Bimolecular 형광 Complementation

이 실험은 두 단백질이 세포에서 상호 작용하는지 여부를 정의하고 해당 상호 작용 부위의 측면을 설명하는 것을 목표로 합니다. 첫 번째 세포는 관심 있는 두 단백질을 인코딩하는 발현 구조체로 형질 주입되며, 그 중 하나는 단편화된 형광 단백질의 말단 말단에 융합되고 다른 하나는 단편화된 형광 단백질의 상보적 C 말단에 융합됩니다. 형질주입된 세포가 배양에서 형광 신호를 발생시키도록 한 후, 이미징 및 면역 블로팅에 의해 시각화된 단백질 복합체.

다음으로, 수집된 이미지를 Image J와 같은 이미징 소프트웨어로 내보냅니다.A 대조 실험에서 세포당 평균 형광 강도를 정량화하기 위해 BIFC 결과는 단백질 단백질 상호 작용 및 교차하는 골격 단백질의 SH 3 도메인 및 PI 3 KC 2 베타의 프로 리치 도메인과 같은 이러한 복합체의 국소화를 입증할 수 있습니다. colocalization, immunoprecipitation 및 fret과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BFC가 세포 내 약한 일시적 상호 작용의 공간화된 국소화를 허용한다는 것입니다. 그리고 이 방법은 프렛에서 볼 수 있듯이 광범위한 후처리 이미지가 필요하지 않습니다.

이 방법은 DO 단백질 X와 Y가 상호 작용한다는 것과 같은 신호 전달 영역의 주요 질문을 해결할 수 있으며, 그렇다면 이러한 복합체가 세포에 국한된 특정 구획은 무엇입니까? 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 생검을 발현하기 위한 적절한 구성을 선택하지 않았기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 관심 단백질에 태그된 단백질: BIFC 융합 단백질에 대한 여러 형광단 중 하나를 선택하여 시작합니다.

금성의 아미노 및 카르복시 말단 말단은 섭씨 37도에서 복합체를 형성할 수 있는 반면, Y-F-P-B-I-F-C 단편은 섭씨 30도에서 사전 배양이 필요합니다. BIFC 단편의 부착이 관심 단백질의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 고려하여 관심 단백질에 태그를 추가하기 위한 발현 벡터를 설계합니다. 예를 들어, RA 패밀리, GTP a는 카르복시 말단에서 지질이 변형되어 있으며 이 변형을 방해하지 않고는 이 말단에 태그를 붙일 수 없습니다.

항상 파일럿 실험을 수행하여 transfection 조건을 결정하십시오. 또한 형광 현미경 검사로 세포를 모니터링하여 신호 발생을 위한 최적의 시간을 식별합니다. 그런 다음 서양 꽃 분석을 수행하여 구성물의 동일한 발현을 확인합니다.

중요한 것은 BIFC 단편의 추가가 각 샘플 플레이트에 대한 관심 단백질의 세포 국소화를 변경하지 않는지 확인하기 위해 HA 또는 플래그 태그에 대한 면역 염색입니다.5개의 세포 중 10개를 각각 1개의 유리 바닥 물질 플레이트와 6개의 웰 플레이트의 2개의 웰에 1.3배로 배치하고 세포가 다음날 섭씨 37도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 침전되도록 합니다. 지방절제술 또는 다른 바람직한 방법에 의한 transfection을 위한 DNA를 준비합니다.

먼저, 250마이크로리터의 무혈청 DMEM에 DNA를 transfection control로 희석합니다. 전체 BIFC DNA의 양인 1 50에 CFP를 추가합니다. 이제 DNA 1마이크로그램당 10마이크로리터의 입술을 사용하여 250마이크로리터의 무혈청 DMEM으로 입술을 희석합니다.

DNA와 입술 희석액을 혼합하여 실온에서 20분 동안 배양합니다. 따뜻한 무 혈청 DMEM으로 세포를 두 번 헹굽니다. 2ml의 무혈청 DMEM을 각 유리 바닥판 또는 6웰 접시의 웰에 추가합니다.

