Name: 생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 BRET 기술을 이용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을. 포유류 세포에서 YFP와 루시퍼라이즈 융합 단백질을 발현시켜 실시간으로 상호작용을 관찰하고, 병원성 돌연변이의 영향을 평가할 수 있습니다.

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플라스미드의 1. 만들기 <ol><li> (그림 1) 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 모두 pLuc 및 pYFP 벡터로 그 각각의 단백질의 cDNA를 서브 클론. 자세한 프로토콜의 경우 녹색 등의 알 (13)에게 참조하십시오. </li><li> 순서는 모든 관심의 단백질이 중간에 정지 코돈을 가진 배낭 / YFP 시퀀스 프레임에 있는지 확인하기 위해 생성합니다. </li><li> 융합 단백질은 생물학적 활성을 유지하는 것이 확인 원하는 기능 분석을 수행합니다. 여기에 제시된 경우 YFP 융합 단백질의 세포 내 국소화 형광 현미경에 의해 확인 하였다. </li><li> pLuc 및 pYFP 발현 벡터에 관련 타겟팅 신호를 공학에 의해 적절한 루크와 YFP 제어 단백질 발현 플라스미드를 확인합니다. 여기에 제시된 경우, pLuc 및 pYFP 벡터로 핵 지방화 신호를 삽입하여 핵 대상 루크와 YFP 구조를 생성합니다. </li><li> 확인배낭 및 YFP는 단일 폴리펩티드에 융합 된 양성 대조군 구조체. 여기에 제시된 경우, YFP 코딩 서열이 pLuc 벡터에 삽입 한 양성 대조군을 생성한다. </li><li> 형질 감염 혼합물에 DNA의 질량을 등화하는 데 사용되는 중간 필러 플라스미드를 선택한다. 더 진핵 생물의 프로모터가없는 플라스미드를 사용하기 때문에 이러한 박테리아 클로닝 벡터와 같은 포유 동물 세포에서 전사적으로 비활성화됩니다. </li></ol> DNA 믹스 2. 준비 <ol><li> 260 nm에서의 흡광도에 기초하여 제 1 절에 설명 된 모든 플라스미드의 농도를 추정 (한 흡광도 유니트는 50 ㎍ / ml의 DNA에 상당). 650 Da 님 염기쌍의 개수를 곱하여 각 플라스미드의 분자량을 결정한다. 각 플라스미드 제제의 몰 농도를 계산하는 농도 및 분자량을 사용한다. 36 ㎚의 농도로 플라스미드 DNA 제제를 희석. 이러한 작업을 보유하고있을 것즉, 형질 감염을위한 DNA 혼합물을 제조하는데 사용될 것이다. </li><li> 물 20 ㎕의 최종 부피 필러 플라스미드 1800 NG 함유 제어 DNA 혼합물을 준비한다. </li><li> pLuc 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다. </li><li> pLuc 제어 구조의 5 μL와 pYFP 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다. </li><li> 긍정적 인 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다. </li><li> 다음 DNA는 관련 pLuc이 구성의 5 μL와 PY의 5 μl를 결합하여 각 DNA 믹스의 경우 관심, X의 단백질의 homodimerization에 대한 테스트를 혼합 준비FP는 구성. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다. A) pLuc 제어 및 pYFP-X B) pLuc-X 및 pYFP 제어 C) pLuc-X 및 pYFP-X </li><li> 다음 DNA가 관심의 단백질의 쌍 사이의 상호 작용에 대한 테스트를 믹스 준비, X와 Y는 각각의 DNA 믹스는 관련 pLuc이 구성의 5 μl를 결합하고 pYFP의 5 μL를 구성합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다. A) pLuc 제어 및 pYFP-X B) pLuc-X 및 pYFP 제어 C) pLuc 제어 및 pYFP-Y D) pLuc-Y와 pYFP 제어 E) pLuc-X 및 pYFP-Y F) pLuc-Y와 pYFP-X </li></ol> 3. 형질 <ol><li> 수확 75cm 2 플라스크에서 HEK293 세포를 subconfluent. 문화 매체의 13 ML에 전체 세포의 10 %를 희석. 백색의 각 웰에 세포 현탁액 130 μl를 분배클리어는 96 - 웰 조직 배양 접시 바닥. 24 시간 동안 배양 세포. </li><li> (3)에 의해 DNA 혼합물의 수를 곱함으로써 형질 감염 될 웰의​​ 수를 계산한다. 실온까지 무 혈청 배지를 가져온다. 무 혈청 배지의 6.3 μL 잘 당 0.18 μL 형질 전환 시약을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이로 교반하여 혼합하고 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 무 혈청 배지 / 형질 전환 시약 마스터 믹스 20 ㎕로 DNA 믹스의 2 μl를 추가하여 형질 믹스를 준비합니다. 없는 소용돌이를 수행합니다. 10 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 물론 당 형질 믹스의 6.5 μl를 분배 각 형질 믹스 세 우물을 형질. 추가로 36 ~ 48 시간 동안 배양 세포. </li></ol> 브레 신호 4. 측정 <ol><li> 소용돌이로 교반하여 DMSO에 34 ㎎ / ㎖에서 살아있는 세포 루시 페라 제 기판을 녹입니다. </li><li> 기판 희석 매체 (P)에 1:1,000로 재구성 살아있는 세포 루시페라아제 기판 희석37 ° C.에 다시 따뜻하게 50 기판 희석 매체 ㎕의 당을 잘 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이. 침전물을 형성 할 수 있지만, 분석을 방해하지 않을 것이다. </li><li> 96 - 웰 플레이트에서 문화 매체를 대기음. 각 웰에 희석 살아있는 세포 루시 페라 제 기판의 50 μl를 분배. 적어도 2 시간 (최대 24 시간) 배양 세포. </li><li> 96 - 웰 플레이트로부터 뚜껑을 제거하고 내부 조도계 실온에서 10 분 동안 플레이트를 배양한다. </li><li> 물론 한 번에 루크와 YFP 하나에서 방출을 측정한다. 이상 470 nm의보다 파장을 차단하는 필터를 사용하여 루크에서 방출을 측정한다. 500-600 nm의 대역 통과 필터를 사용 YFP에서 발광을 측정한다. 10 초 동안 방출 신호를 통합 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 만 필러 플라스미드를받은 3 우물에서 루크 방출 수치를 평균. 배경 차감-Luc에서 방출 값을 생성하기 위해 다른 모든 배낭 방출 판독 현재 값을 뺀다.</li><li> 만 필러 플라스미드를받은 3 우물에서 YFP 방출 수치를 평균. 배경 차감-YFP 방출 값을 생성하기 위해 다른 모든 YFP 방출 판독 현재 값을 뺀다. </li><li> 각 웰의 경우, 나안 BRET 비율을 수득 배경 차감-Luc에서 방출 값 - 배경 차감 YFP 방출 값을 나눈다. </li><li> 만 pLuc 제어 플라스미드로 형질 된 세 개의 우물에서 수정되지 않은 BRET 비율을 평균. 보정 BRET 비율을 제공하기 위해 모든 다른 나안 BRET 비율 현재 값을 뺀다. </li><li> 보정 BRET 비율의 나머지 세트의 각각에 대해, 최종 BRET 비율을 구하는 세 형질 감염된 웰의 값을 평균. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

