생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

다음 실험의 전반적인 목표는 두 단백질과 살아 있는 배양 세포 간의 상호 작용을 관찰하는 것입니다. 이는 포유류 세포에서 단백질 발현을 위한 벡터를 생성하기 위해 루시페라아제 또는 황색 형광 단백질에 대한 코팅 서열을 포함하는 플라스미드(약칭 YFP)로 관심 두 단백질에 대한 CDNA를 subcloning함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 플라스미드는 배양된 세포로 transfection되어 YFP 및 luciferase 융합 단백질의 발현을 유도합니다.

다음으로 루시퍼라아제에서 광 방출을 시작하기 위해 루시퍼라제 기질을 세포에 추가합니다. LUCIFERASE에서 YFP로의 에너지 전달을 기반으로 하는 두 융합 단백질 간의 상호 작용을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. coun 침전과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용을 관찰할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 환자에서 발견된 돌연변이가 단백질 단백질 상호 작용에 영향을 미치는지 여부를 결정함으로써 기능 유전체학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차의 첫 번째 단계를 시연하는 것은 내 연구실의 박사 과정 학생인 RAB tric이 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 만들기 시작할 것입니다. 260나노미터에서의 흡광도를 기준으로 이들의 농도를 추정합니다.

각 플라스미드의 분자량은 염기쌍의 수에 650.Daltons를 곱하여 계산합니다. 농도와 분자량을 사용하여 각 플라스미드 제제의 몰 농도를 계산합니다. 플라스미드 DNA 제제를 36 나노 몰의 농도로 희석합니다.

이들은 DNA 믹스를 준비하는 데 사용될 작업 재고가 될 것입니다. 형질주입용. 이 절차의 가장 어려운 측면은 DNA 믹스를 설정하는 것입니다.성공을 보장하기 위해 각 구성 요소의 정확한 양을 미리 계산하는 스프레드시트를 만들고 세심한 주의를 기울입니다.

DN 믹스를 설정할 때. 20마이크로리터의 최종 부피에 1800나노그램의 필러 플라스미드를 함유하는 첫 번째 대조군 DNA 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 P look control 구조체의 5마이크로리터를 준비하여 두 번째 제어 DNA 믹스를 설정합니다.

필러 플라스미드를 첨가하여 총 DNA 질량을 1800나노그램으로 만듭니다. 물을 추가하여 최종 부피를 20마이크로리터로 만듭니다. 5마이크로리터의 P look control 구조체 및 5μl의 PYFP control 구조체를 포함하는 세 번째 control DNA mix를 준비합니다.

이전과 같이 필러 플라스미드와 물을 추가합니다. 마지막으로, 5마이크로리터의 positive control 구조체를 포함하는 네 번째 control DNA mix를 설정합니다. 다시 같은 방법으로 충전제, 플라스미드 및 물을 첨가하십시오.

다음으로, 관심 단백질 x의 동질이합체화를 테스트하기 위해 3D NA 믹스를 준비합니다. 각 DNA 혼합물에 대해 5마이크로리터의 관련 P look 구조체와 5마이크로리터의 PYFP 구조체를 결합하여 필러 플라스미드와 물을 추가합니다. 그런 다음 DNA 믹스를 준비하여 관심 단백질 쌍 X와 Y 사이의 상호 작용을 테스트합니다.각 DNA 믹스에 대해 관련 P look 구조체의 5 마이크로 리터와 필러 플라스미드 및 물 수확 sub confluent hec 2 9 3 세포와 함께 PYFP 구조체의 5 마이크로 리터를 결합하고 75 평방 센티미터 플라스크에서 전체 세포의 10 %를 13 ml의 배양 배지로 희석합니다.

그런 다음 24시간 동안 세포를 배양하기 전에 바닥이 투명한 흰색 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 130마이크로리터의 세포 현탁액을 분배합니다. 다음으로, DNA 믹스 수에 3을 곱하여 transfection할 웰의 수를 계산합니다. 볼텍싱으로 혼합된 웰당 6.3μL의 실온, 무혈청 배지 및 0.18μL의 transfection 시약을 포함하는 마스터 믹스를 준비한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 무혈청 배지 transfection 시약 마스터 믹스를 필요한 수의 튜브에 분배했습니다. 해당 DNA 혼합물 2마이크로리터를 각 튜브에 넣고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 각 transfection mix로 3개의 well을 transfection합니다.

36-48시간 동안 추가로 세포를 배양하기 전에 웰당 6.5마이크로리터의 형질주입 혼합물을 분주합니다. BRET 신호를 측정합니다. 먼저 볼텍싱(vortexing)을 통해 살아있는 세포 루시퍼라아제 기질을 밀리리터당 34mg으로 DMSO에 용해시킵니다.

