Name: ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 대규모 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 고체배지에서 효모 식민지로 성장하는 개별 세포의 성장 표현형을 시간 경과 현미경으로 정량화하는 ODELAY 방법을 통해. 이 기술은 유전적으로 동일한 세포 간 집단 이질성을 직접 관찰하고 측정하여 미생물학 및 유전학 연구에 활용됩니다.

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저자는 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 JDA에 U54 RR022220 및 P50 GM076547 교부금으로이 연구에 대한 지원을 인정합니다. FDM은 Canadian Institute for Health Research의 박사후 연구원입니다. 우리는 룩셈부르크 시스템 생물 의약 센터와 룩셈부르크 대학의 지원에 감사드립니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

ODELAY 분석법은 재현 가능하고 신뢰할 수있는 표현형 측정을 보장하기위한 몇 가지 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 첫 번째 중요한 점은 효모 배양 물의 일관된 준비입니다. 로그 성장에서 효모 세포를 수확하기 위해주의를 기울여야합니다. 양식이 포화 된 경우, 개체군의 이질성이 증가하여 유전 적 또는 환경 적 요인 ( 예 : 탄소원)으로 인한 이질성을 혼란스럽게 할 수 있습니다 11 . 두 번째 중요한 점은 일관된 미디어 준비입니다. 일반적으로 대량의 10X 스톡 미디어 솔루션을 생성 한 다음 배치 효과를 최소화하기 위해 시간 경과에 따라 사용해야합니다. 가능하면 체중으로 배지를 배합하는 것은 한천의 밀도와 아가로 오스의 전체 수분 함량을 면밀히 관찰함으로써 시간이 지남에 따라 배지의 일관성을 향상시키는 데 도움이됩니다. 세 번째 중요한 포인트는 아가로 오스의 기계적 변형을 최소화하거나 제거하는 것입니다.dia. 매체의 기계적 변형은 유리 슬라이드에서 아가로 오스를 분리하는 동안 가장 일반적으로 발생합니다. 많은 실험 기술과 마찬가지로이 단계를 익히려면 실습이 필요합니다. 도 4 에 도시 된 바와 같은 지연 시간의 변화는 종종 아가로 오스 배지의 기계적 변형, 성형 된 한천 두께의 변화 또는 불안정한 광원과 같은 3 가지 요인 중 하나와 관련된다. 아가로 오스 매체가 얼룩이 지어진 어레이에서 Z 높이가 변하면 높이 변화가 자동 초점 루틴의 범위를 압도하여 초기 이미지의 초점이 약간 벗어날 수 있습니다. 이러한 이유 때문에 중앙의 여러 지점에서 스포트라이트 된 어레이의 가장자리를 따라 초점 높이를 확인하여 자동 초점 루틴이 초점을 찾을 수있는 충분한 Z 범위를 갖도록하십시오. 필요한 경우 자동 초점 패널을 사용하여 초점 범위를 늘리고 초점 단계 수를 늘립니다. 세 번째 가능한 조건이온은 불안정하거나 깜박 거리는 광원으로 특정 Z 높이에 대해 계산 된 초점 점수를 방해 할 수 있습니다. 텅스텐 할로겐 전구는 전구가 다 타기 전에 잘 깜박입니다. 열악한 초점의 효과는 성장 곡선이 제 1 및 제 2 시점 ( 도 5a ) 사이에서 감소하고, 인접한 지점이 동일한 딥 ( 도 5b )을 갖지 않는 일례에서 관찰된다. 이 경우, 빈약 한 초점 상태는 텅스텐 할로겐 광원을 대체함으로써 완화되었다. 실제로 저자들은 100W 텅스텐 할로겐 전구의 깜박 거림을 줄이기 위해 현미경을 많이 사용할 때 500 시간마다 또는 대략 2 개월마다 전구를 교체해야한다는 사실을 발견했습니다. 깜박 거리는 전구로 인한 초점 문제를 피하려면 텅스텐 할로겐 광원을 자주 교체하거나 할로겐 전구를 다이오드 광원으로 교체하십시오. 안그림 6 은 배가 시간의 변화가 적고 균일 한 지연 시간을 보이는 데이터 세트의 예입니다. 이 데이터 세트는 오토 포커스를 수행하는 동안 시간이 지남에 따라 더 안정적인 조명을 제공하는 다이오드 조명 장치로 촬영되었습니다. 문헌에서 미디어 준비를 최적화하기 위해 여기에 언급 된 많은 점들이 명백하게 보일 수 있지만, 대부분의 대규모 스크린은 서로 잘 복제되지 않습니다 8 , 11 . 따라서, 우리는 재현 가능한 표현형 스크린이 생성 될 수 있도록 배양 물 및 아가 로스 배지의 준비를주의 깊게 기술 하였다. ODELAY 분석법은 합성 유전자 배열이나 Scan-O-Matic 분석법과 같은 피닝 기반 분석법과 비교할 때 현재 처리량이 제한적입니다. 