융합 단백질 발현 구조물의 설계는 BRET 분석을 설정하는 중요한 단계이다. 여기에 제시된 실험에서, 관심의 단백질은 루시 페라 제 또는 YFP의 C-말단에 융합되었다. 또한 가능하고, 루시퍼 / YFP의 N-말단에 단백질을 융합하기 위해 필요할 수 있습니다. 일부 단백질의 경우, 융합체는 단백질 구조와 기능의 혼란을 피하기 위하여 N-또는 C-말단 중 하나에서 허용 될 수있다. 또한, 막 횡단 단백질있는 N과 C 말단은 루시퍼 라제 / YFP 단백질 상호 작용 파트너와 같은 구획에 말단에 융합되어야 상이한 세포 내 구획에 상주. 예를 들면, 막 관통 G-단백질 결합 수용체 세포질 β-arrestin는 간의 상호 작용의 연구에서, 루시퍼 라제는 막 횡단 수용체 (8)의 세포 내 카복실 꼬리에 융합시켰다. 다른 경우에는 단백질 - 단백질 interacti의 형상에 에너지 전달이 융합 단백질의 두 가지 조합 중 하나를 사용하여보다 효율적으로되는 발생할 수 있습니다. 때때로 에너지 전달은 거짓 부정적인 결과로 이...

