Name: ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 고처리량 이미징을 활용한 세균 식민지 성장 지연 시간 및 성장률 정량화 방법입니다. 이 기술은 단일 변이체 수준에서 긴 지연 시간과 느린 성장을 구별하여 미생물 집단의 성장 특성 연구에 활용됩니다.

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Bacillus subtillis의 이미지에 대해 Eliq Oster에게 감사드립니다. 이 연구는 유럽 연구 위원회(# 260871)와 이스라엘 과학 재단(#592/10)의 지원을 받습니다.

1. 설치 빌드 <ol><li> 광학 해상도와 평판 스캐너 선택 : 4,800 dpi로를; 하드웨어 해상도 : 4,800 X 9,600 dpi로; 색상 비트 심도 : 48 비트, 관련 온도와 습도 수준에서 작동 할 수 있습니다. </li><li> 페트리 접시는 일반적으로 상업 스캐너에 사용되는 용지는 달리 상당한 양이있다. 식민지는 약 5 ㎜ 스캐너 표면 위에, 한천 층의 상단에 거짓말. 주 : 대부분의 스캐너에 대한 식민지의 초점이 될 것입니다. </li><li> 일부 스캐너 회사 같은 컴퓨터 동일한 분류 스캐너의 하나 이상의 인스턴스의 연결을 허용하지 않는다. 하나 이상의 스캐너가 부착 고유하게 식별 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 아래에 자세히 설명 등의 소품​​을 준비한다 : <ol><li> 멸균 블랙의 준비 조각 플레이트를 커버하는 천 (그림 1 단계 2)를 느꼈다. </li><li> 장소에 페트리 접시를 개최, 스캐너에 맞게 하얀 접시 홀더 (재료 및 방법)를 준비하고 6 HOL을 가지고에스 접시의 크기 (그림 1 단계 3). </li></ol></li><li> 미생물의 성장을 위해 필요하다면, 온도 제어 된 환경에서 스캐너를 탑재. 컴퓨터에 스캐너를 연결합니다. </li><li> 선택 사항 : 컴퓨터에 릴레이를 연결하고 온도 변화를 극복하기 위해 스캐너의 온 / 오프 스위치를 우회. 참고 : 릴레이 유닛은 매우 온도에 민감한 미생물입니다. 전자가 고르지 표면을 가열하지 않도록 그것은 스캐너를 꺼집니다. 스캐너 표면의 일부만을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수있다. </li></ol> 2. 스캔 관리자에게 설치 <ol><li> http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html에서 지정된 디렉토리에 모두 &#39;검색 관리자&#39;응용 프로그램 파일을 복사합니다. </li><li> 그들은 컴퓨터 관리 -&gt; 장치 관리자 -&gt; 이미징 장치 (에 나타나는 스캐너의 이름에 따라 ScanningManager.exe.config 파일을 구성 <stroNG&gt; 그림 2). </li><li> &#39;스캔 관리자&#39;응용 프로그램의 문제 해결을 위해 내가 읽어보기 파일을 참조하십시오. </li><li> &#39;스캔 관리자&#39;응용 프로그램에 대한 자세한 설명서는 Documentation.html를 참조하십시오. </li></ol> 3. 실험을 수행 <ol><li> 페트리 접시 (그림 1)를 준비 : <ol><li> 약 2,000 CFU / ml의 문화를 희석. 균일 플레이트 표면에 문화의 0.1 ML 플레이트. </li><li> 식민지와 요리 사이 좋은 대조를 얻기 위해 수분을 흡수, 살균 블랙의 조각으로 접시를 커버 천 느꼈다. 접시에 뚜껑을 넣어. </li></ol></li><li> 스캐너의 홀더에 접시를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 스캐너 목록에서 참여 스캐너를 선택 : 스캔 관리자 (그림 3)를 시작합니다. (회 반복)를 촬영하는 이미지의 수, 연속적인 이미지 사이의 시간 간격 (시간 간격), 및 t를 시작하기 전에 시간 지연을 선택그는 (후 시작) 실험. </li></ol> 이미지의 4. 분석 참고 : 계산 방법의 개요는 http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications에서 비상업적 인 용도 무료로 사용할 수있다 &quot;ScanLag&quot;를 사용하여 MATLAB에서 이미지 분석을 위해 제공됩니다. HTML. 사용 가능한 추가 기능은 소프트웨어 매뉴얼에 설명되고, 예를 들어 코드는 보충된다. <ol><li> 별도의 폴더에 각 스캐너에서 이미지를 정렬합니다. </li><li> 매트랩 명령 창을 사용하여, 다음 절차를 실행. 이 절차를 실행하는 데 필요한 매개 변수는 소프트웨어 설명서에 정의되어 있습니다. <ol><li> 전처리를 수행 할 수 PreparePictures을 실행하여 사전에 스캐너에서 이미지가 정렬됩니다. 각 페트리 접시는 이미지의 각 시퀀스에서 잘립니다. 각각의 이미지가 수집 된 시간은 타임 스탬프에서 검색됩니다. </li><li> 전자에서는 탐지 및 추적을 수행 할 수있는 실행 TLAllPlatesACH 페트리 접시는 별도로, 식민지가 감지 및 식별 번호가 할당됩니다. </li><li> 추출 된 데이터의 분석 : 각 검출 된 콜로니의 크기는 시간의 함수로서 측정된다. 식민지의 모양 분포를 추출하려면 매트랩 명령 창에서 다음과 같은 기능을 (자세한 내용은 소프트웨어 설명서에서 사용할 수 있습니다)를 사용합니다 : <ol><li> 시간 (그림 4)에 비해 크기를 식민지의 그래프와 함께 특정 페트리 접시의 분석을 표시 ScanLagApp를 실행합니다. <ol><li> 판의 현재 시간을 변경하려면 슬라이더를 사용합니다. 