이 방법은 측정되는 균주의 수를 증가 시키지만, 개별 세포를 분해하는 능력은 부족합니다.그러므로 우리는 clonal 효모 균주 내에서 관찰 된 개체 이질성을 측정 할 수 없다. 이 개체의 이질성의 기원은 현재 이해되지 않지만 여기에 설명 된대로 기술과 계산의 병합은 기본 세포 메커니즘을 객관적으로 다루기위한 기회를 제공합니다 12 . 저자는 ODELAY가 현재 특정 현미경 브랜드 및 신체 유형에 대해서만 최적화되어 있음을 참고하고자합니다. 다른 현미경 시스템 용으로 ODELAY를 수정하는 것은 간단하지만 오픈 소스 API 13에 대한 지식이 필요합니다. 그러나 API와 ODELAY 스크립트는 서로 다른 시스템과 실험 분석에 쉽게 적용 할 수 있도록 작성되었습니다. ODELAY는 원래 효모를 위해 개발되었지만 변형없이 Mycobacterium smegmatis의 성장을 관찰 할 수있었습니다. 미생물을 형성하는 다른 콜로니의 관찰은제공된 소스 코드에 대한 변경으로 가능 11 . 일반적으로, ODELAY는 다양한 환경 조건과 유전 섭동 하에서 성장한 미생물을 비교하기위한 강력하고 유연한 도구입니다.

미생물의 성장 phenotypes은 주어진 환경 조건에 대한 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표입니다. 성장은 고전적으로 3 개의 다른 성장 체제로 구분됩니다 : 지연 기, 로그 기 및 정지상 성장 1 . 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건에 따라 달라지는 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 유기체가 기하 급수적 인 성장을 시작하기 전에 지연 단계에 머무르는 시간 또는 지연 시간은 변화된 환경 조건에 반응하는 유기체의 능력을 나타낼 수 있습니다 2 . 생체 적합도의 가장 보편적 인 측정 기준 인 로그 - 위상 성장 동안 배가되는 시간은 복제를 위해 환경 물질을 대사 및 이용함으로써 생물체가 분열하는 능력의 전반적인 효율성을 보여줍니다. 로그 위상 이후의 성장이 급격히 감소하는 고정 위상 (stationary phase)은 피트니스의 또 다른 지표로, 규칙적인spot-based 효모 성장 분석에서 성장 종점으로 사용됩니다. 몇몇 효모 성장 분석은 현재 이용 가능하며 효모 3 , 4 , 5 에서 성장 표현형을 평가하기위한 표준 방법으로 고려됩니다. 이 분석법은 주로 고체 또는 액체 배지에서 효모를 성장시키는 방법을 기본으로합니다. 고체 배지에서, 콜로니 피닝 분석은 핀으로 고체 한천에 소수의 세포를 옮기고 효모 세포는 정의 된 기간 동안 성장하도록 허용됩니다. 식민지가 그 다음에 이미지화되고 종단점에서 크기가 비교된다. 이러한 콜로니 고정 분석법은 유전체 와이드 스크린을 생성하기 위해 견고하고 확장 성이 입증되었습니다. 최근에는 flat-bed 스캐너와 SLR (Single Lens Reflex) 카메라를 사용하는 주기적 이미징이 이러한 분석에 통합되어 시간 경과에 따른 콜로니 증가를 기록합니다 7 , 8, 9 . 그러나, 이들 장치의 해상도는 단일 세포를 검출하는 것을 방해하므로, 이러한 콜로니 피닝 검정법은 래그 시간을 직접 관찰하지 않고 콜로니로 성장하는 개별 세포들 사이의 변이를 관찰 할 수 없다. 액체 기반 성장 분석은 또한 게놈 전체 화면을 수행하기 위해 사용되었습니다 3 . 시간 경과 현미경으로 액체 성장 분석을 결합하면 유전 적으로 동일한 개별 세포의 배가 시간에 인구 이질성이 나타 났으며 이는 유전 조절과 환경 적응을 이해하는 데 중요한 관점을 제공합니다. 그러나이 분석은 지연 시간 및 운반 용량과 같은 다른 성장 측면을 측정하지 않습니다. 여기에 우리는 ODELAY 11 이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 미생물을 형성하는 세 가지 성장 단계를 특성화하는 방법을 제시합니다. ODELAY는 utili로 구성되어 있습니다.높은 처리량의 시간 경과 현미경으로 고체 세포에서 단일 세포가 식민지로 자라는 이미지를 기록합니다. 식민지로 자라는이 개별 세포 집단은 종말 종점 점수와 같은 덜 민감한 측정치에 의해 검출되지 않는 근본적인 개체 이질성을 나타낸다. 