ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

ODELAY의 전반적인 목표는 군집으로 성장하는 개별 세포의 성장 표현형을 고처리량 방식으로 측정하는 것입니다. 이 방법은 유전적 섭동 및 약물 상호작용이 군집 형성 미생물의 성장 표현형에 미치는 영향과 같이 미생물학, 유전학 및 시스템 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. ODELAY의 주요 장점은 연구자가 수많은 개체 사이의 집단 이질성을 직접 관찰하고 정량화할 수 있다는 점입니다.

한천 몰드를 조립하기 전, 아크릴 몰드를 70% ethanol로 세척하고 강제 공기로 건조합니다. 바닥 조각 세 개와 수직 조각 두 개가 있습니다. 한천 몰드 조립을 시작하려면 바닥 조각 세 개를 가져와 두 개의 동일한 조각이 세 번째 조각을 양옆에서 감싸도록 조립합니다.

두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 양쪽의 베이스 조각을 고정하십시오. 레이저 곡선이 올바른 위치에 오도록 확인하며 지지대를 몰드에 배치하십시오. 깨끗하게 세척하고 건조시킨 유리 슬라이드를 몰드 위에 놓고, 반대편에 두 번째 유리 슬라이드를 배치하는 동안 이를 고정하십시오.

어셈블리를 더 큰 바인더 클립으로 고정합니다. 상단 바인더 클립이 아크릴과 겹치는 유리 슬라이드에 닿도록 하여 두 슬라이드 모두를 더 큰 바인더 클립으로 고정합니다. 조립된 몰드에 용융 아가(molten agar)를 채우기 전, 몰드 내측을 따라 약 70 µL의 용융 아가 배지를 피펫팅하여 가장자리가 밀봉되었는지 확인합니다.

녹은 agar를 몰드의 가장자리를 따라 천천히 피펫팅하여 내부로 공기 방울이 들어가지 않도록 몰드를 채웁니다. 몰드가 채워지면 약 23°C의 상온에서 40-60분 동안 식힙니다. 다음 단계는 몰드 분리입니다.

먼저 하단 바인더 클립을 제거합니다. 그런 다음 세 개의 조각이 겹쳐져 있는 몰드의 하단부를 제거합니다. 슬라이드를 눌러 고정한 상태에서 바인더 클립을 조심스럽게 제거하십시오.

몰드의 파란색 점이 있는 면이 위를 향하도록 실험대 가장자리에 놓습니다. 양쪽 엄지손가락을 아크릴 아래에 두고, 검지손가락을 몰드의 안쪽 가장자리를 향해 상단에 배치한 다음, 몰드 스페이서를 하단 가장지를 중심으로 회전시키듯이 엄지손가락으로 몰드를 천천히 조심스럽게 밀어 올립니다. 일정하면서도 천천히 증가하는 압력을 가합니다.

몰드 스페이서(mold spacer)를 덮고 있는 상단 유리의 경계선을 따라 균열과 기포가 나타나야 합니다. 초기 균열선이 보이면 양지엄손가락으로 계속 밀어 올리며 일정한 압력을 가하십시오. 그러면 한천(agar)이 유리에서 떨어지기 시작할 것입니다.

몰드를 계속해서 위쪽으로 회전시킵니다. 유리가 완전히 분리되면 이를 잡고 몰드에서 완전히 제거하십시오. 그런 다음, 아가(agar)를 움직이지 않도록 주의하며 비슷한 동작으로 다른 몰드 조각을 들어 올려 제거하십시오.

슬라이드를 바닥에 멸균 고순도 물이 약간 담긴 멸균 팁 박스에 넣습니다. 박스를 닫고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 다음 날 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트에 균주를 준비하여 이 절차를 시작하십시오.

플레이트 리더를 사용하여 각 배양액의 600nm에서의 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로 자동 희석 프로토콜을 사용하여 플레이트 내의 배양액을 600nm에서의 광학 밀도가 약 0.1이 되도록 희석합니다. 희석 프로그램 설정이 완료되면 덱 레이아웃에 명시된 대로 플레이트, 튜브 및 팁을 액체 핸들링 로봇의 덱에 배치합니다.

재생 버튼을 클릭하여 희석 프로그램을 실행하십시오. 50 µL 팁과 300 µL 팁을 각각 필요한 개수만큼 선택하십시오. 희석이 완료되면 로봇에서 희석 플레이트를 꺼내고, 플레이트가 마르는 것을 방지하기 위해 습도를 유지하면서 30 °C에서 5~6시간 동안 배양하십시오.

배양 플레이트의 배양이 완료되기 약 1~2시간 전에 현미경용 배양 챔버의 전원을 켜고 30°C에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 동일한 자동 희석 프로토콜을 사용하여 배양액을 600nm에서의 광학 밀도가 0.01에서 0.02가 되도록 다시 한번 희석합니다. 희석 플레이트를 금속 냉동 밀봉재로 덮고, 플레이트를 얼음물에 띄운 상태에서 얼음욕(ice bath) 내에서 30초 동안 초음파 처리합니다.

4개의 96웰 평저 플레이트에 각각 1, 2, 3, 4라고 표시합니다. 희석 플레이트에서 초음파 처리된 각 배양액 150 µL를 다음 패턴에 따라 평저 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 1의 C4에서 F9 웰로 A1에서 D6 웰의 내용물을 옮깁니다.

