Name: 의 NMR 공명 확인하는 방법 13 C-디메틸 N-말단 아민 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 학습하세요 리소자임의 N-말단 라이신 α- 및 ε-디메틸아민 NMR 공명 신호를 할당하는 방법을. pH 유도 선택성 환원성 메틸화와 아미노펩티다스 효소 처리를 활용하여 단백질 구조 동역학을 연구합니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 국립연구자원센터(National Center For Research Resources)의 수상 번호 R00RR024105의 지원을 받았습니다.

1. 라이소자임의 환원적 메틸화
<ol>
	<li>pH 7.5에서 50mM 인산나트륨 완충액 500ml를 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.</li>
	<li>완전 라벨링된 샘플(FLS), 낮은 pH 부분 라벨링 샘플(LpH) 및 높은 pH 부분 라벨링 샘플(HpH)에 대해 3개의 1ml 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 부착합니다.</li>
	<li>라이소자임 10mg의 무게를 측정하고 인산나트륨 완충액 2ml에 용해시켜 5mg/ml 농도의 수용액을 만듭니다. 포름알데히드가 빛 노출로 인한 분해로부터 보호되도록 알루미늄 호일로 튜브를 덮습니다. 각 튜브에 500μl의 라이소자임 용액을 추가합니다.</li>
	<li>디메틸아민 보란 복합체(DMAB)와 13C-포름알데히드의 신선한 1.0M 용액을 준비합니다. 0 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>완전히 라벨링된 샘플의 경우 1:10(반응성 아민: 포름알데히드)의 몰비를 사용하고 부분적으로 라벨링된 샘플의 경우 1:5 비율을 사용합니다. 또는 비율을 최적화할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 pH에서 α-13C-디메틸아민 피크의 우세를 확인하기 위해서는 2:7 비율이 필요했습니다.</li>
	<li>FLS에 6.1μl의 1.0M DMAB를 첨가하고 LpH 및 HpH에 3.2μl의 1.0M DMAB를 첨가한 후 부드럽게 와류합니다. 그런 다음 FLS에 12.3μl의 1.0M-13C-포름알데히드를 추가하고 LpH 및 HpH에 6.1μl의 1.0M 13C-포름알데히드를 첨가합니다.반응 혼합물을 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다.</li>
	<li>이전 단계에서와 같이 1.0 M DMAB와 13C-포름알데히드의 또 다른 분취액을 첨가하고 총 반응 시간 18-24 시간 동안 4 °C에서 밤새 반응 혼합물을 흔듭니다.</li>
	<li>시료의 완충액을 pH 7.5의 인산염으로 교환하여 원심 필터(3kDa 분자량 기준)를 사용하여 과도한 시약과 부산물을 제거합니다.</li>
	<li>부분적으로 라벨링된 샘플의 경우, pH 7.5에서 자연적으로 풍부한 포름알데히드로 샘플을 환원적으로 메틸화하여 균질하게 변형된 단백질을 생성합니다. DMAB와 자연적 풍부도 포름알데히드의 새로운 1.0M 용액을 준비합니다.</li>
	<li>샘플 튜브를 호일로 덮고 LpH 및 HpH에 6.1μl의 DMAB를 첨가한 다음 부드럽게 와류를 수행합니다. 그런 다음 12.3 μl의 자연 풍부 포름 알데히드를 첨가하십시오. 반응 혼합물을 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다.</li>
	<li>이전 단계에서와 같이 1.0 M DMAB와 자연적 존재량 포름알데히드의 또 다른 부분 표본을 첨가하고 총 반응 시간 18-24시간 동안 4°C에서 밤새 반응 혼합물을 흔듭니다. 그런 다음 2.5-2.6단계를 사용하여 버퍼를 교환하고 MS를 위해 -20°C에서 50μg 샘플을 보관합니다.</li>
</ol>
2. NMR 분석을 위한 샘플 준비
<ol>
	<li>pH 8.5 in H2O에서 2.0M 붕산나트륨 완충 용액을 준비합니다.</li>
	<li>375μl의 2.0M 붕산나트륨 완충액을 4개의 15ml 원뿔형 튜브에 추가합니다. 상판을 파라필름으로 만들고 구멍을 뚫습니다. 플라스크를 동결 건조 플라스크에 넣고 샘플을 얼립니다.</li>
	<li>냉동 샘플을 동결 건조기에 올려 건조시킵니다. 건조되면 제거하십시오.</li>
	<li>피펫을 사용하여 각 튜브에 D2O 15ml를 넣고 섞습니다.</li>