타이밍도 콜로니 영역 그래프 매칭 수직선으로 표시 될 것이다. </li><li> 관련 곡선을 확인하기 위해 식민지를 클릭하고, 그 반대의 경우도 마찬가지, 관련 식민지를 찾기 위해 곡선을 클릭합니다. 식민지를 식별 한 후, 표현형은 확인 된 배양 접시에서 식민지를 선택하여 검색 할 수 있습니다. </li><li> 추에 의해 자동 분석 필터 결함식민지를 노래하고 제외 버튼을 클릭. 식민지의 수를 제외하면 클릭하면 노란색으로 바뀝니다. </li></ol></li><li> 각 플레이트의 분석 결과를 거쳐, 그 결과를 정리해 보면 : <ol><li> 등장 시간의 히스토그램을 만들 AddHistograms를 실행합니다. </li><li> 분포의 생존 곡선 표현을 만들 수 plotDeathCurve를 실행합니다. </li><li> 실험의 모든 식민지의 모양 시간을 얻을 수 GetAppearanceTimes를 실행합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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직접 관찰에 기초하여 현미경 방법은 종종 단일 셀 동작을 연구하기위한 &quot;황금 표준&quot;으로 간주된다. 세균 집단에서 지연 시간의 분포의 측정을 가능 ScanLag는, 단일 세포 분석에서 얻은 분포와 잘 일치에 데이터를 제공하고, 더 높은 통계를 달성한다. 몇 가지 중요한 단계가 제대로 작동하려면이 방법을 수행 할 수있다 : 첫째, 좋은 이미지를 얻기 위해 4,800 X 9,600해야 스캐너 해상도에 타협하지 않습니다. 둘째, 전원 관리 모듈 (단계 1.6)하지 않고, 온도 구배는 평판면에 발전 및 성장에 영향을 미칠 수가있다. 또 다른 중요한 단계는 실수로 소프트웨어에 의해 식민지로 간주되었을 수 있습니다 먼지와 같은 결함의 여과이다. 소프트웨어의 기본 배경 공제는 일반적으로 이러한 결함을 극복하지만, 때로는 &quot;false&quot;로 식민지에이수동으로 필터링 할 수. () 미생물의 성장 속도는 온도에 의해 영향을받습니다 주요 문제 해결 단계 여러 가지 이유로, 설치에 간 플레이트의 변화를 처리 할 수​​ 있습니다. 다른 온도와 습도 조건으로 인해 인큐베이터에있는 접시의 고르지 환기 또는 위치에 발생할 수 있습니다. (b)는 스캐너의 전자는 스캐너의 표면에 걸쳐 온도 구배를 가열하고 발생할 수있다. 10 함께 전에 스캐너 표면 온도의 측정과, 바실러스 균에 공간적 열 구배의 영향을 도시도 전원 관리 모듈을 구현 한 후 (1.6 단계). 이 모듈이 새로운 스캐너 필요하지 않을 수도 있으며 스캐너 표면의 일부만이 사용되는 경우, 전원 관리가 불필요 할 수 있다는 것을주의한다. (C) 한천 영양의 다른 불투명도 플레이트가 검출 다른 수준으로 이어질 수 있습니다.도 11 일 그림다른 혼탁이 발생할 한천의 다양한 볼륨의 전자 허용. 실험적으로 ScanLag 기술을 수행하기 쉽고, 단지 표준 배양 접시에 미생물을 도금하고, 스캐너의 표면에 배치해야합니다. 개발 된 소프트웨어는 전체 절차를 제어합니다. 이미지 수집을 자동으로 수행하고, 식민지 추적을위한 이미지 분석은 자동입니다. 또한, 시스템은 스케일 업 할 수있다 동시에 여러 조건을 측정하기 위해. 마지막으로,이 방법은 상업 사무실 스캐너에 의존하고, 따라서 낮은 비용입니다. 이 기법은 E. 다를 미생물의 연구로 확장 될 수있다 콜라이 K-12 그러나 몇몇 고려하여야한다. 먼저, 나중에 것들에 이른 나타나는 콜로니의 영향은 이전 간행물 7에 상세히 설명한 바와 같이, 평가되어야한다. E.에 대한 콜라이 K-12,접시 당 CFU의 최대 밀도는. 식민지의 서로 다른 크기와 다른 변종 (200), 그리고 식민지 사이의 다른 가능한 크로스 토크는 다른 농도가 필요할 수 있습니다. 둘째, 판의 분석은 고체 배지와 식민지 사이의 대비에 따라 수정해야 할 수도 있습니다 특정 소프트웨어 기반 임계 값을 보정한다. 이 소프트웨어는 지연과 성장 속도를 넘어, 다른 식민지의 특성을 추출도 확장 할 수 있습니다. 소프트웨어 코드는 열려 있고 식민지 모양, 밝기, 부드러움과 색상을 추출하기 위해 수정 될 수 있습니다. 측정은 단일 세포에서 유래 콜로니에 만들어져 있기 때문에, 데이터는 인구 레벨 측정에 의해 측정 될 수없는 새로운 표현형을 드러낸다. 지연 시간 분포의 중요성은 항생제의 존재 드러난다. 대부분의 항생제는 성장 세포에 대한 효과적인 것으로 알려져있다; 따라서 한 셀은 유도기에 남아 성장하지 않기 때문에, 그들은 프로 아르그 항생제 (21)의 영향에서 만약 보호. 생존 박테리아의 숫자는 항생제 치료 15,22,23 동안 시간 간격으로 평가 될 때, 영속라는 박테리아의 모집단은 종종 밝혀진다. 경우에 따라 항생제 치료에 내성이 장기간 지연에서 유래. 이 설정을 사용하여,이 지연은 밝혀 종종 적지 않은 분포 (24) (그림 6)이있다. 이 방법은 드문 돌연변이를 검색 할 수 있습니다. 예를 들어, 돌연변이 된 인구 도금 후, 돌연변이 표현형에 기초하여 식별 될 수 있고, 선택하지 않고, 직접 절연. 설치 또한 인근 식민지의 밀도의 함수로 식민지의 성장을 측정하여 세포 - 세포 상호 작용을 모니터 할 수 있고 이러한 쿼럼 센싱 또는 집단 박테리아의 확산 등의 현상을 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 미래의 실험에 의해 밝혀 다차원 정보는 미생물 인구의 더 나은 특성으로 이어질 것의 의료 및 환경 연구의 발전에.