서열은 인간 질환의 분석 고전 링키지 차세대 모두 생물학적 경로의 범위에 관련된 단백질의 임상 적 관련성을 공개한다. 그것은 이전에 이러한 연구에서의 식별에,이 단백질의 생물학적 역할을 거의 또는 전혀 조사가되어 있는지, 자주 경우입니다. 그 단백질의 생물학적 기능을 탐험 시작하는 한 유익한 수단은 생리 학적 맥락에서 상호 작용하는 다른 어떤 단백질을 식별하는 것입니다. 이 방식으로 분자 네트워크를 특성화하는 것은 인간의 표현형의 기초가되는 생물 학적 경로에 대한 통찰력을 제공합니다. 가장 자주 사용되는 대규모 스크리닝은 또한 단백질 후보 상호 작용 파트너를 식별하기위한 접근법 효모이 - 하이브리드 스크리닝 1 및 질량 분석 기반 단백질 체학이있다. 이러한 방법은 잠재적 인 상호 작용하는 단백질을 제안에 매우 성공적으로 될 수 있지만 아칸소 할 수 있습니다거짓 긍정적 인 결과에 취약 전자. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석법 스크리닝에 의해 식별 상호 작용의 확인은 제 기술을 사용하여 상호 작용의 확인을 요구한다. 일반적으로 공동 면역 또는 풀다운 분석은 이러한 목적으로 3에 사용됩니다. 검증에 대한 그러한 기술을 사용하는 한 가지 단점은 특정 단백질 상호 작용을 유지하기 위해 필수적 일 수있다 세포 내 조건을 파괴하는 세포 용해를위한 필요 조건이다. 두 번째 단점은 약하거나 과도 단백질 상호 작용은 세척 단계에서 중단 될 수 있다는 것이다. 또한, 이들 분석법은 중요한 실제적인 시간을 요구를 동시에 처리 할 수​​있는 샘플의 수에 한정되며, 종종 시약 및 프로토콜의 시간 소모적 인 최적화를 필요로한다. 공동 면역 침전 실험과 관련된 문제들을 극복하기 위해, 몇개의 형광 분석법과 biolum 기반으로 개발되어왔다생균에 사용될 수 inescent 단백질. 최초의 분석은 형광 (또는 포스터) 공명 에너지 전달 (FRET), 중복 방출 및 여기 스펙트럼 4 개의 형광 단백질 사이의 에너지의 비 복사 열전달에 근거했다. 에너지 전달의 효율성 따라서 FRET 현상의 관찰은 기증자와 수용체 형광이 가까이에 있어야 강하게 거리에 의존합니다. 및 수용체의 형광 (일반적으로 노란색 형광 단백질, YFP)과의 융합으로 두 번째, 그 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 기증자 형광 (CFP 일반적으로 시안 형광 단백질)를 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 CFP 기증자에 YFP 수용체의 상대에서 빛의 방출의 측정 증가시킬 것이다, 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까이 기증자와 수용체 형광을 가져올 수 있습니다. FRET는 살아있는 세포 4의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출에 성공했다. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 FRET 사용의 주된 단점은 도너 형광 물질의 여기를위한 외부 조명을위한 필요 조건이다. 발광 신호 수용체의 원치 않는 여자, 기증자와 수용체의 형광 모두의 광표백 높은 배경의 외부 조명 결과. 이러한 효과는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 분석의 민감도를 감소시킨다. 외부 조명에서 높은 배경의 문제를 극복 FRET 분석의 수정은 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 분석 5,6입니다. 브렛 시스템에서 기증자 형광은 루시 페라 제 효소에 의해 대체된다. 따라서 셉터 형광체의 여기를위한 에너지는 불필요한 외부 조명 렌더링 루시퍼 기판의 산화에 의해 시스템 내에서 생성된다. 대부분의이 분석의 일반적인 구성, 기증자는 레 닐라 루시 페라 제를 레니 포르 미스 및 수용체가 (다른 기증자와 수용체 단백질에 대한 설명 피플 등. 5 참조) YFP입니다. 따라서, 이러한 시스템에서는, 그 단백질은 루시퍼 라제 및 잠재적으로 상호 작용하는 단백질 YFP로, 또는 그 반대에 융합된다. 브렛 분석은 루시 페라 제에 대한 기질로 엘렌 테라를 추가해야합니다. 엘렌 테라 세포 투과성이므로, 생균에 BRET 분석법을 수행하는 것이 가능하다. 그러나, 네이티브 엘렌 테라는 수용액 중에 불안정하고, 엘렌 테라의 효소 독립적 고장 분석이 가능하고, 기판의 농도를 감소시키고, 루시퍼 라제 활성의 측정의 감도를 감소 autoluminescence를 생성 둘. 생균의 BRET의 사용은 수용액 중에서 안정하지만, 세포질 에스 테라 제에 의해 절단되어 보호 coelenterazines의 발달에 의해 촉진되었다세포 내에서 활성 7 엘렌 테라를 생성하는 세포의 막에 걸쳐 확산 이후의. 루시퍼 라제 및 YFP 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 기질을 첨가 한 다음, 단백질 - 단백질 상호 작용으로 인해 발생하는 에너지 전달은 루시퍼 라제 및 YFP로부터 방출 모니터링에 의해 정량화된다. 단백질 상호 작용은 멀티 웰 플레이트의 생균 직접 모니터링 할 수 있기 때문에, BRET 분석은 비용 및 시간 효율적인 추정 적 상호 작용을 검증하기위한 단순하고 확장 가능한 방법을 구성한다. 프로테오믹스 스크리닝 연구에서 확인 된 추정 인터랙 유효성 외에 BRET 시스템은 또한 단백질의 생화학 적 및 구조적 종래 연구에서 발생하는 테스트 후보 인터랙하는데 사용될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용의 존재는 (BRET 분석법을 사용하여 또는 다른 기술에 의해 어느) 설정되면 BRET 분석은 EMP 되려면 전위있어loyed 더욱 상호 작용을 특성화. 