Name: 높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 실시간 이중 판독 분석법을 통해 진핵 세포 침투성 항균제를 식별하고 세포 독성을 동시에 평가하는 방법. 이 고처리량 기술은 세포 내 세균 감염 치료제 발굴에 활용됩니다.

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이 논문에보고 된 연구 내용은 전적으로 저자의 책임이며 JEK하는 보너스 번호 R01AI099122에서 알레르기 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 감염증의 국립 연구소에 의해 지원되었다 반드시 국립 연구소의의 공식 견해를 대변하지 않습니다 건강. 우리는 ICCB - 롱 우드의 검사 시설 및 / 또는 국가 검사 실험실을위한에서 제니퍼 스미스, 데이비드 Wrobel, 스와 치앙마이, 더그 홍수, 숀 존스턴, 제니퍼 Nale, 스튜어트 Rudnicki, 폴 연의, 리처드 시우, 레이첼 소장에게 감사의 말씀을 우수의 뉴 잉글랜드 지역 센터 디펜스의 개발과 높은 처리량 심사 분석의 성능을 자신의 도움 (U54AI057159에서 지원) 감염증을 신흥. 우리는 또한 원고에 도움이 의견 케네스 P. 스미스에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 실시간 세포 내 성장과 진핵 세포 세포 독성 분석 <ol><li> 제조 된 숙주 세포 (J774A.1 세포) <ol><li> 9 %의 철 보충 혈청과 RPMI 1640에서 서스펜션 문화 J774A.1 뮤스의 musculus 대 식세포 유사 세포. 조직 배양 플라스크에 처음 통로. 세포 배지 15 ㎖에 75 ㎠로 조직 배양 플라스크에서 컨 플루 언트하게 한 후 15 ㎖의 조직 배양 플라스크로 복귀 50 ml를 전달하는 매체의 동일한 유형, 65 ml의 긁어 희석하여 분할 250 ml의 세균 진탕 플라스크에. </li><li> 250 mL 및 / 또는 조직 배양 배지와 오분의 볼륨에 가득 1,000 ml의 세균 플라스크에 현탁액 스케일 업, 문화. 분당 약 120 회전 수로 회전 수를 설정하여 통기. 일관성있는 성장을 위해, 정확히 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 그들은 범위 농도 도달 수확 세포 2.5 × 106 세포/ 5 × 106 세포 / ml의. 죽은 세포 독성 분석에서 배경 노이즈가 증가하는 바와 같이, 25 %를 초과하지 않는 (쉽게 트리 판 블루 염색에 의해 분석) 죽은 세포의 비율을 확인. </li><li> 흰색 접시, 조직 384 웰 마이크로 플레이트 30 μl를 조직 배양 배지에서 5 × 10 4 J774A.1 세포에서 당은 물론, 문화 처리. 실험의 날에 90 %의 합류를 달성하기 위해 마이크로 밤새 품어. </li></ol></li><li> 준비 발광 또는 형광 레지오넬라 뉴모 필라 <ol><li> 통로 L.의 뉴모 필라 (Lp02 :: flaA :: 럭스 8) 해당 매체에 박테리아, 즉, 버퍼 숯불 효모 추출물 (BCYE) 매체. 티미 딘 영양 요 구성 균주를 사용하는 경우, 100 μg의 / ㎖ 티미 딘와 매체를 보완. 합류를 얻기 위해 새로운 BCYE 판에 두껍게 생물을 확산하고 (냉동 재고에서 경우) (이전 판 통로에서 경우) 하루 배양 또는 2 ~ 3 일에 의해 실험 세균의 패치를 준비성장. <ol><li> 10g 효모 추출물 10 g의 N 용해 BCYE 플레이트를 준비 - HPO 4 (2- 아세트 아미도) -2- 아미노 에탄 술폰산 0.35 g의 K (2) 및 탈 이온수 950 ml를 1 g 일 염기성 칼륨 α - 케 토글 루타 레이트. 수산화 칼륨 (11.9 몰 용액 ≥2.5 ㎖)으로 pH 6.9로 조정한다. </li><li> 15g의 한천 2g 활성탄을 추가; 1 L 최종 부피에 가져다. 자기 교반 막대 및 오토 클레이브를 추가합니다. 