박테리아는 많은 스트레스 상황에 반응하도록 진화했다. 스트레스에 대한 적응의 일반적인 특징은 성장 역학 1,2의 변화입니다. 기하 급수적 인 성장 속도와 지연 시간, 새로운 조건에 적응하는 데 필요한, ​​즉 시간 : 성장 역학은 두 개의 매개 변수에 의해 주로 특징이다. 높은 처리량 방법 중 다수가 성장 속도를 측정하는 반면에 초점이 새로운 조건에 적응 특성에 대한 결정적인 매개 변수되지만, 지연 시간은, 종종 간과되는 파라미터이다. 변화하는 상황에 적응 정량은 전통적으로 시간이 많이 드는 방법에게 3,4를 사용하여 수행되었습니다. 최근에는 첨단 기술은 단일 세포 5,6의 분석을 위해 개발되었다. 그러나, 성장 지연 느린 성장 (즉, 지연 시간) 2,3 다음 정상적인 성장을 구별하는 것은 여전히 어렵다. 자동화 된 방법으로, ScanLag 7, 건설되었다이 두 개의 유사한 표현형을 구별. 지연 시간 분포에 대한 연구의 중요성에 눈에 띄는 예는 항생제 치료에서 드러났습니다. 항생제와 다른 스트레스 많은은 적극적으로 성장하는 세포를 죽일하고, 따라서 &quot;후행&quot;하는 세포는 8 보호를받습니다. 지연 시간을 모니터링하기 위해, 하나는 현미경 단일 세포를 관찰하고 첫번째 부분에 시간을 모니터링 할 수있다. 이 방법의 가장 큰 단점은 동적 시간 범위가 제한되어 있다는 것입니다; 초기 성장하고 그 세포 효과적으로 긴 지연 시간에 따라 세포의 성장을 감소 지수 레이트로 표면을 커버. 유동 챔버의 사용이 다소 5를 우회하지만 세포의 제한된 수를 추적 할 수 있고 인구의 대부분이 성장 시작된 후에 유도기를 종료 세균 분획이 관찰 될 수 없다. 이러한 제한에도 불구하고, 몇몇 연구 디의 레벨의 영향을 평가 한fferent는 하나의 세포 현미경 9-12를 사용하여 지연 시간의 분포를 강조한다. 지연 시간 분포를 모니터링하는 다른 방법은 탁도 측정 13,14 통해서이다. 각각 하나의 세포에서 시작 많은 병렬 문화는,, 시간이 지남에 따라 문화에 박테리아의 수를 측정하는 광학 밀도 리더에서 재배된다. 이 방법은 추정의 정밀도에 의해 접시에 우물의 수에 제한됩니다. 자동화 된 방법도 매우 긴 지연 시간이 인구에있는 박테리아의 작은 비율에 대해 평가하는 지연 시간과 성장의 시간 분포를 가능하게하는, ScanLag라는 개발되었다. 이 방법은 기존의 영양 한천 플레이트 (15) (그림 1)에 식민지의 검출을 기반으로합니다. 검출 (16, 17)에게 주기적으로 접시의 이미지를 얻기 집 소프트웨어에서이 지정하는 상업 스캐너 (18)의 배열을 자동화하기 위해 설계되었다. 소프트웨어였다자동으로 이미지를 분석하고 시간이 80 픽셀로 20 픽셀에서 성장을 여기에 정의 된 각 식민지의 각 식민지와 성장의 시간 외관의 시간을 정량적 매개 변수 (19, 20)를 추출 할 수 있도록 설계. 여기에서 우리는 시스템의 설치 및 향상된 사용자 인터페이스를 개선 한 내용 자동화 이미지 분석 소프트웨어의 사용을 포함하여, 상세하게 방법을 제시한다. 이 방법은 같은 형태와 같은 색 콜로니 다른 특성을 측정하도록 적응 될 수있다. 이러한 유형의 매개 변수 측정은 다차원 phenomics의 시스템의 사용을 허용합니다. 방법은 하나의 세포에서 식민지를 감지하면, 시스템은 인구 수준의 측정에 의해 측정 할 수있는 새로운 표현형을 표시 할 수 있습니다. 기술은 희소 변형 검출 및 검색을 가능하게하고, 원하는 특성에 대해 스크리닝을 용이하게한다.