	<li>3개의 4ml 원심 필터(3kDa 분자량 기준)에 FLS, LpH 및 HpH로 라벨을 붙입니다.해당 샘플을 필터 튜브(~500μl)에 추가합니다. pH 8.5의 50mM 붕산나트륨 완충액 3.0ml를 각 튜브에 추가합니다. 세 번째 튜브용 밸런스 튜브를 만들고 4°C 및 7,500rcf에서 35° 고정각 로터가 있는 원심분리기를 사용하여 샘플을 500μl로 농축합니다.</li>
	<li>각 필터 아래의 트랩을 비웁니다. 샘플에 3.0ml의 완충액을 더 추가하고 샘플을 다시 500μl로 농축합니다. 2.5 4x 단계를 반복합니다.</li>
	<li>비신초닌산(BCA) 단백질 분석36을 사용하여 각 샘플의 농도를 측정합니다. 라이소자임 샘플을 50mM 붕산나트륨 완충액으로 희석하여 150μM 샘플을 만듭니다.</li>
	<li>530μl를 5mm NMR 튜브로 전달하거나 250μM를 5mm 자기 감수율 일치 튜브로 전달합니다.</li>
	<li>D2 O에서 1,2-dichloroethane-13 C2 의 80 mM 원액을 준비합니다. 이 원액을 -80 °C에서 보관하십시오. 80 μl에서 24 mM로 희석하고 동축 삽입 튜브로 옮겨 NMR 분석에서 참조로 사용합니다. NMR로 샘플을 분석합니다. 참고: 1D 1 H-13C HSQC를 실행하고 각 공진에 대한 피크 면적을 적분합니다. 피크 면적은 완전히 라벨링된 샘플에 대해 동일해야 합니다.</li>
</ol>
3. 라이소자임의 아미노펩티다아제 분해
<ol>
	<li>초순수에 라이소자임 5mg/ml 용액을 준비합니다.</li>
	<li>라이소자임 용액 250μl를 깨끗한 1ml 원심분리 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>0.1M 트리신 용액 25μl, pH 8.0 및 2.16μg/ml Aeromonas proteolytica 아미노펩티다아제 용액 6μl를 추가합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 6 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>2.16μg/ml 아미노펩티다아제 용액 6μl를 샘플에 추가하여 아미노펩티다아제와 라이소자임의 1:50 몰 비율을 만듭니다. 37 °C에서 20 시간 더 배양하십시오.</li>
	<li>C18 스핀 컬럼을 사용하여 시료 30μl를 탈염합니다(제조업체의 프로토콜 준수). MALDI MS 분석을 위해 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>프로토콜 2)에 설명된 대로 NMR에 대한 나머지 단백질 샘플을 준비합니다.</li>
</ol>
4. 질량 분석을위한 샘플 준비
<ol>
	<li>2.3단계에서 보존한 50μg의 샘플을 사용하여 완충액을 100mM 중탄산암모늄, pH 8.0으로 교환하고 1ml 원심 필터(3kDa 분자량 컷오프)를 사용하여 농축액을 약 50μl로 교환합니다. 샘플을 1ml 원심분리기 튜브에 옮기고 알루미늄 호일로 감쌉니다.</li>
	<li>2.0μl의 500mM 디티오트레이톨을 첨가하여 이황화 결합을 줄입니다. 용액을 60°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>갓 준비한 500mM 요오드아세트아미드 2μl를 첨가하여 티올기를 알킬화합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>호일을 제거하고 1.0 μl의 500 mM dithiothreitol 용액을 첨가하여 반응을 냉각시킵니다.</li>
	<li>단백질을 소화하기 위해 2.0μg의 염기서열분석 등급 트립신을 첨가합니다. 혼합물을 37 ° C에서 16-24 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>pH가 2 미만이 될 때까지 TFA를 첨가하여 분해를 담금질합니다. (포름산과 아세트산도 사용할 수 있습니다)</li>
	<li>C18 스핀 컬럼에서 시료를 탈염하고 단백질을 80% 아세토니트릴/0.1% TFA로 용리시킵니다. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다.</li>
	<li>MALDI MS 분석을 위해 5.0μl의 50% 아세토니트릴/0.1% TFA로 샘플을 재구성합니다. MALDI 타겟 플레이트에서 동일한 부피의 재구성된 샘플과 2,5-디하이드록시벤조산 매트릭스 용액의 포화 용액을 혼합합니다. MALDI MS에서 시료를 분석합니다. 참고: 탠덤 MS를 사용하여 펩타이드 피크의 정체를 확인합니다. 질량 스펙트럼을 매끄럽게 하고 분석합니다. 각 디메틸아민 함유 펩타이드에 대해 프로파일에 있는 각 동위원소의 피크 강도와 피크 면적을 측정합니다. 앞에서 설명한 대로 13C-혼입의 백분율을 계산합니다34.</li>
</ol>