55 ° C로 냉각 매체 및 탈 이온수에 용해 된 0.4 g의 L 시스테인 및 0.42 g의 암모늄 철 (III) 시트 레이트를 포함하는 추가 필터 살균 솔루션을 제공합니다. 페트리 접시를 주입하기 전에 혼합 자석 교반 판을 사용합니다. </li><li> 무균 성장 매체에 L.의 뉴모 필라 성장의 테스트를 위해 숯을 제외하고 BCYE에 사용되는 모든 화학 시약을 결합하여 ACES-효모 추출물 국물 (AYE)를 준비하고 한천. 필터 소독 즉시 사용하거나 나중에 실험 동결. </li></ol></li><li> 는 sa에 재현 탁 생물적절 100 μg의 / ㎖ 티미 딘 보충되어 J774A.1 세포에 사용 나 조직 배양 배지. </li></ol></li><li> 대 식세포 감염 <ol><li> (박테리아 성장 억제 및 진핵 세포 용해 스크리닝 화합물 및 양성 및 음성 대조군) 관심 시험 화합물을 추가한다. 바람직하게는, 차량의 충분한 희석 있도록 DMSO (디메틸 설폭 사이드) 또는 수용액 ≥500x에 원액을 녹인다. <ol><li> 스톡 용액은 냉동 저장 될 수 있지만, 불안정한 화합물 항균제 동결 - 해동 사이클을 피한다. </li></ol></li><li> 조직 배양 배지에서 2.5 × 106 CFU (집락 형성 단위) / m 및 형광 기자 표지 세균 1.0 × 10 7 CFU / ㎖의 대상으로 적절한 비 독성, 막 impermeant, 핵산 산성을 추가하는 발광 박테리아를 희석 2.5 최종 분석 농도에서 염료 바인딩. </li><li> 물론 각 J774A.1 문화에 혼합물의 20 μl를 추가, 최종 분석 볼륨50 μl의 최종 세균 농도 1 × 106 CFU / ㎖ (럭스 오페론 기자) 4 × 10 10 6 CFU / ㎖ (형광 단백질 기자). </li><li> 100 % CO 2, 5 %를 1-3 일 동안 37 ° C에서 증발 가장자리 효과를 방지하기 위해 상대 습도 부화. </li></ol></li><li> 분석 판독 <ol><li> 기자에 맞게 마이크로 플레이트 루미 및 형광 계에 세균의 성장 및 진핵 세포 독성을 읽어 것이 사용된다. <ol><li> 열 (약 10 분 또는 뚜껑 생물 안전 캐비닛 오프에서) 약 20 분 동안 열려 뚜껑 실험실 벤치에 단일 층에 배치하여 사전 발광 독서에 마이크로 평형, 온도 관련 가장자리 효과를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 나중 시점에서 실시간 판독이 필요한 경우 인큐베이터 마이크로 플레이트 반환한다. </li></ol></li></ol> 2. 데이터 분석 <ol><li> 긍정과 부정 사기꾼에 데이터를 정규화trols는 진핵 세포에 대한 세포 내 세균의 성장과 %의 세포 독성에 대한 퍼센트 접이식 억제를 계산합니다. </li><li> P는 +를 n을 μ μ | 3 (σ p를 + σ n)이 / - 분석 견고성을 평가하기 = 1 &#39;Z 분석 Z-계수 (Z)를&#39;사용하여 박테리아 성장 억제 및 세포 독성 모두 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이의 통계적 거리를 계산 |. 이 식에서, P는 σ 및 σ n은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 표준 편차이다; μ p와 μ N은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 평균 값이다. <ol><li> 높은 처리량 스크리닝 분석법을 위해, 관심있는 시험 화합물의 효과를 평가하기 위해, Z 표준 점수 (또는 다른 대안으로서, 정량적 통계 방법)을 계산한다. 또한, 간단한 배 감소를 계산하거나 관련성이 잠재적으로 생리 학적으로 감소 배를 기록<html> 기하학적으로 복제 세균에 대한 효과 크기의 측정. </li></ol></li></ol> 3. 