<table><tbody><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB 국물</td><td>BD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 90 mm</td><td>Miniplast</td><td>20090-01</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection v37</td><td>Epson</td><td>B11B207201</td><td>평판 스캐너 광학 해상도: 4,800 dpi, 하드웨어 해상도:&nbsp; 4,800 x 9,600dpi, 컬러 비트 심도 48비트.</td></tr><tr><td>엡손 퍼펙션 v200</td><td>엡손</td><td>B11B188011</td><td></td></tr><tr><td>엡손 퍼펙션 3490</td><td>엡손</td><td>B11B177011</td><td></td></tr><tr><td>ADU200 USB 릴레이</td><td>ONTRAK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 검은 펠트 천 조각</td> 맞춤 <td>제작</td><td></td><td>약 100 x 100mm</td></tr><tr><td>화이트 플레이트 홀더</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>표면 크기, 6 x 99mm 직경 구멍</td></tr> <tr><td>포함Delerin은 페트리 접시 크기의 반지</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>내경 : 72 mm 외경 : 86 mm 상단 외경 : 90 mm</td></tr></tbody></table>

scanlag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

성장 역학은 미생물의 근본적인 특성입니다. 성장을 정확하게 정량화하는 것은 미생물학에서 중요한 목표입니다. 성장 역학은 미생물의 배가 시간과 한 조건에서 다른 조건으로 이동할 때 성장 지연, 즉 지연에 의해 영향을 받습니다. ScanLag 방법을 사용하면 단일 세포에서 각각 발생하는 콜로니 수준에서 이 두 가지 독립적인 특성을 특성화하여 지연 시간과 성장 시간의 2차원 분포를 생성할 수 있습니다. ScanLag에서 기존 영양 한천 플레이트의 집락을 감지하는 데 걸리는 시간 측정은 사내 애플리케이션으로 제어되는 일련의 상용 스캐너에서 자동화됩니다. 페트리 접시는 스캐너에 배치되고 응용 프로그램은 주기적으로 이미지를 획득합니다. 그런 다음 군집 성장에 대한 자동화된 분석은 각 군체의 출현 시간과 성장률을 반환하는 애플리케이션에 의해 수행됩니다. 군체의 모양, 질감 및 색상과 같은 다른 매개변수는 세포의 하위 집단에 대한 다차원 매핑을 위해 추출할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법을 사용하면 추가 특성화를 위해 특정 성장 표현형을 가진 희귀 변이체를 검색할 수 있습니다. 이 기술은 항생제에 대한 지속성을 유발할 수 있는 긴 지연을 식별하기 위해 세균학에 적용될 수 있을 뿐만 아니라 표현형 스크리닝을 위한 일반적인 저비용 기술에 적용될 수 있습니다.

