ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

ODELAY의 전반적인 목표는 높은 처리량 방식으로 콜로니로 성장하는 개별 세포의 성장 표현형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 미생물학, 유전학 및 시스템 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 군체를 형성하는 미생물의 성장 표현형에 대한 유전적 섭동 및 약물 상호 작용의 영향과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. ODELAY의 주요 장점은 연구자가 많은 개체 간의 집단 이질성을 직접 관찰하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

한천 주형을 조립하기 전에 아크릴 주형을 70% 에탄올로 세척하고 강제 공기를 사용하여 건조시킵니다. 3 개의 바닥 조각과 2 개의 직립 조각이 있습니다. 한천 주형의 조립을 시작하려면 세 개의 하단 조각을 가져 와서 두 개의 동일한 조각이 세 번째 조각을 끼우도록 조립합니다.

두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 양쪽의 기본 조각을 고정합니다. 레이저 곡선이 올바른 위치에 있는지 확인하면서 업라이트를 금형에 놓습니다. 세척 및 건조된 유리 슬라이드를 금형에 놓고 제자리에 고정하면서 반대쪽에 두 번째 유리 슬라이드를 놓습니다.

더 큰 바인더 클립으로 어셈블리를 고정합니다. 더 큰 바인더 클립으로 두 슬라이드를 모두 조여 각 상단 바인더 클립이 아크릴과 겹치는 유리 슬라이드와 접촉하는지 확인합니다. 조립된 금형에 용융된 한천을 채우기 전에 금형 내부를 따라 약 70마이크로리터의 용융된 한천 매체를 피펫팅하여 가장자리를 밀봉했는지 확인하십시오.

금형 가장자리를 따라 용융된 한천을 천천히 피펫팅하여 내부에 기포를 가두지 않고 금형을 채웁니다. 금형을 채운 후 약 섭씨 23도, 주변 온도에서 40-60분 동안 냉각시킵니다. 다음 단계는 금형 분리입니다.

하단 바인더 클립을 제거하여 시작합니다. 그런 다음 세 개의 샌드위치 조각으로 구성된 금형의 바닥 부분을 제거합니다. 슬라이드를 압축하여 잡고 바인더 클립을 조심스럽게 제거합니다.

파란색 점이 있는 금형의 측면이 위를 향하도록 벤치 상단 가장자리에 금형을 놓습니다. 아크릴 아래에 두 엄지 손가락을 놓고 위쪽의 첫 번째 손가락을 금형의 안쪽 가장자리를 향해 놓고 금형 스페이서를 아래쪽 가장자리로 회전시키는 것처럼 엄지 손가락으로 금형에 대해 천천히 조심스럽게 밀어 올립니다. 일정하지만 천천히 압력을 가하십시오.

파손과 기포가 상단 유리가 금형 스페이서를 덮는 선을 따라 나타나야 합니다. 초기 브레이크 라인을 본 후 두 엄지 손가락으로 계속 밀어 올리고 일정한 압력을 가합니다. 한천이 유리에서 떨어져 나가기 시작해야합니다.

금형을 위쪽으로 계속 회전합니다. 유리가 완전히 무료로 나오면 유리를 잡고 금형에서 완전히 제거합니다. 그런 다음 유사한 동작으로 다른 금형 조각을 제거하여 한천을 움직이지 않고 조각을 들어 올립니다.

바닥에 약간의 멸균 고순도 물이 있는 멸균 팁 상자에 슬라이드를 놓습니다. 상자를 닫고 다음 날 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에서 균주를 준비하여 이 절차를 시작합니다.

플레이트 리더를 사용하여 각 배양의 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 자동 희석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 배양물을 600나노미터에서 약 0.1의 광학 밀도로 희석합니다. 희석 프로그램이 설정되면 데크 레이아웃에 표시된 대로 플레이트, 튜브 및 팁을 액체 처리 로봇의 데크에 로드합니다.

재생 버튼을 클릭하여 희석 프로그램을 실행합니다. 올바른 50마이크로리터 팁 수와 올바른 300마이크로리터 팁 수를 선택합니다. 희석이 완료되면 로봇에서 희석판을 제거하고 습도를 유지하면서 섭씨 30도에서 플레이트를 배양하여 플레이트가 5-6시간 동안 건조되는 것을 방지합니다.

배양 플레이트의 배양이 완료되기 약 1-2시간 전에 현미경용 배양 챔버를 켜고 섭씨 30도에서 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 동일한 자동 희석 프로토콜을 사용하여 600나노미터에서 0.01 - 0.02의 광학 밀도로 배양물을 두 번째로 희석합니다. 희석판을 금속 냉동고 씰로 덮고 플레이트를 얼음물에 띄운 상태에서 얼음 수조에서 30초 동안 초음파 처리합니다.

4개의 96웰 평평한 바닥 플레이트를 1개, 2개, 3개, 4개로 표시합니다. 이 패턴에 따라 희석판에서 평평한 바닥 판으로 각 초음파 처리 배양액 150 마이크로 리터를 옮깁니다. 우물 A1에서 D6 플레이트 1의 우물 C4에서 F9로.