예를 들어, 상호 작용 영역은 단백질의 절단 된 버전을 생성하여 매핑 할 수 있고, 상호 작용의 특정 잔기의 참여는 점 돌연변이를 생성함으로써 입증 될 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 전사 후 수정하거나 (예 : 약물이나 리간드 등) 작은 분자의 조절 성 효과는 8-10를 조사 할 수 있습니다. 브렛 분석은 환자의 DNA에서 확인 된 변이를 조사하는 큰 잠재력이있다. 경우에 돌연변이의 원인이되는 역할은 브렛은 표현형 (11)의 분자 원인에 대해 더 보여줄 수 있습니다 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 돌연변이의 효과를 연구, 설립 된 곳. 몇몇 잠재적으로 파괴적인 돌연변이가 RELE가되는 불분명 한 경우에, 개별 내에서 식별 될 차세대 시퀀싱 방법의 출현 때문에, 점점 더 일반적인표현형 12 원하시오. 이 상황에서 브렛 분석은 단백질 기능에 돌연변이의 영향을 평가하는 가치와 장애에 따라서 자신의 관련성을 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Nanodrop</td><td></td><td>260nm에서 흡광도를 판독할 수 있는 모든 분광 광도계가 적합합니다. 플라스미드의 분자량을 측정하는 것은 transfection mix에 사용할 DNA 양을 계산하는 데 중요합니다.</td></tr><tr><td>96-마이크로웰 플레이트, 평평한 바닥, 흰색</td><td>Greiner Bio One</td><td>655098</td><td>White 플레이트는 웰 간의 누화를 줄이고 발광 감지 감도를 최대화합니다. 바닥이 투명한 웰을 통해 세포 밀도를 모니터링할 수 있습니다. 플레이트는 세포 배양에 적합해야 합니다. 최고 판독 광도계를 사용하는 경우 플레이트 뚜껑을 제거해야 합니다.</td></tr><tr><td>제어 소프트웨어 TECAN이 포함된 Infinite F200Pro 플레이트 리더</td><td></td> 발광 측정에는 'Blue 1' 및 'Green 1' 필터를 사용하고 형광 측정에는 GFP용 필터 세트와 쌍극 미러를 사용합니다.<td></td><td> 이중 색상 발광과 형광을 측정할 수 있는 모든 상단 판독 플레이트 리더가 적합합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>pLuc, pYFP, 양성 대조군 플라스미드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>플라스미드는 요청 시 저자가 제공합니다.</td></tr><tr><td>pGEM-3Zf(+)</td><td>Promega</td><td>P2271</td><td>트랜스펙션 믹스에서 DNA 질량의 평형화를 위한 필러 플라스미드. 진핵생물 프로모터가 결핍된 모든 플라스미드가 적합할 것입니다.</td></tr><tr><td>HEK293 세포</td>, <td>ECACC</td><td>85120602</td><td>합리적인 효율로 transfection하는 다른 세포주가 적합할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>HEK293 세포 배양에 사용되는 배지입니다. 37 &deg에서 따뜻하게; C 사용 전 수조. 다른 세포주를 사용하는 경우, 여기에 설명된 성장 배지를 세포주 특이적 배지로 교체하십시오.</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 페놀 레드 없음(기질 희석 배지)</td><td>Gibco</td><td>21063</td><td>이는 페놀 레드를 포함하지 않기 때문에 루시페라제 기질(EnduRen)의 희석에 사용되는 기질 희석 매체로, 이는 분석의 감도를 감소시킵니다. 세포가 CO2 인큐베이터에서 나오는 동안 발광 측정 중에 올바른 pH를 유지하기 위해 HEPES가 포함되어 있습니다. 37 &deg에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985</td><td>OptiMEM은 GeneJuice transfection 시약의 희석에 사용됩니다. 다른 무혈청 배지도 적합합니다. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% v/v 농도의 세포 배양 배지 보충용.</td></tr><tr><td>GeneJuice transfection 시약</td><td>Novagen</td><td>70967</td><td>HEK293 이외의 세포주를 사용하는 경우 transfection mixes에서 DNA에 대한 Genejuice transfection 시약의 비율을 조정해야 할 수 있습니다. 다른 형질주입 시약이 사용될 수 있다. 대체 transfection 시약을 사용하는 경우, 제조업체의 지침에 따라 transfection mixe에 사용되는 DNA의 양을 최적화해야 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>조직 배양에 적합한 멸균 DMSO를 사용하십시오.&nbsp;</td></tr><tr><td>EnduRen 라이브 셀 기질</td><td>Promega</td><td>E6481</td>은 <td>DMSO에서 34mg/ml로 EnduRen을 재구성합니다. 배양 배지에서 EnduRen을 희석하면 침전물이 형성될 수 있습니다. 이것은 분석을 방해하지 않습니다. 재구성된 EnduRen -20 &deg; C를 사용하고 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오. 재구성된 EnduRen이 배양 배지에서 희석하기 전에 완전히 해동되었는지 확인하십시오.</td></tr></tbody></table>