지연 시간 분포 추출의 예로서,도 5는 스크리닝 검사에서 수행되는 바와 같이, 시간이 지남에 따라 하나의 플레이트에 대한 특정 특성을 가진 각각의 콜로니를 식별하고 추적하기 ScanLag의 능력을 나타낸다. 미생물의 문화가 이질적인 경우, 다른 부분 집단은 분석 기간 동안 스스로를 발견 할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 그림 6은 모양 정량을 표시하고, 따라서 E.의 돌연변이 균주에서 바이 모달 지연 시간 분포를 보여 대장균. 세포의 성장 속도는 콜로니의 등장 시간에 영향을 미친다. 식민지가 같은 속도로 성장하면, 후반 외관은 지연 시간 (그림 7)에 기인 할 수있다. 방법은 실제로 단셀의 지연 시간을 측정하는 것을 확인하기 위해, 우리는 단일 셀 현미경을 사용하여 수득 된 것과 ScanLag 결과를 비교; 이 유효성 검사는 DESC입니다이전의 간행물 7에 상세히 ribed. 이 방법은 현미경으로 평가 될 수있는 것보다 더 많은 셀을 모니터링 할 수 있습니다. 현미경을 사용하고 ScanLag를 사용하여 얻은 얻어진 분포가 크게 중복. ScanLag 분포는 약간 넓다; 이론적 분석은 분할 시간의 표준 편차의 순서로 넓혀 예측. 성장 시간은 각 균주에 대해 서로 다른 경우에, 외형의 지연의 기원은 더 다른 방법을 사용하여 조사한다. 이후 식민지의 모양에 초기 나타나는 식민지의 영향을 조사 하였다. 제어 실험 7 나중에 외관은 한 접시 당 콜로니의 총 수 (그림 8) (200)를 초과하지 않았다으로 영향을받지 않는 것을 확인했다. 또 다른 제어 실험 접시에 식민지의 위치가 그 모습 시간 7에 영향을 미치는되지 않았 음을 확인했다. P의 분석LATES은 성장 매체 또는 미생물의 종류에 존재하는 영양소에 따라 수정해야 할 수도 있습니다 특정 임계 값을 보정한다. 도 9에 도시 된 바와 같이 그럼에도 불구하고, 분석은 임계 값의 넓은 범위에 대해 아주 강력하다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> 도 1. 콜로니 외관 분포를 생성하기 위해 필요한 단계의 개략도. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 연결된 스캐너 및 구성 파일의 이름을 표시하는 장치 관리자의 스크린 샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">큰를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 버전입니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> 스캔 관리자의 그림 3. 스크린 샷. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. ScanLagApp의 스크린 샷. 판의 이미지는 왼쪽 창에 있고, 설명서에 설명 된대로 각 식민지의 성장 곡선은 오른쪽 창에 있습니다. 두 개 이상의 식민지 병합 때 식민지 영역 곡선의 일부에 스파이크가 발생합니다. 식민지 병합하는 상황이 발생하면,이 식민지의 영역은 공동 영역으로 간주됩니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> 도 5. 한 플레이트의 분석의 대표적인 결과. (A) 실험의 끝에 검출 애플리케이션의 출력 이미지. 각 콜로니 영역은, 식별 된 컬러와 고유 ID 번호가 할당된다. 화살표는 콜로니 (강도 임계치에 기초하여 검출된다 B. 측정 대표 콜로니를 가리는 LB 한천 또는 M9 한천 E. 대장균 콜로니를 들어이 임계 값은 0.03이다. 다른 미디어 나 세균이 임계 값은 함수 ProcessPictures 조정할 수있다 ). 10 픽셀 이상 개체 만 (이 임계 값은 함수 MatchColonies에서 수정할 수 있습니다) 계산됩니다. 식민지의 검출은 약 10 5 박테리아에서 시작한다. 이 판에있는 네 개의 대표적인 식민지의 시간에 대한 픽셀 영역 (B) 플롯. 콜로니가 검출 될 때 각 콜로니 &#39;등장 시간&#39;이다. 시간이 이리저리 성장을 각 식민지의 성장 시간은 &#39;여기에 정의되어80 픽셀 (그 경계 기능 getAppearanceGrowthByVec를 사용하여 조정 가능하다)로 M (20) 픽셀. 이 소프트웨어는 상한에 도달하기 전에 합병 식민지를 제외합니다. 그 특성에 따라 특정 집단의 식별은 식별 번호와 각 식민지에 할당 된 색상에 쉽게 감사합니다. 