단일 및 다중 차원 (즉, 시너지) 용량 - 반응 시험 및 자료 해석 <ol><li> 프로토콜 섹션 1에 설명 된 대 식세포와 박테리아를 준비합니다. </li><li> 직전 감염이나 무균 배양에 (즉, 최소 억제 농도 또는 MIC) 및 낮은에 하이 엔드에 스패닝의 목표로 희석 시리즈를 두 배로, 직렬 완전히 성장을 제거하는 농도를 실험적인 관심의 항균제를 추가 명백한 활동을 보여줍니다 농도를 종료합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 항균 희석 직접 자동 추가를 통해 단일 용량 - 반응 및 조합 시너지 테스트 셋업을 용이하게하기 위해 자동화 된 액체 핸들링 시스템을 사용한다. </li><li> 예를 들어, 서브 배로 희석하여 사용을 고려841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - 희석 시리즈를 접은 분석은 데이터의 정확성과 재현성을 높이기 위해 복제합니다. </li><li> 대식 세포를 감염, 발광 박테리아를 조직 배양 배지에서 2.5 × 106 CFU (콜로니 형성 단위) / ml로 희석 타겟팅. 물론 각 J774A.1 문화, 최종 분석 볼륨 50 μL, 최종 세균 농도 1 × 106 CFU / ㎖로 혼합물의 20 μl를 추가; 100 % 상대 습도 5 %에서 37 ° C에서 CO 2를 배양한다. <ol><li> 무균 성장 시험을 위해, AYE 배지에서 1 × 106 CFU / ㎖의 최종 농도 발광 박테리아 희석 384- 웰 플레이트의 각 웰에 50 μl를 추가 5 % CO 2에서 37 ° C에서 부화 100 % 상대 습도. </li></ol></li><li> 박테리아의 성장을 억제하는 항균 조합 분수 억제제 농도를 지수를 계산한다. 세균 g을 완전히 또는&gt; 99 % 억제를 초래 조합의 각 약물 (A, B,.. N) 미국rowth (FIC A, B를, N...) 각 부분 억제 농도 계산을 다음과 같이 FIC A = 화합물의 농도는 &quot;A&quot;의 최소 억제 농도로 나눈 값을 &quot;A&quot;자체. . 그러면 FIC 조합 인덱스를 계산하거나 등 FIC B를 계산 같은 수식을 사용하여 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC는 FIC의 A + FIC B 형 +를 =. . 각 저해 조합에 대한 .FIC 없음. <ol><li> 시너지 효과를 평가하기 위해 1.0에서 가장 멀리 벗어난 조합 인덱스를 사용합니다. 보수적 인 상승 효과의 표시 및 ≥4, 길항제의 효과로 ≤0.5의 차단을 고려하십시오. (12) </li><li> 플롯은 isobolograms isocontour isobolograms 및 / 또는있는 isosurface는 조합의 효과 (6) 같은 대체 그래픽 표현을 isobolograms. </li></ol></li></ol>

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우리는 세포 내 박테리아의 성장 및 숙주 세포 독성의 동시 검출을위한 실시간 분석을 설명한다. 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 강력한 분석 성능, 세균 및 세포 독성 판독 사이에 충분한 스펙트럼 분리가 있어야합니다. 이러한 분리는 루시 페라 제 오페론 기자와 형광 DNA 결합 염료의 조합에 대한 고유이다. 그러나, 우리의 경험 (표 1-3,도 2), 이중 사용을 기반으로 형광 판독이 겹치지 않는 형광 신호 (예를 들어, 원적외선 형광성 단백질 리포터 녹색 핵산 염색 사용) 강력한 얻기 필요 용액 기반 데이터. 또한, 이전의 경험에서, 잠재적으로 가능한 판독기 광학 또는 솔루션의 형광 특성과 관련, 녹색 또는 주황색 발광 만 DNA의 얼룩&gt; 0.5, stron을 나타내는 척도보다 더 큰 즉, 사용할 수있는 세포 독성 데이터, Z &#39;를 준g 분석 성능을 제공합니다. ...