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</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

환원적으로 13개의 C-메틸화 단백질의 NMR 신호를 할당하는 것은 이 동위원소 표지 방법을 완전히 활용하는 데 필요합니다. 부분 13C-혼입 데이터의 상관 관계를 통해 NMR 신호 할당을 돕기 위해 MS를 사용하는 것은 유망한 기술입니다. 다른 할당 방법에 비해 이 기술의 장점은 1차 아미노산 서열만 필요하다는 것입니다. α-디메틸아민과 ε-디메틸아민의 13C-혼입은 MS로 별도로 측정할 수 없기 때문에 N-말단 아미노산이 라이신일 때 MS 보조 할당 방법이 제한됩니다. 적정 실험은 일반적으로 α-디메틸아민 화학적 이동의 pH 의존성을 보여주지만 염교 및 기타 구조적 기여로 인해 화학적 이동은 신뢰할 수 없는 할당 방법입니다. 제시된 방법을 사용하면 이 문제를 해결할 뿐만 아니라 MS로 α- 및 ε-디메틸아미노 펩타이드에 대한 개별 13C% 혼입을 측정하는 문제를 피할 수 있습니다. 하나의 부위에 라벨이 붙어 있기 때문에 1...

핵자기공명(NMR) 분광법은 단백질에 대한 귀중한 구조 규명 도구입니다1. NMR 분광법은 네이티브 상태에서 단백질의 용액 구조를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 안정한 자기 동위원소의 낮은 자연적 풍부함을 극복하기 위해서는 13C 및 15N을 관심 단백질에 통합해야 합니다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 박테리아 숙주에서 재조합 발현입니다2-3. 그러나 박테리아 숙주 과발현의 두 가지 단점은 번역 후 변형을 일으킬 수 없고 모든 단백질3-4에 작용하지 않는다는 것입니다. 박테리아 발현이 단백질 생산에 실행 가능한 경로가 아닌 경우 비박테리아 숙주에서 과발현을 사용할 수 있지만 동위원소 표지는 어렵고 비용이 많이 듭니다5. NMR 분석을 위해 13C및 15N동위원소를 단백질에 통합하기 위한 대체 발현 방법에는 메틸 표지6 및 단일 13C, 15N아미노산7-9를 위한 대사 전구체를 사용하는 희소 표지 기술이 포함됩니다. 본원에 사용된 희소 표지에 대한 화학적 접근법은 잘 확립된 환원성 13C-메틸화 반응(그림 1)이며, 여기서 단백질의 1차 아미노기인 N-말단 α-아민 및 라이신, 측쇄 ε-아민이 메틸화됩니다. 일단 monomethylamines가 형성되면, 아민은 즉시 dimethylamines를 형성하기 위하여 더 높은 pKa 가치 때문에, 즉시 메틸화를, 다시 겪습니다.
환원적 메틸화는 Means와 Feeney10에 의해 단백질을 화학적으로 변형하는 방법으로 처음 도입되었습니다. 이 반응의 장점은 완충 된, 생리적 pH 및 저온11,12에서 광범위한 적용 가능성과 온화한 반응 조건입니다. 포름 알데히드 및 환원제, 디메틸 아민 보란 복합체 (DMAB)와 같은 존재하에서, 라이신 ε - 아미노 그룹 및 N- 말단 α- 아미노 그룹은 선택적으로 메틸화 되어 디메틸화 된 아민을 생성한다. 포름 알데히드는 메틸렌 다리의 형성을 통해 단백질을 가교하는 것으로 알려져 있지만,이 과정은 환원제13 , 14에 의해 차단됩니다.
환원적 메틸화는 NMR과 X선 결정학으로 단백질을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 환원성 메틸화(Reductive methylation)는 다른 방법으로는 다루기 어려운 단백질의 결정화를 촉진하기 위해 사용된다15. 암탉 난자 흰자 라이소자임은 디메틸화 형태로 결정화된 최초의 단백질이었습니다. 메틸화 된 라이소자임 구조와 메틸화되지 않은 라이소자임 구조에서 무거운 원자 사이의 제곱 평균 제곱근 차이는 0.40 Å16입니다. 이 비교는 단백질 구조가 환원성 메틸화 후에도 유지될 수 있음을 보여주며, 반응을 구조 규명을 위한 실행 가능한 라벨링 도구로 만듭니다.
환원성 메틸화 반응에서 13개의 C 표지 포름 알데히드를 사용하여 13개의 C- 디메틸화 아민이 생성됩니다. 13개의 C-디메틸아민은 단백질 역학, 구조 및 기능을 연구하는 데 널리 사용되는 NMR 검출 가능한 프로브입니다. NMR 및 환원성 13C-메틸화는 β2 아드레날린성 수용체17, 리보뉴클레아제 A18, 라이소자임19, fd 유전자 5 단백질20 및 시토크롬 c21에 대한 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 유사하게, 13C-메틸화 리보뉴클레아제 A22, 라이소자임23, fd 유전자 5 단백질24, 클로스트리듐 파스퇴리아눔 페레독신25, IgG26의 Fc 단편, 아포지단백 A-I27 및 MIP-1α28의 구조적 및 기능적 특성은 콘카나발린 A29-30 및 칼모듈린31에 대해 연구되었습니다.