예를 들어 중 1 식민지, 56, 77 및 124 두 그래프에서 강조 표시됩니다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6. 외관 정량화 바이 모달 지연 시간 분포를 공개 할 수 있습니다. 두 가지 변종에 대한 외관 시간의 ScanLag 분석 히스토그램의 비교. 블루 라인 : 야생 균주가 기하 급수적으로 (총 : 1,320 식민지를) 성장; 보온 박테리아 (: 1,529 식민지 전체)과 풍부한 레드 라인 높은 지속성 돌연변이. (A) 표준화 모양 히스토그램. 피크기하 급수적으로 증가하고 세포의 모양으로 검출 식민지로 성장하는 전형적인 시간이다. 인셋 : 바이 모달 래그 타임의 분포를 나타내는 로그 이격 된 빈들의 실제 지연 시간을 얻기 위하여, 지수 문화의 피크 시간을 뺀 후 변이주의 동일 히스토그램. (B) 로그 스케일의 (A)에서와 같은 데이터의 생존 기능. 이 표현은 돌연변이 균주의 늦은 모양의 꼬리를 강화한다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> 도 7. 외관 분포와 성장 시간 분포. (A)와 (B)는 두 차원 외형 시간의 히스토그램과 두 개의 서로 다른 조건 (소프트웨어가 상한에 도달하기 전에 병합 콜로니를 제외한다)의 성장 시간을 나타낸다. (C) 히스토그램을 비교성장 시간 (D)가 비슷한 반면 두 균주의 출현 시간의 차이는 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> 도 8. 초기 콜로니 외관 이후 콜로니의 모양을 방해하지 않는다. (A) 단독 도금 야생형 세포의 시간 분포를 지연. (B) 허용하는 온도로 전송 한 후, 혼자 추위에 민감한 긴장의 시간 분포를 지연. (C)는 동일한 조건에서 함께 도금 두 균주의 시간 분포를 지연. 블랙 라인은 별도로 각 스트레인을 측정 할 때 얻어진 데이터에 기초하여 예상 분포를 나타낸다. 좋은예상과 측정 분포간에 greement은 긴 플레이트 당 콜로니의 총 수가 200 이하로 얻어진다. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> ..도 9 검출 임계치는 콜로니 외형 분포의 형상에 영향을주지 않는 콜로니 외관 분포는 두 개의 서로 다른 임계 크기를 사용하여 동일한 데이터 세트에 대해 분석 하였다; (A)의 임계 크기는 10 픽셀입니다; (B) 임계 값의 크기가 50 픽셀이다. 히스토그램 당 셀 수 : 약. 1500. 다른 검출 임계치는 검출 시간의 시프트 초래한다. <img alt="그림 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> 10. 온도 안정성 측정 ACR 그림전원 관리하지 않고 스캐너를 성장 바실러스 subtillis의 식민지와 접시의 OSS 스캐너의 표면. (A) 이미지. 표면은 바닥에 워머 따라서 콜로니 빠르게 성장한다. 플레이트 옆 점진적 라인 열 구배의 개략도이다. (B)의 온도 안정성은, 스캐너의 표면에 걸쳐 배치 된 두 개의 써모 커플로 측정 하였다. 스캐너는 각 스캔 동안과 시간이 지남에 가열한다. (C) 전원 관리를 사용, 온도가 균일하고 식민지 비슷한 속도로 성장한다. (D) 전원 관리 모듈 (B)과 동일합니다. ± 0.2 ° C의 온도 안정성 <img alt="그림 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> 그림 11. 모양의 분포의 차이는 디 원인 일 수 있습니다고체 배지의 볼륨에 fferences. 동일한 세균 배양 한천 표면의 다른 높이의 결과, LB 한천의 다른 볼륨으로 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 서로 다른 높이가 접시의 다른 불투명도, 따라서 다른 검출 시간에했다. 간 판의 차이를 확인하고 서로 다른 높이의 조건의 차이했다. LB 한천의 30 ± 0.5 ml의 같은 부피의 판 사이 (A) 일반적인 차이. 서로 다른 높이의 조건 사이의 (B)의 차이는 : 모양 분포는 30 ± 0.5 ㎖ (녹색)의 40 ± 0.5 ㎖ (블루)의 20 ± 0.5 ㎖ (빨간색)의 볼륨과 번호판을 측정 하였다. 각 조건은 6 개의 다른 판의 평균입니다. 긴 플레이트의 양이 ± 5 ㎖의 범위 내에있는 한, 불투명도가 유사하고 유사한 외관 시간 분포에 이르게한다.