세포 내 구획에 일시적으로 증가 또는 상주 병원균은 치료 근절하기 어렵다. 의무 또는 상대적으로 이러한 레지오넬라 뉴모 필라, Coxiella burnetii의, 브루셀라 종으로 세포 내 병원균을 의무. , Francisella의 야토 및 진균 종. 종종 달에 몇 년의 범위 일 수있다 치료를위한 항생제 치료의 과정을 연장 필요합니다. 또한, 세포 외 병원균은 일시적으로 세포 내 틈새 시장을 점유하고이 방법으로 항생제 치료의 일반적인 과정에 의해 허가를 탈출하고 나중에 악성 감염의 새로운 라운드를 시작합니다 나타날 수 있습니다. 황색 포도상 구균 (1) 및 uropathogenic 장내 세균 2,3 감염이 점점 인식 예입니다. 따라서, 근본적으로 신약 개발 목표는 세포 내 구획 침투 신규 항생제를 확인하는 것이다. 최적의 치료는 빨리 근절하기세포 생물 및 하위 억제 항균 노출을 통해 저항의 개발을 방지 특히 바람직하다. 이를 위해 모델 병원체, 레지오넬라 뉴모의 세포 성장을 표적 세포 - 침투제 항균제를 식별하기 위해 고 처리량 스크리닝 기술을 개발했다. 4 이전 임상 관찰은 표준 항생제 감수성 검사가 정확하게이 생물에 대한 생체 내 치료 효과에 예측하지 않았 음을 나타냅니다. 이러한 β - 락탐 및 아미노 글리코 사이드와 같은 항균제의 주요 클래스, axenically 성장 레지오넬라 균에 대해 매우 효과적이지만, 충분히 레지오넬라 균이있는 세포 내 구획에 침투하지 않기 때문에 5는 특히이이었다. 5,6 나중에 증거가 기술적으로 더 복잡한 세포 성장 분석을 효과적으로 임상 적 효능을 예측하는 것이 좋습니다. (7) </sup&gt; 불행하게도, 이러한 분석은 집락 형성 단위 열거 위해 상이한 시간 점에서 용해 될 항균제로 처리 감염된 대 식세포를 요하는 매우 힘든 종점 분석법이었다. 이러한 분석은 대규모로 수행하는 것은 비실용적이고 높은 처리량 약물 발견에 부적합하다. 따라서, 우리는 세포 내 세균 성장의 실시간 측정을위한 기술을 개발했다. 6이 박테리아 염색체에 4 형광 단백질을 (이전에 기술, 1 세대 분석) 중 세균 루시퍼 라제 오페론 (8)의 통합을 통해 변형 된 박테리아 균주의 사용을 통해 구 기자 (여기 한 제 2 세대, 직교 분석 등)를 달성했다. 이러한 방식으로, 발광 또는 형광 신호 세균 수의 대용 실시간 판독을 제공한다. 그러나, 이러한 특성은 세포 내 infectio의 주요 교란 요인을 해결하지n 개의 분석, 숙주 세포에 오프 대상 효과. 구체적으로, 숙주 세포의 죽음은 본질적으로 세포의 성장을 제한하고, 항균 효과의 위양성 식별 리드. 심사 라이브러리의 많은 화합물은 진핵 세포 독성, 이러한 오탐 (false positive)이 후속, 해결을위한 엔드 포인트 세포 독성 분석의 큰 숫자를 필요로 사실 항균제를 압도 할 것입니다. 따라서, 동시에 진핵 세포 생존율 및 세포 성장을 평가 할 수 있도록 큰 관심이었다. 특히, 비 생존 진핵 세포의 특성은 세포막 무결성의 손실이다. 세포막의 투과성을 테스트 프로브 따라서 세포 생존 능력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 우리는 이전에 액세스 사균의 핵 DNA를 염색하기 위해 추정되는 세포막 - impermeant, 형광 DNA 결합 염료의 일련의 기능을 특징으로한다. 4 핵 DNA 결합에,이 염료는 quantu에서 큰 증가를 표시배경 솔루션 형광 이상 증가 신호의 결과로 m 형광 수율. 따라서, 이러한 염료는 진핵 세포 사멸의 정량적 판독을 제공 하였다. (4) 특히, 우리는 여러 가지가 J774의 대 식세포와 연장 공동 배양하는 동안 자신 무독성 것으로 나타났다. 초기 감염 기간 동안 첨가하면, 그것들은 실시간 현미경 마이크로 플레이트 형광 계에 의해 측정 또는 관찰 할 수있는 진핵 세포 사멸의 형광 판독 값을 제공 하였다. 따라서, 세균 리포터 무독성, 막 impermeant 사용을 결합하여, DNA 결합 염료, 우리는 세균 부하 동시에 진핵 세포의 세포 독성을 동시에 측정 할 수있는 단순하고 비파괴 실시간 분석을 개발할 수 있었다. 이 분석은 우리의 세포 성장을 억제 할 수있는 능력을 위해 ~을 포함하여 기능적지지 않은 활동 (250) 항균제 및&gt; 240,000 작은 분자를 384 웰 플레이트 형식으로 화면 ~ 10,000 알려진 생체 활성제 할 수있다레지오넬라 뉴모 동시에 각 화합물 진핵 세포 독성 데이터를 생성하는 동안. 