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에 기초 분석법은 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링하는 민감하고 신뢰할 수있는 수단을 제공한다. 브레 트 &#39;수용체&#39;형광 단백질 &#39;기증자&#39;루시퍼 라제 효소의 에너지의 비 복사 전달합니다. 이 분석의 일반적인 구성에서, 도너는 레 닐라 레니 포르 미스 루시페라아제이고 셉터 옐로우 형광 단백질 (YFP)이다. 에너지 전달의 효율이 강하게 거리 종속적이므로, BRET 현상의 관찰은 도너 및 억 셉터가 가까이에있을 것을 요구한다. 배양 된 포유 동물 세포에 대한 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 루시퍼와 YFP와 융합으로 두 번째로 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 기증자 및 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까운 수용체를 가져올 수 있습니다. 단백질 - 단백질을 조사하는 다른 기술에 비해teractions는 브렛 분석이 민감하여, 작은 손에 시간과 몇 가지 시약을 필요로하고, 약한 일시적인, 또는 살아있는 세포 내에서 발견 생화학 적 환경에 따라 달라질 수 있습니다 상호 작용을 검출 할 수있다. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석계 프로테오믹스 연구에 의해 제안 된 추정 적 상호 작용을 확인하기위한 최적의 접근 방법이며, 또한 그것은 단백질 - 단백질 상호 작용에 번역 후 변형의 효과를 평가하는, 맵핑 상호 작용 영역에 적합하고, 환자에서 확인 된 DNA 돌연변이의 영향을 평가.