ScanLag는 성장 지연, 즉 지연 시간뿐만 아니라 병렬로 연결된 수천 개의 세포에 대한 콜로니의 성장 속도를 측정하기 위한 고처리량 방법입니다. ScanLag을 사용한 스크리닝을 통해 단일 변이 수준에서 긴 지연 시간과 느린 성장을 구별할 수 있습니다.

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아 배양액의 지연기 분포를 정량화하여, 단일 변이 수준에서 긴 지연 시간과 느린 성장을 구분할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 단일 컴퓨터로 식별되는 스캐너 어레이 설정을 구축함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 정의된 콜로니 형성 단위를 가진 박테리아 배양액을 일반적인 영양 한천이 포함된 페트리 접시에 도말하는 것입니다.다음으로, 디쉬를 스캐너의 전용 홀더에 배치하고 스캐너를 통해 콜로니의 타임랩스 이미지를 촬영합니다. 마지막 단계는 scan lag 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하는 것으로, 이 소프트웨어는 이미지를 자동으로 분석하여 각 콜로니의 출현 시간 및 성장 시간과 같은 정량적 파라미터를 추출합니다. 최종적으로, 이 데이터를 사용하여 MATLAB 함수를 통해 lag 히스토그램을 생성합니다.이 기술의 함의는 느린 변이체의 검출을 가능하게 함으로써 지속성 감염의 진단으로 확장됩니다. 우선, 관련 온도 및 습도 수준에서 작동 가능하며 광학 해상도 4,800 DPI, 하드웨어 해상도 4,800 x 9,600 DPI 및 48비트 컬러 비트 심도를 갖춘 플랫베드 스캐너를 선택하십시오. 컴퓨터에 하나 이상의 스캐너를 연결하고 식별할 수 있는 스캐너를 선택하십시오.페트리 접시는 특이하게도 상당한 부피를 가지고 있습니다. 상업용 스캐너에서 주로 사용하는 종이와 달리, 콜로니는 스캐너 표면에서 약 5mm 위에 있는 한천 층 위에 위치합니다. 대부분의 스캐너에서는 콜로니에 초점이 맞을 것입니다.페트리 접시를 고정하기 위해 플레이트를 덮을 멸균된 검정색 펠트 천 조각들을 준비합니다. 미생물 배양에 필요한 경우, 스캐너에 적합하며 접시 크기와 동일한 6개의 구멍이 있는 흰색 플레이트 홀더를 준비합니다. 스캐너를 온도 조절 환경에 배치합니다.스캐닝 매니저를 설치하기 위해 스캐너를 컴퓨터에 연결합니다. 스캔 래그(scan lag) 웹사이트에서 모든 스캐닝 매니저 애플리케이션 파일을 지정된 디렉토리로 복사합니다. Windows XP 운영 체제가 설치된 컴퓨터를 사용하고 microsoft.가 설치되어 있는지 확인하십시오..net framework 버전 2.0이 설치되었습니다. 중단됨. 컴퓨터 관리 장치 관리자의 이미지 장치에서 스캐너 이름을 확인하십시오. 그런 다음 해당 이름에 따라 스캐닝 관리자 설정 파일을 구성하십시오.실험을 수행하려면, 먼저 배양액을 밀리리터당 약 2000 CFU가 되도록 희석하십시오. 그 다음, 일반 영양 배지로 준비된 페트리 접시에 0.1 mL의 배양액을 균일하게 도말하십시오. 그런 다음 콜로니와 접시 사이의 대비를 높이고 수분을 흡수하기 위해 멸균된 검은색 펠트 천으로 접시를 덮으십시오.플레이트의 덮개를 닫고 스캐너의 홀더에 플레이트를 넣습니다. 스캐닝 매니저를 시작합니다. 연결된 스캐너 목록에서 참여 스캐너를 선택합니다.그런 다음 이미지 분석을 위해 촬영할 이미지 수, 연속 이미지 간의 시간 간격 및 실험 시작 전 지연 시간을 선택합니다. 먼저 MATLAB 명령 창을 사용하여 각 스캐너의 이미지를 개별 폴더로 분류합니다. 전처리를 수행하기 위해 prepare images를 먼저 실행하십시오.전처리를 통해 스캐너에서 얻은 이미지들을 정렬합니다. 각 이미지 시퀀스에서 개별 페트리 접시 영역을 잘라냅니다. 각 이미지가 수집된 시간은 타임스탬프 실행 기록에서 가져옵니다.검출 및 추적을 수행하기 위해 모든 플레이트의 타임랩스 영상을 촬영하며, 각 페트리 접시에서 검출된 콜로니에 식별 번호를 부여합니다. 검출된 각 콜로니의 크기를 시간의 함수로 측정합니다. MATLAB 명령 창을 사용하여 콜로니의 출현 분포를 추출합니다.먼저 scan lag 앱을 실행하여 특정 페트리 접시의 분석 내용과 콜로니의 시간에 따른 크기 변화 그래프를 함께 표시합니다. 그다음 슬라이더를 사용하여 플레이트의 현재 시간을 변경하십시오. 시간은 콜로니의 영역 그래프에 표시되는 일치하는 수직선으로도 나타납니다.콜로니를 클릭하면 관련 곡선이 표시되며, 반대로 곡선을 클릭하면 해당 콜로니가 표시됩니다. 콜로니를 확인한 후, 해당 페트리 접시에서 콜로니를 피킹하여 표현형을 회수할 수 있습니다. 콜로니를 선택하고 제외 버튼을 클릭하여 자동 분석의 오류를 필터링하십시오.'제외(exclude)'를 클릭하면 콜로니 번호가 노란색으로 변합니다. 각 플레이트의 분석 결과를 확인한 후, 결과값을 합산하십시오. 첫 번째 런(run)의 경우, 히스토그램을 추가하여 출현 빈도 히스토그램을 작성하십시오.그 후 plot death curve를 실행하여 분포에 대한 생존 곡선 표현을 생성합니다. 지연 시간 분포 추출의 예시가 여기에 표시되어 있습니다. Scan lag를 통해 스크리닝 분석에서와 같이 한 플레이트 상의 각 콜로니를 특정 특성에 따라 시간에 따라 식별하고 추적할 수 있습니다.미생물 배양물이 불균질할 때, 서로 다른 하위 집단이 분석 과정에서 드러날 수 있습니다. 이 그림은 출현 정량화를 보여주며, 이를 통해 e coli 돌연변이 균주에서 이봉형(bimodal) 지체기 시간 분포가 나타남을 보여줍니다. 여기에는 두 가지 서로 다른 조건에서의 출현 시간과 성장 시간에 대한 2차원 히스토그램이 제시되어 있습니다.두 균주의 히스토그램을 비교하면 성장 시간은 비슷하지만, 출현 시간에서는 차이가 나타납니다. 콜로니가 동일한 속도로 성장할 때, 늦은 출현은 지연기(lag time)에 기인한 것으로 볼 수 있습니다. 먼저 출현한 콜로니가 나중에 출현하는 콜로니에 미치는 영향을 조사하였습니다.여기에 단독으로 도말한 야생형 세포의 유도기 시간 분포와 냉감 민감성 균주의 유도기 시간 분포가 나타나 있습니다. 허용 온도 내로 옮긴 후 단독으로 도말한 대조 실험을 통해, 플레이트당 총 콜로니 수가 200개를 초과하지 않는 한 이후의 출현은 영향을 받지 않음을 확인하였습니다. 이 절차에 따라.표현형이 유전적인지 또는 후성유전적인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 흥미로운 성장 표현형을 보이는 콜로니를 대상으로 전장 유전체 서열 분석이나 발현 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Kurokawa, M. 외. 세균 성장의 정밀하고 고처리량 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 마이크로플레이트 리더를 이용한 박테리아 성장의 고처리량 정량을 시연합니다. 배양 준비, 광학 밀도 측정, 성장 역학 분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