레지오넬라 균의 세포 성장에 대한 알려진 항생제 (6) 우리의 분석은 지금까지이 유형의 가장 포괄적 인 탐사했다. 6 병용 할 때 우리의 분석 포맷의 효율에 기초하여, 우리는 다음에 공지 된 항균제의 잠재적 상승 효과를 탐구. 가장 일반적인 시너지 테스트 중 하나, 소위 바둑판 분석은 표준 적 둘 이상의 항균제의 2 배 희석액의 조합 효과를 평가함으로써 수행된다. 두개 이상의 항 미생물제를 별도로 적용 각각의 효과의 합보다 함께 적용될 때 이러한 분석에서 10 시너지는 큰 효과의 관찰에 의해 정의된다. 참고로, 지금까지 만 집중과 선택적 시너지 시험은 세포 내 레지오넬라 뉴모 필라에 대해 수행되었다 </em&gt; 필요한 조합 순열을 곱한 기존의 엔드 포인트 분석에 포함 된 큰 노력 때문이다. 시너지 테스트를 용이하게하기 위해 디지털 자동 분배 기술 (6)과 조합하여 실시간 세포 성장 / 진핵 세포 독성 분석에 사용했다. 이 자동화는 DMSO 또는 수용액 단독 또는 384 웰 형식의 조합에 용해 화합물의 연속 희석을 분배하는 우리를 허용. (11) 또한, 이러한 강력한 액체 핸들링 기술은 용이하게 더 높은 해상도를 수행하라고 허가 제곱근 -의 두 (대신 표준보다 낮은 해상도, 두배) 우리 이차원 특이성 높은 수준을 달성하기 위해 희석 조합을 바둑판 시너지 분석. 이 배 희석 시리즈 12을 사용하는 경우이 해결 재현성에 대한 시너지 분야에서 문제를 해결에 특히 유용했다. 마지막으로, 우리의 분석은 정량적도 THER했다는 efore 억제의 그라데이션을 측정 하였다. 결과적으로, 분석은 성장 억제 비슷한 수준으로 조합 농도 isocontours 연결되는 isocontour isobolograms의 발현 억제 내용 전체를 캡처. 6이 묘화 전략은 조합 적 투여 량 - 반응 곡선을 가시화시켰다. 우리의 방법론을 설명하기 위해, 우리는 이러한 분석을 수행하기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 대표적인 결과를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 세포</td><td>미국식 배양 컬렉션</td><td>TIB-67</td><td>숙주 세포</td></tr><tr><td>ACES</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9758&nbsp;</td><td>완충 된 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체를 만들기 위해</td></tr><tr><td>효모 추출물, 한외 여과</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 배지를 만드는 데 사용됩니다. 낮은 등급은 성장 장애를 일으키거나 성장 억제제에 대한 레지오넬라균의 민감도를 변경할 수 있습니다</td></tr><tr><td>알파-케토글루타르산, 모노칼륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>K2000</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 배지 제작</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체 제조용</td></tr> 인<tr><td>산칼륨, 이염기</td>성 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체 L</td></tr><tr><td>-시스테인</td> 제작 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체 제작</td></tr><tr><td>암모늄 철 (III) 구연산</td><td>염 Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>완충 된 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체를 만드는 데 사용됩니다. 