BRET 분석의 원리는도 2에 도시되어있다. 여기에 제시된 실험 전반에 걸쳐 사용 된 분석 셋업은도 3에 도시된다. 루시퍼 라제-YFP 융합 단백질로 형질 감염된 세포에서 강한 BRET 신호의 검출이 에너지 전달이 관찰 것이 확인 이 실험 장치에서 (그림 4). 우리의 연구는 뇌의 발달에있는 전사 억제 자의 FOXP 가족의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 가장 눈에 띄는 기능은 음성 14-16에 필요한 orofocial 근육 운동의 복잡한 시퀀스를 생산하는 개발 언어 dyspraxia-어려움으로있는 음성 및 언어 장애의 드문 형태로 FOXP2 리드에 영향을 미치는 이형 돌연변이. FOXP1 돌연변이 환자에서보고되었다 심한 말과 언어 문제 17-20 함께 자폐증 스펙트럼 장애와 지적 장애를 가진. 다른 단백질과 FOX...

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

다음 실험의 전반적인 목적은 두 단백질과 살아있는 배양 세포 간의 상호작용을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 관심 있는 두 단백질의 cDNA를 루시퍼레이스(luciferase) 또는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP로 약칭)의 코팅 서열이 포함된 플라스미드에 서브클로닝하여 포유류 세포 내 단백질 발현을 위한 벡터를 제작합니다. 그 다음 단계로, 플라스미드를 배양 세포에 형질전환시키면 YFP 및 루시퍼레이스 융합 단백질이 발현됩니다.다음으로 루시페라아제 기질을 세포에 첨가하여 루시페라아제의 빛 방출을 유도합니다. LUCIFERASE에서 YFP로의 에너지 전달을 기반으로 두 융합 단백질 사이의 상호작용을 보여주는 결과를 얻습니다. 공침전과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 관찰할 수 있다는 점입니다.본 방법은 환자에게서 발견된 돌연변이가 단백질-단백질 상호작용에 영향을 미치는지 결정함으로써 기능 유전체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 절차의 첫 번째 단계는 저희 연구실의 박사 과정 학생인 RAB tric이 시연할 것입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 제작하십시오. 260 nanometers에서의 흡광도를 기반으로 플라스미드의 농도를 추정하십시오.염기쌍 수에 650 Daltons를 곱하여 각 플라스미드의 분자량을 결정합니다. 농도와 분자량을 사용하여 각 플라스미드 조제액의 몰 농도를 계산합니다. 플라스미드 DNA 조제액을 36 nano molar 농도로 희석합니다.이것들은 DNA 혼합물을 준비하는 데 사용될 작업 스톡이 됩니다. 형질전환을 위해서입니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 DNA 혼합물을 구성하는 것입니다. 성공을 보장하기 위해, 당사는 각 성분의 정확한 양을 미리 계산하는 스프레드시트를 작성하며 매우 세심한 주의를 기울입니다.DNA 혼합물을 준비합니다. 우선 filler plasmid 1800 nanograms이 포함된 첫 번째 대조군 DNA 혼합물을 최종 부피 20 microliters의 물에 준비합니다. 그다음 P look 대조군 construct 5 microliters를 준비하여 두 번째 대조군 DNA 혼합물을 구성합니다.전체 DNA 질량이 1800 nanograms이 되도록 필러 플라스미드를 추가합니다. 최종 부피가 20 microliters가 되도록 증류수를 추가합니다. P look 대조군 구조체 5 microliters와 PYFP 대조군 구조체 5 microliters를 포함하는 세 번째 대조군 DNA 혼합물을 준비합니다.이전과 동일하게 필러 플라스미드와 물을 첨가합니다. 마지막으로, 5 µL의 양성 대조군 컨스트럭트를 포함하는 네 번째 대조군 DNA 혼합물을 준비합니다. 마찬가지로 필러, 플라스미드 및 물을 동일한 방식으로 첨가합니다.다음으로, 관심 단백질 X의 동형 이량체화(homodimerization)를 테스트하기 위한 3D NA 혼합물을 준비합니다. 각 DNA 혼합물에 대해, 관련 P look 컨스트럭트 5 µL와 PYFP 컨스트럭트 5 µL를 혼합하고, 필러 플라스미드와 물을 추가합니다. 그 다음, 관심 단백질 쌍 X와 Y 사이의 상호작용을 테스트하기 위한 DNA 혼합물을 준비합니다. 각 DNA 혼합물에 대해, 관련 P look 컨스트럭트 5 µL와 PYFP 컨스트럭트 5 µL를 필러 플라스미드 및 물과 함께 혼합합니다. 75 cm² 플라스크에서 서브 컨플루언트(sub confluent) 상태의 HEK 293 세포를 수확하여 전체 세포의 10%를 13 mL의 배양 배지에 희석합니다.그런 다음, 흰색 투명 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 130 µL를 분주하고 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음으로, DNA 혼합물 수에 3을 곱하여 트랜스펙션할 웰의 수를 계산합니다. 웰당 상온의 무혈청 배지 6.3 µL와 트랜스펙션 시약 0.18 µL를 포함하는 마스터 믹스를 준비하고, 볼텍싱으로 혼합한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다.