마이크로플레이트 리더를 이용한 세균 성장의 정밀하고 고처리량 분석

이 동영상은 콜로니 형성 단위 분석을 통해 대식세포의 리스테리아 모노사이토제네스 감염을 결정하기 위한 체외 정량화 기술을 보여줍니다. 한천 플레이트의 박테리아 군집은 숙주 방어 메커니즘을 벗어나 대식세포 내에서 생존하는 세포 내 박테리아 집단을 나타냅니다.

Colony-Forming Unit Assay에 의한 숙주 세포의 박테리아 감염 정량화

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 개별 효모 세포의 증식 표현형을 정량화하기위한 방법을 제시한다.이 효소 세포는 누룩의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling 평가라고 불리는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라 난다. 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포의 인구 이질성을 직접 관찰하고 정량화 할 수 있습니다.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

이 방법은 콜로니 형성 단위(CFU)를 플레이트하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 미생물 풍부도를 정량화하고 전체 파리 균질물 샘플의 초파리 마이크로바이옴에 적용됩니다. CFU는 여기에 제공된 자동 이미지 분석 소프트웨어로 계산됩니다.

초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수

배우세요 고처리량 이미징을 활용한 세균 식민지 성장 지연 시간 및 성장률 정량화 방법입니다. 이 기술은 단일 변이체 수준에서 긴 지연 시간과 느린 성장을 구별하여 미생물 집단의 성장 특성 연구에 활용됩니다.

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

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