우리는 효모에 대한 방법을 시연하지만, ODELAY는 명 시야 현미경에서 대조를 보이는 모든 유기체에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>겔 온도 36C, 겔 강도(1%) 1.2g/sq cm</td></tr><tr><td>효모 추출물 펩톤(YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>완전 용해 혼합물(CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 3350(av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>효모 균주 BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>효모 균주 BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 케이스</td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 인치 1.0mm 두께 슬라이드 1/2 총</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트 플랫 바텀</td><td>코닝</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Hydra 액체 핸들링 로봇</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star 액체 핸들링 로봇</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL 팁 확장 길이 DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 10X/0.3NA 대물렌즈</td><td>라이카</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>하마마츠 ORCA 플래시 4.0 카메라</td><td>하마마츠</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 이미지 처리 도구 상자</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY 현미경 제어(MATLAB 스크립트 및 GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY Matlab 스크립트 및 소프트웨어의 경우 ODELAY</td></tr><tr><td>현미경 챔버</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY 기계 도면의 경우 ODELAY</td></tr><tr><td>한천 금형</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY 금형 도면의 경우</td></tr></tbody></table>

odelay : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

미생물의 성장 phenotypes은 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표이며, 3 가지 성장 체제 : 래그 - 위상, 로그 - 위상 및 정지 - 위상으로 분리 될 수있다. 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건과 관련된 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 3 가지 성장 단계의 고해상도 및 정량 측정은 일반적으로 어렵습니다. 여기에서는 효모의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling Evaluation이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 3 가지 성장 단계를 모두 특성화하는 상세한 방법을 제시합니다. ODELAY는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라는 개별 세포의 성장 표현형을 정량화합니다. 이 방법은 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포에서 각 성장 매개 변수로 개체 이질성을 직접 관찰 할 수 있습니다. 이 집단의 이질성은 유전 적 및 후 성적 규제를 이해하는 독특한 관점을 제공하며유전 및 환경 섭동. ODELAY 방법은 효모를 사용하여 시연되지만 밝은 영역 현미경으로 보이는 모든 콜로니 형성 미생물에 활용할 수 있습니다.