피로 인산 철을 대신 사용할 수 있지만 정확하게 무게를 측정하기가 더 어렵습니다</td></tr><tr><td>수산화 칼륨 용액, 농축</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>완충 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 배지를 만드는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Deonized water</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>완충 된 숯 효모 추출물 한천 및 완충 효모 추출물 매체를 만들기 위해</td></tr><tr><td>티미딘 (조직 배양 등급)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>RPMI 1640 및 완충 효모 추출물 한천/중간 &mdash를 모두 보충하기 위해; 후자에 대해 낮은 등급의 티미딘을 사용할 수 있지만, RPMI 1640 RPMI 1640에서 세포 성장 장애 및/또는 세포 사멸을 유발할 수 있음</td></tr><tr><td>, 표준 제형</td> Thermo Fisher Scientific <td>10-040-CV</td><td>를 통한 Corning</td><td>도금 전에 J774A.1 세포를 성장시키기 위해; 2 mM L-글루타민 포함</td></tr><tr><td>RPMI 1640 결핍 페놀 레드</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>384웰 디쉬에서 J774A.1 세포 도금용(도금 전 성장에 적합하지 않음); 또한 L-글루타민 &mdash 부족; 사용 전 2mM까지</td></tr><tr><td>보충 L-글루타민, 0.85% NaCl (조직 배양 등급)에 200mM</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td> 결<td>핍된 RPMI 1640 보충용, 2 mM 최종 농도</td></tr><tr><td>철분 보충 송아지 혈청</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>RPMI 1640 보충, 9.1% 최종 농도</td></tr><tr><td>Trypan Blue 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>세포 밀도 계수 중 J774A.1 세포 사멸 측정을 위한 염색</td></tr><tr><td>SYTOX Green, DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>의 5 mM 용액형광 판독 또는 상피 형광 현미경 검사에 의한 J774A.1 세포 사멸 측정을 위한 염색용(주황색-적색 또는 근적색 형광 박테리아와 함께). 125nM 최종 농도에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>J774A.1 세포 배양용(감염 전후 모두); 박테리아 배양에도 사용할 수 있으며, 표준 분위기 인큐베이터를 대신 사용할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 쉐이킹 인큐베이션용; 세포 배양 인큐베이터 내부에 맞습니다; 쉐이커 베이스 7744-01000 및 트레이 7740-01010 포함 (이것들은 별도로도 구매 가능)</td></tr><tr><td>쉐이커 플라스크 (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 쉐이킹 인큐베이</td></tr><tr><td>션용 플라스크용 쉐이커 클램프 (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 진탕 배양용</td></tr><tr><td>셰이커 플라스크 (1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 진탕 배양용</td></tr><tr><td>플라스크 (1,000 ml)용 셰이커 클램프</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 진탕 배양</td></tr><tr><td>플라스크 용 스폰지 폼 캡 (250 ml-1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>감염 전 J774A.1 세포의 진탕 배양용; 표준 금속 캡에 비해 오염 위험 감소</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi 프로그래밍 가능한 다채널 연동 펌프</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>형광단을 함유한 J774A.1 세포, 매체 및 박테리아 현탁액을 다수의 384웰 접시에 분배하기 위해</td></tr><tr><td>Combi standard bore manifold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>기본 프리디스펜스 부피 20 &#956; l은 