우물 A7에 D12는 플레이트 2의 우물 C4에 F9입니다. 우물 E1에서 H6 플레이트 3의 우물 C4에서 F9로. 그리고 우물 E7에서 H12는 플레이트 4의 우물 C4에서 F9로 들어갑니다.

이 절차를 시작하려면 아가로스 슬라이드를 슬라이드 챔버에 올바르게 놓습니다. 다음으로 96개의 웰 평평한 바닥 플레이트를 사분면 순서대로 테이블에 놓습니다. 플레이트 1, 2, 3, 4는 왼쪽에서 오른쪽으로.

각 팁 상자의 내부 24개 웰이 팁으로 채워지도록 4개의 빈 팁 상자에 팁을 배치합니다. 다섯 번째 상자에서 팁을 C10 위치에 놓고 끝이 잘린 팁을 A1, A12, H1 및 H12 위치에 놓습니다. 이 4개의 차단 팁은 팁 플레이트 클램프에 안정성을 제공합니다.

첫 번째 팁 펀치를 로봇 제어 스포팅 프로그램의 시작 위치에 놓고 나중에 원점 좌표를 정렬하는 데 사용할 아가로스에 구멍을 뚫습니다. 액체 취급 로봇에 Plate One을 놓고 첫 번째 사분면을 찾습니다. 뚜껑을 제거하고 스포팅 프로그램을 계속합니다.

모든 반점이 있는지 확인하십시오. 사용한 팁을 생물학적 위험 용기에 비우고 로봇에 새 팁을 놓습니다. 반점이 직경 약 30mm로 건조될 때까지 약 1초 동안 기다린 다음 프로그램을 계속합니다.

플레이트 1을 플레이트 2로 교체하고 스포팅 프로그램을 계속하십시오. 4개의 사분면이 모두 발견되고 반점이 건조되면 슬라이드 챔버 덮개를 교체하고 장치를 뒤집습니다. 슬라이드 챔버의 위쪽에 유리 슬라이드를 놓습니다.

먼저 슬라이드 챔버를 현미경에 로드합니다. 타임 랩스 현미경 검사는 맞춤형으로 설계된 스크립트를 실행하여 수행됩니다. 셔터를 클릭하여 투과광 셔터를 연 다음 초점 버튼을 눌러 높은 카메라 속도를 시작합니다.

Go Origin"을 클릭하고 스테이지를 이동하여 한천에 펀칭된 원점 마크를 찾은 다음 약간 오른쪽으로 이동하여 E7 영역에서 발견된 셀에 초점을 맞춥니다. 원점 펀치로 다시 이동하여 시야의 중앙에 놓습니다. Set" 버튼을 눌러 원점을 이 값으로 설정합니다. H18 위치로 이동하고 해당 위치에 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다.

그런 다음 L7 위치로 이동하고 해당 위치에 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. 마지막으로 E7 위치로 이동하고 해당 위치에 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. E12, H12 및 L12 지점에서 중앙과 가장자리의 초점을 확인하고 z 값으로 표시된 초점 z 값이 자동 초점 범위보다 크거나 빼기가 되면 자동 초점 범위를 조정합니다.

Reset" 버튼을 누른 다음 ODELAY를 누릅니다. 데이터를 저장할 디렉토리를 선택합니다. 현미경은 48시간 동안 또는 프로그램이 종료될 때까지 데이터를 수집합니다.

이 대표적인 타임랩스 이미지는 효모 세포가 발견 후 0시간, 3시간, 6시간, 9시간 동안 고체 배지에서 성장하는 것을 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 타임랩스 이미지를 처리한 후 두 효모 균주를 비교하는 대표적인 데이터 세트입니다. 상대적으로 균일한 더블링 시간은 잘 준비된 아가로스 슬라이드를 반영하지만, 최적이 아닌 자동 초점 설정으로 인해 지연 시간이 상당히 다릅니다.

더 일관된 데이터 세트가 여기에 표시되어 있으며, 모든 더블링 시간이 잘 겹치는 것처럼 보이고 지연 시간이 일관된 것으로 보입니다. 일단 마스터하면 ODELAY의 설정이 제대로 수행되면 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 반복 가능한 ODELAY 측정을 위한 가장 중요한 단계는 매체를 일관되게 준비하고 슬라이드를 분리하는 동안 매체가 기계적으로 변형되지 않도록 하는 것입니다.

ODELAY는 매우 민감한 분석법입니다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 스팟 기반 분석법은 성장 결함을 나타내기 위해 섭씨 37도에서 효모를 배양해야 하는 실온에서 온도에 민감한 효모 균주의 성장 결함을 관찰할 수 있습니다. ODELAY는 효모에서 개발되었지만, 이 방법은 병원체를 포함한 모든 집락 형성 유기체에 적용할 수 있어 광범위한 환경 및 유전 조건을 탐색하여 미생물의 행동을 이해할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 고체 배지에서 군체를 형성하는 단세포 미생물의 성장 표현형을 측정하기 위해 ODELAY를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으며 연구된 유기체에 적합한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.