환원적 13C-메틸화는 NMR로 단백질을 연구하는 데 널리 사용되었지만, 라벨링 방법은 NMR 공명26을 할당하는 어려움으로 인해 항상 제한되어 왔습니다. 환원적으로 13C- 메틸화 된 단백질에 대한 대부분의 할당 전략은 소수의 부위, 20, 28 개의 알려진 구조적 특성11 , 19 , 23 , 26 , 31 , 32 에 의존했습니다. 또는 광범위한 유전자 변형33. 이러한 연구 중 어느 것도 13개의 C-디메틸아민 피크를 모두 성공적으로 할당하지 못했으며, 칼모듈린 연구를 제외하고는 피크가 각 라이신의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 할당되었습니다33. MIP-1α 이량체 형성에 대한 연구에서, 환원적으로 13C- 메틸화 아민의 NMR 할당을 돕기 위해 질량 분석법 (MS)을 사용하는 것이 처음보고되었습니다28. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) MS를 사용하여 이량체 계면에서 라이신을 식별했습니다. 인간 MIP-1α 트립틱 펩타이드의 부분적으로 메틸화된 리신은 MS로 확인되었으며 2D, 1, H-13, C, HSQC, NMR 스펙트럼28에서 관찰된 온전한 단백질의 모노 및 디메틸아민 신호의 출현과 상관관계가 있었습니다. 우리 그룹은 MS의 사용을 확대하고 아미노산 서열34 외에 단백질의 구조나 특성에 대한 사전 지식이 필요하지 않은 할당 방법을 제시했습니다. 이 방법은 대부분의 단백질에 적용할 수 있습니다. 한 가지 예외는 단백질에 N-말단 라이신이 있는 경우인데, 이는 N-말단 라이신 α 및 ε-13 C-디메틸아민의 MS 동위원소 프로파일을 독립적으로 측정할 수 없기 때문입니다.
여기에서는 N-말단 라이신 잔기의 N-말단 α-디메틸아민과 측쇄 ε-디메틸아민 부위를 식별하기 위해 화학적 방법과 효소적 방법의 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 Córdova et al.에서 영감을 받았습니다.단백질 아세틸화의 선택성을 조절하기 위해 pH를 사용한 사람35. 이 반응은 낮은 pH에서 N-말단 α-아민과 높은 pH에서 측쇄 ε-아민을 선호하여 모세관 전기영동을 사용하여 연구에서 단백질 α 및 ε-아미노기를 구별할 수 있습니다35. 우리는 환원성 13C-메틸화 반응을 사용하여 단백질 아미노 그룹의 표지를 변경하고 MS 보조 할당 전략을 적용할 수 있도록 하기 위해 높은 pH와 낮은 pH를 사용하는 방법을 보여줍니다. N-말단 α- 및 ε-13C-디메틸아민을 할당하는 두 번째 방법은 재조합 Aeromonas proteolytica aminopeptidase를 사용하여 N-말단 잔류물을 선택적으로 제거하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 울트라 4ml 원심 필터(3k MWCO)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>UFC800308(8pk)</td><td></td></tr><tr><td>아미노펩티다아제</td><td>크리에이티브 바이오마트</td><td>아미노펩티다제-86A</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모</td>늄 <td>시그마</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>시그마</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>보란-디메틸아민 복합체</td><td>시그마</td><td>180238</td><td>사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장 인슐린</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 스핀 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dichloroethane-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>-80°C에서 저장된 80mM 원액. 24mM에서 NMR 스펙트럼에서 참조로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>포름알데히드(36.5% wt/wt)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.</td></tr><tr><td>13C-포름알데히드 (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.</td></tr><tr><td>라이소자임(암탉 달걀 흰자)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(이염기성 헵타하이드레이트)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(일염기)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>트리신</td>, <td>시그마</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>시그마</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700MHz Varian VNMRS, 5mm HCN 5922 프로브</td><td>애질런트 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 nmr 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; c-디메틸 n-말단 아민