그 다음, 필요한 수의 튜브에 무혈청 배지 transfection 시약 마스터 믹스 20 µL를 분주합니다. 각 튜브에 해당 DNA 믹스 2 µL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 각 transfection 믹스를 사용하여 3개의 웰에 transfection을 수행합니다.웰당 6.5 µL의 transfection mix를 분주한 후, 세포를 36~48시간 동안 추가로 배양합니다. BRET 신호를 측정하기 위해, 먼저 live cell luciferase substrate를 vortexing하여 DMSO에 34 mg/mL 농도로 용해합니다.37 °C로 예열된 기질 희석 배지에서 재구성된 살아있는 세포 루시퍼레이스 기질을 1:1000 비율로 희석합니다. 웰당 50 µL의 기질 희석 배지를 넣고 볼텍싱하여 혼합합니다. 침전물이 형성될 수 있으나, 이는 분석에 영향을 미치지 않습니다.96-웰 플레이트에서 배양액을 흡입하여 제거하고, 세포를 최소 2시간 동안 배양한 후 각 웰에 희석된 live cell luciferase 기질 50 µL를 분주합니다. 96-웰 플레이트의 뚜껑을 열고 루미노미터 내부의 상온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 텍스트 프로토콜의 상세 내용에 따라 LUCIFERASE와 YFP의 방출광을 한 번에 한 웰씩 측정하며, 10초 동안 방출 신호를 적분합니다.전사 억제제인 Fox P 가족 구성원은 뇌 발달에 중요한 역할을 합니다. 이들의 돌연변이는 언어 장애 및 자폐 스펙트럼 장애와 연관이 있는 것으로 알려져 있습니다. FOX P two는 동형 이합체를 형성하는 것으로 알려져 있으며, 이를 통해 Fox 검출을 위한 Brett 분석법을 검증합니다.P two Homodimers 세포에 Fox P two 또는 핵 국소화 신호(nuclear localization signal)에 융합된 공여자로서의 luciferase 또는 수용체로서의 YFP 발현을 위한 컨스트럭트를 트랜스펙션하였습니다. 핵으로 표적화된 LUCIFERASE 및 YFP 단백질은 BRET 신호 검출의 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용되었습니다. 또한, luciferase-YFP 융합 단백질 발현을 위한 컨스트럭트를 세포에 트랜스펙션하였습니다.BRET 신호의 증가는 BRET 분석법이 Fox P2 호모다이머를 검출하는 데 효과적임을 보여줍니다. 핵 국소화 신호에 융합된 YFP 또는 FOX P2에 융합된 YFP를 형질전환한 세포의 형광 현미경 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 상호작용의 특이성은 다이머화를 저해하는 것으로 알려진 FOX P2의 돌연변이를 도입함으로써 입증되었습니다. 루시페라아제 Fox P2 delta E 400과 YFP Fox B2 융합 단백질을 공동 발현시켰을 때의 결과입니다.Fox B2와 YFP Fox B2가 공동 발현되었을 때와 비교하여 BRET 신호의 감소가 관찰되었습니다. 이러한 신호 감소는 변이 단백질의 세포 내 위치 변화로 인한 것이 아니었습니다. 전형적인 상호작용을 검출하는 BRET 분석법의 효능을 평가하기 위해 Fox P2와 Fox P1의 상호작용을 테스트하였으며, 분석법의 두 가지 가능한 구성 모두에서 BRET 신호가 관찰되었습니다. 또한, 전사 공억제제이자 알려진 Fox P2 상호작용 파트너인 CTBP1과의 상호작용을 조사함으로써, Fox P2와 비-Fox P 단백질 간의 상호작용을 검출하는 BRET 분석법의 적합성을 테스트하였습니다.Fox P two와 CT BP one의 상호작용은 Fox P two가 공여 융합 단백질이고 CT BP one이 수용체일 때 BRET 분석법으로 검출되었으나, 반대 구성에서는 검출되지 않았습니다. CT BP one의 극히 일부만이 핵에 위치했음에도 불구하고 FOX P two와 CT BP one 사이의 상호작용이 관찰되었으며, 이는 이 분석법의 민감도를 강조합니다. 마지막으로, Fox P two의 병원성 돌연변이가 단백질-단백질 상호작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 BRET 분석법이 사용되었습니다.Fox P two의 두 가지 점 돌연변이가 언어 및 말하기에 영향을 미치는 희귀 상염색체 우성 질환을 유발하는 것으로 보고되었습니다. 야생형 fox P two와 돌연변이 단백질의 이량체화 능력을 BRET 분석법을 사용하여 평가하였습니다. 야생형 Fox B two를 공여체로, 돌연변이 Fox B two를 수용체로 사용한 결과, R 5 53 H 돌연변이와 달리 R 3 28 X 돌연변이는 이량체화를 저해하는 것으로 나타났습니다.수용체에서 보여준 것과 동일한 결과가 역방향 구성에서도 관찰되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 단백질-단백질 상호작용을 모니터링하기 위해 bread assay를 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 살아있는 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 절차를 마친 후, 관찰된 단백질-단백질 상호작용의 기능적 결과를 평가하기 위해 관심 단백질의 활성을 분석하는 추가 기술을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