A7에서 D12까지의 웰을 Plate Two의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다. E1에서 H6까지의 웰을 Plate Three의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다. 그리고 E7에서 H12까지의 웰을 Plate Four의 C4에서 F9까지의 웰로 옮깁니다.

이 절차를 시작하려면 아가로스 슬라이드를 슬라이드 챔버에 올바르게 배치하십시오. 다음으로 96-well 평底 플레이트를 사분면 순서대로 테이블 위에 배치합니다. 왼쪽부터 오른쪽으로 플레이트 1, 2, 3, 4 순으로 배치하십시오.

4개의 빈 팁 박스에 팁을 배치하여 각 팁 박스의 내부 24개 웰이 팁으로 채워지도록 합니다. 다섯 번째 박스에는 C10 위치에 팁을 배치하고, A1, A12, H1, H12 위치에는 끝부분이 잘린 팁을 배치합니다. 이렇게 잘린 4개의 팁은 팁 플레이트 클램프의 안정성을 제공합니다.

로봇 제어 스포팅 프로그램의 시작 위치에 첫 번째 팁 펀치를 배치하여, 이후 원점 좌표를 맞추는 데 사용할 아가로스에 구멍을 뚫습니다. 액체 핸들링 로봇에 플레이트 1을 배치하여 첫 번째 사분면을 스포팅합니다. 뚜껑을 제거하고 스포팅 프로그램을 계속 진행합니다.

모든 스폿이 생성되었는지 확인하십시오. 사용한 팁은 바이오하저드 폐기함에 버리고 로봇에 새 팁을 장착하십시오. 스폿의 직경이 약 1mm가 될 때까지 약 30초 동안 건조시킨 후 프로그램을 계속 진행하십시오.

플레이트 1을 플레이트 2로 교체하고 스포팅 프로그램을 계속 진행합니다. 4개의 사분면 모두에 스포팅이 완료되고 스팟이 마르면 슬라이드 챔버 커버를 다시 덮고 장치를 뒤집습니다. 슬라이드 챔버의 상단에 유리 슬라이드를 배치합니다.

먼저 슬라이드 챔버를 현미경에 장착합니다. 타임랩스 현미경 관찰은 맞춤 설계된 스크립트를 실행하여 수행합니다. 셔터를 클릭하여 투과광 셔터를 열고, 포커스 버튼을 클릭하여 고속 카메라 촬영을 시작합니다.

"Go Origin"을 클릭하고 스테이지를 이동하여 아가(agar)에 펀칭된 원점 표시를 찾은 다음, 오른쪽으로 약간 이동하여 E7 영역에 점적된 세포에 초점을 맞춥니다. 다시 원점 펀칭 위치로 돌아가 시야 중앙에 맞춥니다. "Set" 버튼을 눌러 이 값을 원점으로 설정합니다. H18 위치로 이동하고 해당 위치에서 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다.

그런 다음 L7 위치로 이동하여 해당 위치와 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. 마지막으로 E7 위치로 이동하여 해당 위치와 가장 가까운 육각 나사를 사용하여 초점을 맞춥니다. 중앙과 가장자리인 E12, H12, L12 지점에서 초점을 확인하고, z 값으로 표시된 초점 z 값이 자동 초점 범위의 플러스 또는 마이너스보다 크면 자동 초점 범위를 조정하십시오.

Reset" 버튼을 누른 후 ODELAY를 누릅니다. 데이터를 저장할 디렉터리를 선택하십시오. 현미경은 48시간 동안 또는 프로그램이 종료될 때까지 데이터를 수집합니다.

이 대표적인 타임랩스 이미지는 스포팅 후 0시간, 3시간, 6시간, 9시간 동안 고체 배지에서 성장하는 효모 세포를 보여줍니다. 여기에는 타임랩스 이미지 처리 후 두 가지 효모 균주를 비교한 대표 데이터 세트가 제시되어 있습니다. 비교적 균일한 배가 시간(doubling times)은 적절하게 준비된 아가로스 슬라이드를 반영하지만, 지체기(lag times)는 최적화되지 않은 자동 초점 설정으로 인해 상당히 다르게 나타납니다.

모든 배가 시간이 잘 겹치고 지체 시간이 일정하게 나타나는 더 일관된 데이터 세트가 여기 제시되어 있습니다. 숙달되면 ODELAY 설정은 적절하게 수행될 경우 3~4시간 만에 완료할 수 있습니다. 재현 가능한 ODELAY 측정을 위해 가장 중요한 단계는 배지를 일관되게 준비하고, 슬라이드를 분리하는 동안 배지가 기계적으로 변형되는 것을 방지하는 것입니다.

ODELAY는 매우 민감한 분석법입니다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 스팟 기반 분석법에서는 성장 결함을 확인하기 위해 효모를 37 °C에서 배양해야 하지만, ODELAY는 상온에서도 온도 민감성 효모 균주의 성장 결함을 관찰할 수 있습니다. ODELAY는 효모를 대상으로 개발되었으나, 이 방법은 병원균을 포함하여 콜로니를 형성하는 모든 유기체에 적용 가능하며, 광범위한 환경적 및 유전적 조건을 탐색하여 미생물의 거동을 이해하는 데 활용될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 고체 배지에서 콜로니를 형성하는 단세포 미생물의 성장 표현형을 측정하기 위해 ODELAY를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미생물을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 연구 대상 생물체에 적합한 개인 보호 장비를 착용하는 등 항상 주의 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.