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 단백질 구조 및 동적 연구 입증 된 기술이다. NMR로 단백질을 연구하기 위해, 안정적인 자기 동위 원소는 일반적으로 감도를 개선하고 순차적 공명 할당을 허용 대사 포함된다. 환원 13 C-메틸화를 통해 표현 박테리아 숙주, 동위 원소 결합하는 가장 일반적인 방법에 순종하지 않는 단백질에 대한 대체 표시 방법입니다. 환원성 13 C-메틸화는 13 C-디메틸 아미노 그룹으로의 단백질의 일차 아미노기 (라이신의 ε-아미노기와 N-말단 α-아미노기를) 수정 온화한 조건 하에서 수행 화학 반응이다. 대부분의 단백질의 구조와 기능은 그 대사 라벨링에 대한 실행 가능한 대안 만들기, 수정에 의해 변경되지 않습니다. 환원 13 C-메틸화는 스파 스, 동위 원소 라벨, N을 할당하는 전통적인 방법을 추가하기 때문에MR 신호는 적용되지 않습니다. 단백질 (13) C-디메틸 NMR 신호의 할당을 돕기 위해 질량 분석기 (MS)를 사용하여 대안의 할당 방법이 개발되었다. 이 방법은 각각의 차 아미노기에 13 C-라벨의 부분과 다른 양에 의존한다. Lys1의 α-및 ε-다이 메틸 아미노 그룹이 개별적으로 MS로 측정 할 수 없기 때문에, 단백질의 N-말단 잔기가 리신 때 방법의 제한이 발생한다. 이 한계를 회피하기 위해,이 방법은 N-말단 α-아민 및 측쇄 ε-아민 모두와 연관된 13 C-NMR dimethylamines의 공진을 식별하는 기술된다. N-말단 α-디메틸 아민과 암탉 흰자 리소자임, Lys1의 사이드 체인 ε-디메틸 아민의 NMR 신호는 1 H-13 C 헤테로 핵 단일 양자 간섭 스펙트럼에서 확인된다.

환원적 메틸화 및 pH
리소자임에서 pH 유도 화학 선택적 환원적 13C-메틸화 반응이 입증되었습니다. 낮은 pH에서 반응은 측쇄 ε-아민보다 N-말단 α-아민을 선호하며, 높은 pH에서는 그 반대가 됩니다. 용액 내에서 단백질의 아미노기는 유리 아민과 짝산 사이의 평형 상태로 존재하며, 이는 pH로 조절 가능합니다. 이 반응의 최적 pH 범위는 사용되는 환원제에 따라 다릅니다. 이 경우, 디메틸아민 보란의 최적 pH는 7.0-9.0입니다. 환원제의 최적 범위를 벗어나 작업하면 반응 효율이 떨어지는데, 이는 본 실험에서는 오히려 장점이 됩니다. 환원적 메틸화 반응은 α-아민의 산 해리 상수(pKa)가 (~7)23로 ε-아민(~10)32보다 낮기 때문에 pH 6.0에서 우선적으로 N-말단 α-아민을 변형시킵니다. pH 6.0에서 평형은 짝산 쪽으로 급격히 치우치며, α-아민이 ...