재용해된 살아있는 세포 루시퍼라제 기질을 1 - 1000에서 기질 희석 매체에서 섭씨 37도로 예열합니다. 웰 와류당 50마이크로리터의 기판 희석 매체가 혼합되도록 합니다. 침전물이 형성될 수 있지만 분석을 방해하지는 않습니다.

96웰 플레이트에서 배양 배지를 흡입하고, 최소 2시간 동안 세포를 배양한 후 50마이크로리터의 희석된 살아있는 세포 루시페라제 기질을 각 웰에 분주합니다. 96웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 광도계 내부의 실온에서 플레이트를 10분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜의 세부 사항에 따라 한 번에 하나의 웰씩 LUCIFERASE 및 YFP의 방출을 측정하고 10초에 걸쳐 방출 신호를 통합합니다.

Fox P 계열의 전사 억제자(transcriptional Repressor)는 뇌 발달에 중요한 역할을 합니다. 돌연변이는 언어 및 자폐 스펙트럼 장애와 관련이 있습니다. FOX P two는 Fox 검출을 위한 Brett assay를 검증하기 위해 동형이합체를 형성하는 것으로 알려져 있습니다.

P 2 Homodimers 세포는 Fox P 2 또는 핵 국소화 신호에 융합된 공여체로서의 루시페라제 또는 수용체로서의 YFP의 발현을 위한 구축물로 형질주입되었습니다. 핵 표적 LUCIFERASE와 YFP 단백질은 Brett 검출을 위한 양성 대조군으로서 음성 대조군 역할을 합니다. 신호 세포는 또한 루시페라제 YFP 융합 단백질의 발현을 위한 구조체로 형질주입되었습니다.

BRET 신호의 증가는 Bret assay가 핵 국소화 신호에 융합된 YFP로 형질 주입된 세포의 Fox P 2 동형질체 형광 현미경 이미지를 검출하는 데 효과적임을 보여줍니다. 상호 작용의 특이성은 이합체화를 방해하는 것으로 알려진 FOX P 2에 돌연변이를 도입하여 입증되었습니다. 루시퍼라아제 Fox P, 2개의 델타 E 400 및 YFP Fox B를 사용할 때 2개의 융합 단백질이 동시 발현되었습니다.

Fox B 2 및 YFP Fox B 2가 동시 발현되었을 때와 비교하여 호흡 신호의 감소가 관찰되었습니다. 이러한 신호 감소는 전형적인 상호작용을 검출하는 데 있어 Bret 분석법의 효과를 평가하기 위한 돌연변이 단백질의 세포 내 국소화의 변경에 기인하지 않았으며, Fox P 2와 Fox P 1의 상호 작용이 테스트되었으며, 분석의 두 가지 가능한 구성에서 Brett 신호가 관찰되었습니다. 또한, Brett 분석의 적합성 또는 Fox P 2와 non FOX P 단백질의 상호작용 검출은 전사 공동 억제인자 및 알려진 Fox P two 상호작용 파트너인 CT BP one과의 상호작용을 조사하여 시험하였다.

Fox P 2 CT BP 1 상호 작용은 Fox P 2가 공여자 융합 단백질이고 CT P 1이 수용체일 때 Brett 분석에 의해 검출되었지만 역 구성에서는 검출되지 않았습니다. FOX P 2와 CT P 1 사이의 상호 작용은 CT BP 1의 미미한 비율만이 핵에 국한되었음에도 불구하고 관찰되어 이 분석의 민감도를 강조했습니다. 마지막으로, 단백질 단백질 상호 작용에 대한 Fox P two의 병원성 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 Bret 분석법을 사용했습니다.

Fox P two의 2점 돌연변이는 말하기와 언어에 영향을 미치는 희귀한 상염색체 우성 장애를 유발하는 것으로 보고되었습니다. 야생형 여우 P 2와 이합체화하는 돌연변이 단백질의 능력은 BRET 분석을 사용하여 평가되었습니다. R 3 28 X는 R 5 53 H 돌연변이가 아닌 야생형 Fox B 2를 공여체로, Fox B 2를 공여체로 사용하여 이합체화를 방해합니다.

수락자가 표시된 것처럼 역방향 구성에 대해 동일한 결과가 관찰되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링하기 위해 빵 분석을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차에 따라 관찰된 단백질 단백질 상호 작용의 기능적 결과를 평가하기 위해 관심 단백질의 활성을 분석하기 위해 추가 기술을 수행할 수 있습니다.