의 NMR 공명 확인하는 방법 ¹³ C-디메틸 N-말단 아민

이 절차의 전반적인 목표는 알파 및 엡실론 탄소를 할당하는 것입니다. 13 디메틸 아민 NMR 말단 라이신의 공명, 라이소자임 잔류물. 이것은 먼저 낮은 pH와 높은 pH에서 탄소 13 포름알데히드의 기하학적 양으로 라이소자임을 환원적으로 메틸화함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계는 포름알데히드가 완전한 메틸화를 위해 자연적으로 과도하게 낮은 pH 및 높은 pH 샘플을 환원적으로 메틸화하는 것입니다. 마지막 단계는 NMR 분석을 위해 환원성 메틸화 샘플을 D2O 완충액으로 완충 교환하는 것입니다. 두 번째 방법에서는 라이소자임 샘플의 아미노 펩티다아제 분해를 통해 목표를 달성할 수 있습니다.

두 번째 단계는 절단된 단백질 샘플을 과량의 탄소 13 포름알데히드로 환원적으로 메틸화한 다음 NMR 분석을 위한 완충액 교환입니다. 궁극적으로 NMR 분광법은 할당을 위해 탄소 13 메틸 공명이 없음을 보여주는 데 사용됩니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 알파 및 SSON 디메틸 라민과 단백질 내부 라이신의 ML 공진을 명확하게 할당할 수 있다는 것입니다. F-L-S-L-P-H 및 HPH가 있는 1밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 3개는 pH의 6에서 이전에 준비된 완충 용액에 3개의 라이소자임 샘플을 용해합니다. 7.5 및 10을 사용하여 밀리리터당 5밀리그램의 최종 농도를 제공합니다.

튜브 덮개를 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로 인한 열화를 방지합니다. 그런 다음 이전에 준비된 1 몰 디메틸 아민 보링 복합체 용액 6.1 마이크로 리터를 FLS 튜브에 추가하고 동일한 용액 3.2 마이크로 리터를 LPH 및 HPH 튜브에 추가합니다. 혼합물을 부드럽게 와류로 만든 후 이전에 준비된 1 몰 탄소 13 포름 알데히드 용액 12.3 마이크로 리터를 FLS 샘플에 첨가하고 동일한 용액 6.1 마이크로 리터를 L-P-H-N-H-P-H 샘플에 첨가합니다.

반응 혼합물을 섭씨 4도에서 2시간 동안 흔듭니다. 동일한 부분 표본의 DMAB와 탄소 13 포름알데히드를 해당 튜브에 첨가하여 이전 단계를 반복합니다. 반응 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 흔들어 총 반응 시간 18-24 시간 동안 흔들고, 각 샘플의 완충액을 pH 7.5에서 3 밀리리터의 인산염 완충액으로 교환하여 3 킬로달톤 분자량 컷오프에서 원심 필터를 사용하여 과도한 시약 및 부산물을 제거하고, 섭씨 4도 및 7도에서 35도 고정 각도 로터가 있는 원심 분리기를 사용하여 샘플을 500 마이크로 리터로 집중하고, 500 RCF입니다.

이어서 이전 단계를 두 번 반복합니다. 부분적으로 라벨링된 샘플 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 새로 준비된 1몰 DMAB 용액 6.1마이크로리터를 추가합니다. 샘플이 와류로 변환된 후 새로 준비된 1몰 천연 풍부 포름알데히드 용액 12.3마이크로리터를 튜브에 추가합니다.

반응 혼합물을 섭씨 4도에서 2시간 동안 흔듭니다. 이전 단계에서와 동일한 DMAB 및 천연 풍부 포름알데히드 분취량을 첨가하고, 50 밀리몰 인산나트륨 완충액과 완충액 교환 후 총 반응 시간 18 - 24시간 동안 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 반응 혼합물을 흔듭니다. 각 샘플의 10마이크로리터 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브를 세척하고 MALDI MS 분석을 위해 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

다음으로, 이전에 준비된 2개의 몰 붕산나트륨 완충 용액 375마이크로리터를 4개의 15ml 원추형 튜브에 추가합니다. 파라는 튜브의 상단을 필름으로 만들고 파라 필름을 통해 구멍을 뚫습니다. 튜브를 동결건조된 플라스크에 넣고 샘플을 얼립니다.

샘플이 얼면 동결 건조기 피펫에서 샘플을 제거한 후 건조시키기 위해 플라스크를 동결 건조기에 놓고 각 튜브에 15 밀리리터의 D 2 O를 그리고이 라벨에 따라 F-L-S-L-P-H 및 HPH가있는 원심 필터를 포함하는 3 개의 4 밀리리터 원추형 튜브를 혼합합니다. 각 샘플의 약 500마이크로리터를 해당 필터 튜브에 추가합니다. 그런 다음 50 밀리몰 나트륨 섭취 완충액 3 밀리리터를 추가합니다.

각 튜브에 pH 8.5를 추가합니다. 섭씨 4도 및 7, 500 RCF에서 35도 고정 각도 로터가 있는 원심분리기를 사용하여 샘플을 500마이크로리터로 농축합니다. 각 필터 아래의 트랩을 비운 후 샘플에 3ml의 버퍼를 더 추가하고 500마이크로리터로 농축합니다.

bissy acid protein assay를 사용하여 이전 단계를 4번 반복합니다. 각 샘플의 농도를 결정합니다. 라이소자임 샘플을 50밀리몰의 나트륨 보이드 버퍼로 희석하여 최종 농도가 150마이크로몰이

다음으로, 각 시료 530마이크로리터를 5mm NMR 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 D 2 O에 1 개의 2 DI CHLORO 에탄으로 표시된 탄소 13의 80 밀리 몰 원액을 준비하고, D, 2 O로 용액을 24 밀리 몰로 희석한 다음 동축 삽입 튜브로 옮겨 NMR 참조로 사용합니다. 실행 후 A 1D 양성자 탄소 H-S-Q-C-N-M-R은 각 공진의 피크 영역을 통합합니다.