<html> 시간 경과 현미경으로 성장하는 효모의 예제 이미지는 그림 3B에 표시됩니다. 시간 경과 영상을 처리 한 후 효모 균주 BY4741 및 BY4742를 비교하는 대표적인 데이터 세트가 그림 4에 나와 있습니다. 이 예제 데이터 세트에서는 플레이트의 서로 다른 위치 사이에서 배가 시간이 거의 변하지 않았습니다. 아가로 오스 매체가 제대로 준비되지 않은 경우, 아가로 오스 겔의 변형 된 영역과 일치하는 스폿 위치에서 두 배가되는 시간과 지연 시간에 명백한 편차가있을 것입니다. 두 배의 시간은 상대적으로 균일 한 것처럼 보이지만,이 예는 지연 시간 측정의 변화를 보여줍니다. 보다 일관된 데이터 세트가 그림 6에 나와 있습니다. 이 데이터 세트에서 지연 시간과 배가 시간은 일정합니다. files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : Agar Mold Assembly. 한천 몰드의 성분은 ( A )에 표시되어있다. ( B )와 같이베이스를 조립 한 다음 작은 바인더 클립으로베이스를 고정하십시오. 더 긴 수직 조각을베이스의 공동 ( C )에 놓은 다음 ( D )와 같이 슬라이드를 몰드에 넣습니다. 유리 슬라이드 ( E )에서 한천을 일관되게 분리하는 데 필요한 금형 절단 각도 및 금형 각도를 보여주는 측면도. 엄지 손가락과 집게 손가락의 위치와 한천의 직선을 슬라이드 ( F )에서 분리하고 수평 화살표를 확인하십시오. 분리 선은 수직 화살표 방향으로 균등하게 떨어져야합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> = &quot;jove_content&quot;fo : keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> 그림 2 : Sonication 및 스포팅 방법. 플레이트를 얼음물로 초음파 처리하고 원심 분리기 버킷 홀더를 사용하여 플레이트 ( A )를 받쳐줍니다. 아가로 오스 판 ( B )에 점을 찍기 위해 3.8.1 단계의 판을 놓으십시오. 또한 가장 왼쪽의 팁 상자에 C10 위치에 팁 하나가 있고 그 다음 4 개의 다른 끝이 잘려있어 플레이트 홀더 ( C )가 부러지지 않도록 팁을 정렬하십시오. 나머지 24 개의 팁을 4 개의 상자에 놓고 내부 24 개의 팁 위치가 채워지도록하십시오 ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : ODELAY 그래픽 사용자 인터페이스. &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot;( A )에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷. 이 인터페이스는 카메라를 모니터링하고 epifluorescent 및 bright-field 모드의 현미경 조명 설정을 조정합니다. 빨간색 화살표는 Focus 및 Transmitted 버튼을 가리키고 카메라를 활성화하여 이미지를 빠르게 획득하고 전송 된 광 셔터를 각각 엽니 다. 파란색 화살표는 원점에 대한 스테이지 이동 및 &quot;원점 이동&quot;버튼과 &quot;설정&quot;버튼으로 원점을 설정하는 데 사용됩니다. 녹색 화살표가 &quot;재설정&quot;및 &quot;ODELAY !!!&quot;를 가리 킵니다. 버튼을 사용하여 ODELAY 이미지 모드를 현재 상태로 재설정하고 ODELAY 이미지 수집을 시작합니다. 얼룩이 진 후 0, 3, 6, 9 시간에 고체 배지에서 성장하는 효모의 저속 영상 ( B ). &quot;ODELAY_IPT.m&quot;또는 th에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷<html> e ODELAY 이미지 처리 도구 ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> 그림 4 : ODELAY 출력의 예. 이 데이터 세트는 YPD 미디어의 BY4741 및 BY4742 변형을 비교합니다. 이 그림은 잘 준비된 아가로 오스 슬라이드의 예입니다. 