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생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

이 비디오는 형광 단백질, 공여자 eGFP 및 수용체 mCherry로 표지된 세포질 단백질을 발현하는 살아있는 박테리아에서 단백질-단백질 상호 작용을 결정하기 위한 FLIM-FRET 이미징 기술에 대해 설명합니다. 결합된 기술은 또한 상호 작용하는 단백질의 정량화를 허용합니다.

살아있는 박테리아의 단백질-단백질 상호 작용 특성화를 위한 FLIM-FRET 이미징

관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장.

브레 너머 단계 : 언 바운드 흥분에 의한 형광 발광에서 (연료)

우리는 여기에 우리가 기증자와 수용체 형광 사이트 사이의 단백질 분해 효소 절단 부위를 소개 향상된 발광 공명 에너지 전달 (LRET) 방법을 설명합니다. 이 변형은 우리가 단백질의 정제없이 막 단백질의 연구를 허용 관심 막 단백질에서 발생하는 특정 LRET 신호를 획득 할 수있다.

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

여기에서는 살아있는 HepG2 세포에서 Akt 활성화 및 인산화의 시공간 역학을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Förster 공명 에너지 전달(FRET) 이미징은 암세포의 인슐린 신호 전달 경로 및 대사 조절에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다.

HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

배우세요 살아있는 세포에서 BRET 기술을 이용한 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을. 포유류 세포에서 YFP와 루시퍼라이즈 융합 단백질을 발현시켜 실시간으로 상호작용을 관찰하고, 병원성 돌연변이의 영향을 평가할 수 있습니다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

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