초순수에 5밀리리터당 밀리그램의 라이소자임 용액을 준비합니다. 250마이크로리터의 라이소자임 용액을 깨끗한 1mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 pH 8에서 0.1 몰 트리스 용액 25 마이크로 리터와 밀리리터당 2 점 16 마이크로 그램 6 마이크로 리터를 추가합니다.

원심분리기 튜브에 대한 romanis 단백질 분해 아미노 펩티다아제 용액. 혼합물을 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 시료에 6마이크로리터의 아미노 펩티다아제 용액을 추가로 첨가하여 1-50몰 비율의 아미노 펩티다아제를 제공하고 섭씨 37도에서 추가로 20시간 동안 배양합니다.

그런 다음 C 18 스핀 컬럼을 사용하여 시료 30마이크로리터를 DESALT하고 0.1% TFA당 80% ACEDONITE 시험에서 시료를 용출하여 섭씨 영하 20도에서 시료를 보관합니다. maldi MS 분석을 위해, 앞서 설명한 바와 같이 NMR에 대한 나머지 단백질 샘플을 준비하고, 낮은 pH에서 라이소자임에서 pH 유도 화학 선택적 환원 탄소 13 메틸화 반응이 입증되었습니다. 반응은 측쇄 엡실론 아민보다 말단 말단 알파 아민을 선호하고 그 반대의 경우도 여기 NMR 스펙트럼에 설명된 바와 같이 높은 pH에서 선호합니다.

pH 10에서 반응한 라이소자임 샘플에는 피크 7이 없으며, 이는 피크 1 - 6이 엡실론 디메틸 아미노기에 속하고 피크 7이 말단 알파 디메틸 아미노기에 속함을 나타냅니다. 알파 아민은 환원성 탄소를 선호했다. pH 6에서 13 메틸화는 사용 된 탄소 13 포름 알데히드의 양이 2 대 7의 몰비로 감소되었을 때 관찰되었으며, 샘플은 여기에 설명 된 바와 같이 자연적 풍부 포름 알데히드와 더 이상 반응하지 않았으며, 낮은 pH에서의 메틸화는 모노 메틸 아민과 디메틸 아민의 혼합물입니다.

3개의 아미노기는 탄소 13 희미한 메틸화를 나타내며, 이는 이러한 그룹이 탄소를 나타내는 그룹보다 더 빠르게 반응했음을 나타냅니다.3개의 탄소 13 디메틸 아민 중 13개의 모노메틸. 피크 7은 가장 높은 강도를 가지며 피크 7의 할당을 확증하는 N termina 알파 디메틸 아민기로 할당되었습니다.

샘플을 사용하여 높은 pH에서 반응하여 N 말단 알파 아미노 그룹의 환원성 메틸화 속도를 변경할 수 있습니다. NMR 레지던트를 할당하기 위한 MS 보조 방법을 적용할 수 있습니다. pH 10에서 환원적으로 탄소 13을 메틸화한 라이소자임 시료를 트립신으로 분해하고 말디 TOF MS로 분석했는데, 이는 알파 아미노기가 환원적으로 탄소 13 메틸화되지 않았기 때문입니다.

이러한 조건에서 테트라 메틸화 N 말단 펩타이드의 MS 동위원소 프로파일을 사용하여 N 말단 엡실론 디메틸 아미노기에 통합된 탄소 13의 비율을 정량화할 수 있습니다. DIM 메틸화 N 말단 펩타이드 6 6 6 2 로 표시된 탄소 13 은 탄소의 비율을 조정했습니다. 동일한 라이소자임 샘플의 27% NMR 분석은 피크 6에 대해 33%의 탄소 13 혼입 비율을 제공했으며, 이는 피크 6이 말단 라이신 엡실론 탄소 13 디메틸 아민 말디, 처리되지 않은 아미노 펩티다제 처리된 라이소자임 샘플의 TOF 질량 스펙트럼임을 나타냅니다.

양성 대조군으로 사용된 인슐린은 원래 형태인 5731.2에 비해 평균 마스터 전하 비율이 더 낮아지는 변화를 보여줍니다. 처리된 라이소자임은 14305.8에서 13930.5로의 이동을 보여주며, 이는 라이소자임, 라이신, 발린 및 페닐알라닌의 처음 3개의 말단 말단 잔기의 손실에 해당합니다. 여기에 도시된 것은 대조 스펙트럼과 비교하여 환원적으로 처리된 탄소 13 리소자임 샘플의 처리되지 않은 및 아미노 펩티다아제 샘플의 NMR 스펙트럼이며, 처리된 아미노 펩티다아제 샘플의 스펙트럼은 피크 6 및 7에 대한 강도 감소를 보여주고 7A로 표시된 추가 피크 이 데이터에서 피크 6 및 7은 라이신으로 쌍으로 할당될 수 있습니다. 알파 및 엡실론 디메틸 아민.

이 절차를 시도하기 전에 단백질의 용해도, 다양한 ph를 고려하고 그에 따라 프로토콜을 조정하는 것이 중요합니다.