그러나 자동 초점 설정이 최적이 아닙니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 각 열에 표시되는 데이터는 다음과 같습니다. 식민지 영역의 Log 2 에 수용 할 수있는 용량. 분당 시간, 분 단위로 주어진다. 지체 시간 (min). 이 예제에서 한천 슬라이드의 모든 스팟의 배가 시간은 칼럼을 향한 두 배의 증가 된 시간으로 잘 정렬됩니다. 그러나 지연 시간은이 데이터 세트에서 상당히 다릅니다._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> 그림 5 : 성장 곡선의 예. 이 예는 불량한 초기 초점으로 인해 예상 지연 시간 (t 지연 )이 증가 할 수있는 ( A ) 반면 인접 위치는 지연 시간이 더 짧다는 것을 보여줍니다 ( B ). t d 는 분 단위의 배가 시간이고 t lag 는 분 단위의 지연 시간입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="도 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> 그림 6 : 잘 실행 된 테스트 실험의 예 전자텅스텐 할로겐 전구를 다이오드 조명 장치로 교체하고 자동 초점이 올바르게 설정되었는지 확인한 후 BY4742 스트레인의 한 예. 모든 배증 시간은 잘 겹치고 지연 시간은 일정한 것처럼 보입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 개별 효모 세포의 증식 표현형을 정량화하기위한 방법을 제시한다.이 효소 세포는 누룩의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling 평가라고 불리는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라 난다. 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포의 인구 이질성을 직접 관찰하고 정량화 할 수 있습니다.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

ODELAY의 전반적인 목표는 군집으로 성장하는 개별 세포의 성장 표현형을 고처리량 방식으로 측정하는 것입니다. 이 방법은 유전적 섭동 및 약물 상호작용이 군집 형성 미생물의 성장 표현형에 미치는 영향과 같이 미생물학, 유전학 및 시스템 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. ODELAY의 주요 장점은 연구자가 수많은 개체 사이의 집단 이질성을 직접 관찰하고 정량화할 수 있다는 점입니다.한천 몰드를 조립하기 전, 아크릴 몰드를 70% ethanol로 세척하고 강제 공기로 건조합니다. 바닥 조각 세 개와 수직 조각 두 개가 있습니다. 한천 몰드 조립을 시작하려면 바닥 조각 세 개를 가져와 두 개의 동일한 조각이 세 번째 조각을 양옆에서 감싸도록 조립합니다.두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 양쪽의 베이스 조각을 고정하십시오. 레이저 곡선이 올바른 위치에 오도록 확인하며 지지대를 몰드에 배치하십시오. 깨끗하게 세척하고 건조시킨 유리 슬라이드를 몰드 위에 놓고, 반대편에 두 번째 유리 슬라이드를 배치하는 동안 이를 고정하십시오.어셈블리를 더 큰 바인더 클립으로 고정합니다. 상단 바인더 클립이 아크릴과 겹치는 유리 슬라이드에 닿도록 하여 두 슬라이드 모두를 더 큰 바인더 클립으로 고정합니다. 조립된 몰드에 용융 아가(molten agar)를 채우기 전, 몰드 내측을 따라 약 70 µL의 용융 아가 배지를 피펫팅하여 가장자리가 밀봉되었는지 확인합니다.녹은 agar를 몰드의 가장자리를 따라 천천히 피펫팅하여 내부로 공기 방울이 들어가지 않도록 몰드를 채웁니다. 몰드가 채워지면 약 23°C의 상온에서 40-60분 동안 식힙니다. 다음 단계는 몰드 분리입니다.먼저 하단 바인더 클립을 제거합니다. 그런 다음 세 개의 조각이 겹쳐져 있는 몰드의 하단부를 제거합니다. 슬라이드를 눌러 고정한 상태에서 바인더 클립을 조심스럽게 제거하십시오.