그런 다음 각 transfection 혼합물을 하나의 유리 바닥 접시와 6개의 웰 2개 사이에 고르게 나눕니다. 웰 플레이트는 섭씨 37도에서 5시간 동안 세포를 배양합니다. 마지막으로, transfection 배지를 제거하고 완전한 DMEM과 10%FBS 배지로 교체합니다.

파일럿 실험에서 결정된 시간 동안 세포를 배양하여 관심 단백질의 필요한 발현 수준을 얻습니다. epi 형광 현미경으로 형질 주입된 세포를 검사하여 positive control이 형광성인지 확인합니다. 살아있는 세포 이미징을 위해 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다.

지표가 없는 매체에 세포를 놓습니다. 고정 세포를 이미징합니다. 파라 포름알데히드 2%를 넣고 얼음 위에 10분간 올려둡니다.

그런 다음 PBS 1 밀리리터로 덮인 PBS로 세포를 세 번 헹구고 섭씨 4 도의 어둠 속에 보관하고 즉시 6 개의 우물 접시에 세포를 용해시킵니다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, lys 세포가 이미지 세포를 대표할 수 있도록 모든 세포를 동시에 준비하는 것이 중요합니다. 태그 단백질이 동일한 수준으로 발현되도록 웨스턴 블롯을 수행합니다.

컨포칼 현미경으로 세포를 이미징할 때는 샘플 간에 형광이 비슷할 수 있도록 실험 내내 설정을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 픽셀이 포화되지 않은 개별 셀을 이미지화해야 합니다. CFP가 transfection control로 포함되었기 때문에 BIFC 신호 분석을 위해 CFP positive cells만 선택합니다.

image J.와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광을 정량화합니다.Image J.Go에서 이미지 파일을 열어 설정된 측정값을 분석합니다. 측정 상자에서 area 및 mean gray value(평균 회색 값)에 대한 상자를 선택합니다. 이 예에서 정맥 이미지는 유사 녹색이고 CFP 이미지는 유사 색상인 빨간색입니다.

자유형 선택 도구를 사용하여 CFP 채널의 전체 셀 가장자리 주위에 윤곽선을 그리고 이 윤곽선은 그대로 둡니다. YFP 채널로 이동합니다. 분석으로 이동하여 각 이미지에 대한 셀당 평균 형광 강도를 반영하는 평균 회색 값을 측정합니다.

YFP 채널의 셀이 없는 영역에 원을 그립니다. 이 영역을 배경으로 측정합니다. 각 이미지에서 배경을 뺍니다.

마지막으로, 세포 집단에 대한 평균 형광 강도를 계산하려면 평균 등급 값에서 하나의 샘플에서 이미징된 모든 세포의 배경을 뺀 값의 평균을 구합니다. 3번의 실험을 통해 60개의 세포를 정량화하는 것이 이상적입니다. 다중 도메인 스캐폴딩 단백질 교차는 새로운 클래스 2 PI 3 키나아제, PI 3 KC 2 베타 교차 SH 3 도메인의 아미노 말단 프롤린이 풍부한 영역과 상호 작용 PI 3 KC 2 베타 VN 태그와 교차하는 VN 태그 PI 3 KC 2 베타의 조절을 통해 YFP 채널에서 형광 신호를 생성하고, 이는 복잡한 형성을 나타내는 유사 녹색입니다.

여기서 빨간색으로 표시된 CFP는 PI 3 KC 2 beta의 프롤린이 풍부한 도메인에서 transfection된 세포 돌연변이를 표시하는 대조군으로 사용되며, 이는 교차하는 co의 공동 침전을 방해하고 PI 3 KC 2 beta는 BIFC 신호를 감소시킵니다. BIFC 신호의 이러한 차이는 야생형과 PA PI 3 K 단백질의 발현 차이 때문이 아닙니다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행되면 3일 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 적절한 제어를 실행하고 단백질 발현을 확인하여 BC 신호의 차이가 이 절차에 따른 발현으로 인한 것이 아니라 복잡한 형성의 차이로 인한 것인지 확인해야 합니다.

거주자에 대한 표면 플라즈마와 같은 다른 기술을 수행하여 이러한 복합체가 서로에 대한 서로 다른 친화도는 무엇입니까?