분석법을 통해 여러 샘플 간의 단백질 농도를 비교하는 것입니다. 이는 먼저 각 샘플의 단백질을 소화시켜 펩타이드 혼합물을 생성함으로써 수행됩니다. 다음으로, 두 샘플을 혼합한 후 혼합 샘플 내의 펩타이드를 분획하고 탈염합니다.다음으로, 혼합된 시료를 질량 분석법으로 분석합니다. 마지막으로, MS2 스펙트럼을 시료 내의 모든 잠재적 펩타이드가 포함된 타겟 디코이(target decoy) 데이터베이스와 비교하여 펩타이드를 식별하고, 시료 간 펩타이드의 상대적 함량을 정량화합니다. 결과적으로, ready proteomics를 통해 복잡한 시료 간의 수많은 단백질의 상대적 함량을 정량화할 수 있습니다.iLite와 같은 다른 안정 동위원소 표지 방법과 비교하여 환원적 탈메틸화(reductive demethylation)의 주요 장점은, 이 방법이 빠르고 저렴하며 정확하며, 특정 유도체나 합성 배지를 필요로 하지 않아 거의 모든 유형의 샘플에 적용 가능하다는 점입니다. 먼저, 초음파 처리(sonication)나 프렌치 프레스(French press)를 사용하여 세포를 용해하고 단백질을 침전시켜 1 mg의 세포 단백질과 500 µL의 용액을 준비합니다. 4 부피의 단백질에 1 부피의 trichloroacetic acid를 첨가하고 10분 동안 얼음 위에서 냉각합니다.4 °C에서 12,000 Gs로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하십시오. 그 다음, 얼음처럼 차가운 아세톤 1 mL를 사용하여 펠릿을 재현탁한 후 다시 한번 원심분리하십시오.상청액을 흡입하여 제거한 후, 56 °C 히팅 블록에서 펠렛을 건조시켜 단백질을 변성시키고 이황화 결합을 환원시킵니다. 변성 및 환원 버퍼 500 µL를 사용하여 재현탁합니다. 단백질을 약 2 mg/mL 농도로 재현탁하십시오.단백질을 56 °C에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상온에서 10분 동안 둡니다. 다음으로 유리 설파이드기를 알킬화하기 위해, 500 µL의 단백질에 갓 조제한 0.3 M IDO 아세트아마이드 수용액 25 µL를 첨가하고 상온의 암소에서 20분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 3 mM DTT 10 µL를 첨가하여 반응을 정지시킵니다.알킬화된 단백질을 -80 °C에서 보관하십시오. TCA 침전 후 알킬화된 단백질을 소화시키기 위해 50 mM HEIS pH 8.2에 1 M urea를 사용

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

세포가 스트레스 조건을 만났을때 반응 산소 종 수준이 상승하고 있습니다. 여기 3'-3 'diaminobenzidine의 염색법의 예제뿐만 아니라 산화 환원 프로테옴을 프로파일하기 위해 cysTMT 라벨 및 질량 분광법을...

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

학습하세요 정량 프로테오믹스를 위한 안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸화(ReDi) 기법을 사용하여 질량 분석법으로 단백질 농도를 비교하는 방법을 배우세요. 이 기법은 빠르고 비용 효율적이며 다양한 샘플 유형에 적용 가능합니다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

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