몰드의 파란색 점이 있는 면이 위를 향하도록 실험대 가장자리에 놓습니다. 양쪽 엄지손가락을 아크릴 아래에 두고, 검지손가락을 몰드의 안쪽 가장자리를 향해 상단에 배치한 다음, 몰드 스페이서를 하단 가장지를 중심으로 회전시키듯이 엄지손가락으로 몰드를 천천히 조심스럽게 밀어 올립니다. 일정하면서도 천천히 증가하는 압력을 가합니다.몰드 스페이서(mold spacer)를 덮고 있는 상단 유리의 경계선을 따라 균열과 기포가 나타나야 합니다. 초기 균열선이 보이면 양지엄손가락으로 계속 밀어 올리며 일정한 압력을 가하십시오. 그러면 한천(agar)이 유리에서 떨어지기 시작할 것입니다.몰드를 계속해서 위쪽으로 회전시킵니다. 유리가 완전히 분리되면 이를 잡고 몰드에서 완전히 제거하십시오. 그런 다음, 아가(agar)를 움직이지 않도록 주의하며 비슷한 동작으로 다른 몰드 조각을 들어 올려 제거하십시오.슬라이드를 바닥에 멸균 고순도 물이 약간 담긴 멸균 팁 박스에 넣습니다. 박스를 닫고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 다음 날 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에 균주를 준비하여 이 절차를 시작하십시오.플레이트 리더를 사용하여 각 배양액의 600nm에서의 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로 자동 희석 프로토콜을 사용하여 플레이트 내의 배양액을 600nm에서의 광학 밀도가 약 0.1이 되도록 희석합니다. 희석 프로그램 설정이 완료되면 덱 레이아웃에 명시된 대로 플레이트, 튜브 및 팁을 액체 핸들링 로봇의 덱에 배치합니다.재생 버튼을 클릭하여 희석 프로그램을 실행하십시오. 50 µL 팁과 300 µL 팁을 각각 필요한 개수만큼 선택하십시오. 희석이 완료되면 로봇에서 희석 플레이트를 꺼내고, 플레이트가 마르는 것을 방지하기 위해 습도를 유지하면서 30 °C에서 5~6시간 동안 배양하십시오.배양 플레이트의 배양이 완료되기 약 1~2시간 전에 현미경용 배양 챔버의 전원을 켜고 30°C에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 동일한 자동 희석 프로토콜을 사용하여 배양액을 600nm에서의 광학 밀도가 0.01에서 0.02가 되도록 다시 한번 희석합니다. 희석 플레이트를 금속 냉동 밀봉재로 덮고, 플레이트를 얼음물에 띄운 상태에서 얼음욕(ice bath) 내에서 30초 동안 초음파 처리합니다.4개의 96웰 평저 플레이트에 각각 1, 2, 3, 4라고 표시합니다. 희석 플레이트에서 초음파 처리된 각 배양액 150 µL를 다음 패턴에 따라 평저 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 1의 C4에서 F9 웰로 A1에서 D6 웰의 내용물을 옮깁니다.A7에서 D12까지의 웰을 Plate Two의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다. E1에서 H6까지의 웰을 Plate Three의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다. 그리고 E7에서 H12까지의 웰을 Plate Four의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다.이 절차를 시작하려면 아가로스 슬라이드를 슬라이드 챔버에 올바르게 배치하십시오. 다음으로 96-well 평底 플레이트를 사분면 순서대로 테이블 위에 배치합니다. 왼쪽부터 오른쪽으로 플레이트 1, 2, 3, 4 순으로 배치하십시오.4개의 빈 팁 박스에 팁을 배치하여 각 팁 박스의 내부 24개 웰이 팁으로 채워지도록 합니다. 다섯 번째 박스에는 C10 위치에 팁을 배치하고, A1, A12, H1, H12 위치에는 끝부분이 잘린 팁을 배치합니다. 이렇게 잘린 4개의 팁은 팁 플레이트 클램프의 안정성을 제공합니다.로봇 제어 스포팅 프로그램의 시작 위치에 첫 번째 팁 펀치를 배치하여, 이후 원점 좌표를 맞추는 데 사용할 아가로스에 구멍을 뚫습니다. 액체 핸들링 로봇에 플레이트 1을 배치하여 첫 번째 사분면을 스포팅합니다. 