높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 단일 조합 실시간 분석을 사용하여 숙주 세포에 독성이 없는 세포 내 박테리아 성장의 특정 소분자 억제제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 항생제 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로 어떤 유형의 화합물이 세포 내 구획에 침투하여 숙주 세포에 해를 끼치지 않고 병원체를 죽일 수 있습니까?

이 기술의 주요 장점은 박테리아 성장 포유류 세포 독성이 비파괴 실시간 분석을 사용하여 동시에 검출된다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이 방법이 제공하는 확장성에 어려움을 겪을 것입니다. 한 세션에서 10,000개 이상의 화합물을 분석하려면 완전히 새로운 기술과 장비가 필요합니다.

Lucius 외에도 박사 후 연구원인 KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn 및 학부생 Kat Truelson이 학술적 항생제 발견 및 중개 진단 미생물학에 대한 공동의 헌신을 보여주고 있습니다. 숙주 세포를 준비하기 위해 J774A를 배양합니다. 1 대식세포는 RPMI 1640에 현탁 상태이며, 9%의 철분이 보충된 송아지 혈청이 함유되어 있습니다.

초기에는 조직 배양 플라스크에서 세포를 계대합니다. 15ml의 배지에 담긴 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 세포가 융합된 후 동일한 유형의 배지로 65ml로 긁어내고 희석하여 세포를 분할합니다. 조직 배양 플라스크에 15ml를 다시 넣고 50ml를 250ml 박테리아 셰이커 플라스크에 넣습니다.

회전 속도를 분당 약 120회전으로 설정하여 폭기합니다. 지속적인 성장을 위해 정확히 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양하십시오. 2포인트 밀리리터당 500만 세포에서 밀리리터당 500만 세포의 밀도에 도달하면 세포를 수확합니다.

죽은 세포는 세포 독성 분석에서 배경 소음을 증가시키므로 죽은 세포 비율이 25%를 초과하지 않도록 하십시오. 액체 처리기를 통해 대량의 대식세포와 박테리아를 분주할 때 저장소에서 세포가 침전되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 불균일성을 방지하고 플레이트 웰을 분석하기 위해 분배하는 동안 몇 분마다 저장소를 소용돌

대우된 백색 조직 배양물, 50에 384의 잘 microplates, 우물 당 조직 배양 매체의 30 microliters에 있는 000의 세포에 있는 세포를 도금하십시오. 실험 당일에 90%의 합류점을 달성하기 위해 밤새 마이크로플레이트를 배양합니다. 새로운 BCYE 플레이트에 유기체를 두껍게 펴고 하루 동안 배양하여 융합 성장을 얻어 실험을 위한 박테리아 패치를 준비합니다.

J774A. 1 세포에 사용된 것과 동일한 조직 배양 배지에 유기체를 다시 현탁시킵니다. 대식세포 감염을 수행하려면 진핵 세포 용해에서 박테리아 성장 억제에 대한 스크리닝 화합물 및 양성 및 음성 대조군을 포함한 관심 테스트 화합물을 추가합니다.

원액은 차량을 충분히 희석할 수 있도록 DMSO 또는 수용액에서 500배 이상으로 용해되어야 합니다. 조직 배양 배지에서 발광 박테리아를 밀리리터당 2점 500만 CFU의 목표로 희석합니다. 그런 다음 2점 5배 최종 분석 농도에서 적절한 무독성 멤브레인 비침투성 핵산 발견 염료를 추가합니다.

이 혼합물 20마이크로리터를 각 배양물 웰에 첨가합니다. 최종 분석 부피는 50마이크로리터이며 최종 박테리아 농도는 럭스 에프론 리포터의 경우 밀리리터당 100만 CFU, 형광 단백질 리포터의 경우 밀리리터당 400만 CFU여야 합니다. 섭씨 37도에서 1-3일 동안 100% 상대 습도에서 5% 이산화탄소에서 배양하여 증발 가장자리 효과를 방지합니다.

분석 결과를 판독할 때 온도와 관련된 가장자리 효과를 방지하려면 발광 판독 전에 약 20분 동안 뚜껑을 열어 둔 실험실 벤치의 단일 층에 배치하여 마이크로플레이트를 열 평형을 이룹니다. microplate luminometer 및 fluometer에서 박테리아 성장 및 진핵 세포 독성을 사용하는 reporter에 맞게 읽습니다. 나중에 시점에서 실시간 판독이 필요한 경우 마이크로플레이트를 인큐베이터로 반환합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 용량 반응 및 시너지 테스트 실험을 위해 이전과 같이 박테리아에서 대식세포를 준비합니다. 대식세포 감염 또는 축삭 배양 직전에 자동화된 액체 취급 시스템을 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 항균 희석액의 직접 자동 첨가를 통해 설정된 조합 시너지 테스트에서 단일 용량 반응을 촉진합니다.

연속 배가 희석 시리즈에 실험적으로 관심 있는 항균제를 추가합니다. 목표는 높은 쪽에서는 성장을 완전히 제거하는 농도를, 낮은 쪽에서는 뚜렷한 활동을 보이지 않는 농도를 확장하는 것입니다. 여기에 표시된 것은 박테리아 발광 및 세포 독성 관련 형광에 대한 시간 경과에 따른 대표적인 결과입니다.

항균 처리와 진핵 세포 독성 세제의 대조적인 효과에 주목하십시오. 항생제 독시사이클린(Doxycycline)에 대한 선택성을 결정하기 위해 동일한 스크리닝 웰에서 이중 IC50 및 CC50 용량 반응 측정을 사용했습니다. 박테리아 복제는 중간 농도의 항생제에 의해 억제되었습니다.

그러나, 세포독성은 약 100의 선택성과 일치하는 고농도에서 관찰되었다. Minocycline과 Azithromycin의 조합에 대한 2차원 용량 반응을 테스트하기 위해 동일한 분석 형식을 사용했습니다. 등윤곽선(Isocontours)은 동일한 세포 내 성장 억제 지점을 연결합니다.

여기서, 오목한 등등고선은 두 약물에 대한 강력한 시너지 효과를 시사했습니다. 분석 설정을 위한 디지털 디스펜싱 로봇, 실시간 판독 및 고처리량 형식을 통해 조합 삼중 시너지 테스트를 수행할 수 있었습니다. 여기서, 뚜렷하게 오목한 표면을 관찰하면 레지오넬라 페우모필라의 세포 내 성장에 대한 Minocycline, Azithromycin 및 Rifampin의 조합에 대한 높은 수준의 시너지 효과를 시사합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 형광 또는 발광 분석 판독을 고처리량 분석 형식의 실시간 세포독성 검사와 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 컨포칼 현미경과 같은 다른 방법을 적용하여 항균 활성 또는 전체 세포 독성이 있는 전체 세포의 생물학적 사건에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 레지오넬라균 복제에 미치는 영향을 연구했지만, 브루셀라균과 같은 다른 세포 내 병원체와 미생물에도 동일한 기술을 적용할 수 있습니다.

우리는 매우 높은 처리량의 스크리닝 형식으로 사용할 수 있을 만큼 간단하고 신뢰할 수 있는 분석을 파악하려고 할 때 이 프로토콜을 처음 고안했습니다. 박테리아 병원체, 세포주 및 로봇 장비로 작업하는 데는 몇 가지 고유한 위험이 있으며 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 사용하는 것과 같은 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.