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

이 절차의 전반적인 목표는 알파 및 엡실론 탄소를 할당하는 것입니다. 13 디메틸 아민 NMR 말단 라이신의 공명, 라이소자임 잔류물. 이것은 먼저 낮은 pH와 높은 pH에서 탄소 13 포름알데히드의 기하학적 양으로 라이소자임을 환원적으로 메틸화함으로써 달성됩니다.두 번째 단계는 포름알데히드가 완전한 메틸화를 위해 자연적으로 과도하게 낮은 pH 및 높은 pH 샘플을 환원적으로 메틸화하는 것입니다. 마지막 단계는 NMR 분석을 위해 환원성 메틸화 샘플을 D2O 완충액으로 완충 교환하는 것입니다. 두 번째 방법에서는 라이소자임 샘플의 아미노 펩티다아제 분해를 통해 목표를 달성할 수 있습니다.두 번째 단계는 절단된 단백질 샘플을 과량의 탄소 13 포름알데히드로 환원적으로 메틸화한 다음 NMR 분석을 위한 완충액 교환입니다. 궁극적으로 NMR 분광법은 할당을 위해 탄소 13 메틸 공명이 없음을 보여주는 데 사용됩니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 알파 및 SSON 디메틸 라민과 단백질 내부 라이신의 ML 공진을 명확하게 할당할 수 있다는 것입니다. F-L-S-L-P-H 및 HPH가 있는 1밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 3개는 pH의 6에서 이전에 준비된 완충 용액에 3개의 라이소자임 샘플을 용해합니다. 7.5 및 10을 사용하여 밀리리터당 5밀리그램의 최종 농도를 제공합니다.튜브 덮개를 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로 인한 열화를 방지합니다. 그런 다음 이전에 준비된 1 몰 디메틸 아민 보링 복합체 용액 6.1 마이크로 리터를 FLS 튜브에 추가하고 동일한 용액 3.2 마이크로 리터를 LPH 및 HPH 튜브에 추가합니다. 혼합물을 부드럽게 와류로 만든 후 이전에 준비된 1 몰 탄소 13 포름 알데히드 용액 12.3 마이크로 리터를 FLS 샘플에 첨가하고 동일한 용액 6.1 마이크로 리터를 L-P-H-N-H-P-H 샘플에 첨가합니다.반응 혼합물을 섭씨 4도에서 2시간 동안 흔듭니다. 동일한 부분 표본의 DMAB와 탄소 13 포름알데히드를 해당 튜브에 첨가하여 이전 단계를 반복합니다. 반응 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 흔들어 총 반응 시간 18-24 시간 동안 흔들고, 각 샘플의 완충액을 pH 7.5에서 3 밀리리터의 인산염 완충액으로 교환하여 3 킬로달톤 분자량 컷오프에서 원심 필터를 사용하여 과도한 시약 및 부산물을 제거하고, 섭씨 4도 및 7도에서 35도 고정 각도 로터가 있는 원심 분리기를

methods-to-identify-nmr-resonances-13c-dimethyl-n-terminal-amine-on

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

포유류 뇌의 신경 화학은 많은 신경 및 전신 질환에서 변화합니다. 대뇌 대사 산물의 특징적인 프로파일은 뇌 조직의 미가공 추출물을 기반으로 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이를 위해 고해상도 NMR 분광법을 사용하여 대사 산물 농도(대사체학)에 대한 상세한 정량 분석이 가능합니다.

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

이 문서에서는 열 불활성화를 기반으로 한 시료 준비 방법을 설명하여 내인성 펩티드를 보존하여 분해 후 모독을 피하고, 동위원소 라벨링과 LC-MS를 사용하여 상대적 수량을 유지합니다.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

학습하세요 리소자임의 N-말단 라이신 α- 및 ε-디메틸아민 NMR 공명 신호를 할당하는 방법을. pH 유도 선택성 환원성 메틸화와 아미노펩티다스 효소 처리를 활용하여 단백질 구조 동역학을 연구합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법

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