뚜껑을 제거하고 스포팅 프로그램을 계속 진행합니다.모든 스폿이 생성되었는지 확인하십시오. 사용한 팁은 바이오하저드 폐기함에 버리고 로봇에 새 팁을 장착하십시오. 스폿의 직경이 약 1mm가 될 때까지 약 30초 동안 건조시킨 후 프로그램을 계속 진행하십시오.플레이트 1을 플레이트 2로 교체하고 스포팅 프로그램을 계속 진행합니다. 4개의 사분면 모두에 스포팅이 완료되고 스팟이 마르면 슬라이드 챔버 커버를 다시 덮고 장치를 뒤집습니다. 슬라이드 챔버의 상단에 유리 슬라이드를 배치합니다.먼저 슬라이드 챔버를 현미경에 장착합니다. 타임랩스 현미경 관찰은 맞춤 설계된 스크립트를 실행하여 수행합니다. 셔터를 클릭하여 투과광 셔터를 열고, 포커스 버튼을 클릭하여 고속 카메라 촬영을 시작합니다."Go Origin"을 클릭하고 스테이지를 이동하여 아가(agar)에 펀칭된 원점 표시를 찾은 다음, 오른쪽으로 약간 이동하여 E7 영역에 점적된 세포에 초점을 맞춥니다. 다시 원점 펀칭 위치로 돌아가 시야 중앙에 맞춥니다. "Set" 버튼을 눌러 이 값을 원점으로 설정합니다. H18 위치로 이동하고 해당 위치에서 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다.그런 다음 L7 위치로 이동하여 해당 위치와 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. 마지막으로 E7 위치로 이동하여 해당 위치와 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. 중앙과 가장자리인 E12, H12, L12 지점에서 초점을 확인하고, z 값으로 표시된 초점 z 값이 자동 초점 범위의 플러스 또는 마이너스보다 크면 자동 초점 범위를 조정하십시오.Reset" 버튼을 누른 후 ODELAY를 누릅니다. 데이터를 저장할 디렉터리를 선택하십시오. 현미경은 48시간 동안 또는 프로그램이 종료될 때까지 데이터를 수집합니다.이 대표적인 타임랩스 이미지는 스포팅 후 0시간, 3시간, 6시간, 9시간 동안 고체 배지에서 성장하는 효모 세포를 보여줍니다. 여기에는 타임랩스 이미지 처리 후 두 가지 효모 균주를 비교한 대표 데이터 세트가 제시되어 있습니다. 비교적 균일한 배가 시간(doubling times)은 적절하게 준비된 아가로스 슬라이드를 반영하지만, 지체기(lag times)는 최적화되지 않은 자동 초점 설정으로 인해 상당히 다르게 나타납니다.모든 배가 시간이 잘 겹치고 지체 시간이 일정하게 나타나는 더 일관된 데이터 세트가 여기 제시되어 있습니다. 숙달되면 ODELAY 설정은 적절하게 수행될 경우 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 재현 가능한 ODELAY 측정을 위해 가장 중요한 단계는 배지를 일관되게 준비하고, 슬라이드를 분리하는 동안 배지가 기계적으로 변형되는 것을 방지하는 것입니다.ODELAY는 매우 민감한 분석법입니다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 스팟 기반 분석법에서는 성장 결함을 확인하기 위해 효모를 37 °C에서 배양해야 하지만, ODELAY는 상온에서도 온도 민감성 효모 균주의 성장 결함을 관찰할 수 있습니다. ODELAY는 효모를 대상으로 개발되었으나, 이 방법은 병원균을 포함하여 콜로니를 형성하는 모든 유기체에 적용 가능하며, 광범위한 환경적 및 유전적 조건을 탐색하여 미생물의 거동을 이해하는 데 활용될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 고체 배지에서 콜로니를 형성하는 단세포 미생물의 성장 표현형을 측정하기 위해 ODELAY를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 연구 대상 생물체에 적합한 개인 보호 장비를 착용하는 등 항상 주의 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

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