침전 &mdash를 보상하기에 충분하지 않습니다. 80 &#956으로 증가; l</td></tr><tr><td>백색 384의 조직 문화를 위해 대우되는 좋은 접시</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>독서 발광과 형광을 위해; Greiner 카탈로그 # 781080도 성공적으로 테스트</td></tr>되었습니다 <tr><td>DMSO (조직 배양 등급, 밀봉 앰플)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>양성 대조군 및 테스트 화합물</td></tr><tr><td>Azithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>항생제 양성 대조군</td></tr><tr><td>사포닌 (Quillaja 나무 껍질에서)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Cytoxicity 양성 대조군</td></tr><tr><td>다중 채널 피펫터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>고정된 양의 양성 대조군 화합물 이송용; 피펫터는 반복적인 고정 부피 분주를 가능하게 하는 멈춤쇠가 있는 디지털 분주가 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>Epson 핀 이송 로봇</td><td>Epson/ICCB-L</td><td>(맞춤형 장비)</td>라이브러리 어레이 D300 디지털 분주 시스템 Hewlett-Packard via Tecan D300<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에서 고정된 양의 테스트 화합물 이송11 피코리터에서 10 &마이크로에 이르는 다양한 양의 테스트 화합물을 전송하기 위해; </td></tr><tr><td>l D300 디지털 디스펜싱 시스템</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8 +</td> <td>디스펜싱 테스트 화합물</td>용 T8 + 디스펜싱 테스트 컴</tr>파운드 <tr>컴퓨터 연결 디지털 카메라 <td>Nikon</td><td>Ti</td>가있는<td>에피 형광 현미경</td><td>라이브 셀 이미징; 모든 표준 형광 현미경은 위상차 또는 DIC 광학으로 녹색 (플루오레세인), 주황색-빨간색에서 빨간색 (텍사스 레드) 및 원적외선 (Cy5) 형광을 100X 오일로 이미징 할 수 있습니다. 최고 해상도를 위한 대물</td></tr><tr><td>렌즈 유리 바닥 조직 배양 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>라이브 셀 이미징용. MatTek과 같은 접시는 도립 에피 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 600X 또는 1,000X 배율로 현미경 시각화를 가능하게 합니다.&nbsp; 이 특정 접시는 공칭 직경 3.5cm, 내부 직경 3.3cm이며 바닥에 직경 20mm #1.5 두께의 커버 슬립이 삽입되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Photoshop, CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td>, <td>Adobe Photoshop 또는 이와 유사한 프로그램을 사용하여 빛, 현미경 및 형광 이미지를 의사 색칠하고 병합할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>2-dimensioonal isocontour isobolograms 및 3차원 surface isobolograms의 생성용.</td></tr></tbody></table>

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

세포 내 항균 활성 및 진핵 세포의 세포 독성의 전통적인 조치는 엔드 포인트 분석에 의존하고 있습니다. 이러한 엔드 포인트 분석은 세포 용해, 집락 형성 단위 결정, 또는 시약을 추가로 판독을하기 전에 몇 가지 추가 실험 단계를 필요로한다. 예를 들어, 높은 처리량 스크리닝 분석법 중에 수천을 수행 할 때, 이러한 유형의 분석법에 필요한 하류 노력은 상당하다. 따라서, 높은 처리량 항균 검색을 용이하게하기 위해, 우리는 동시에 세포 내 세균 증식의 억제제를 식별하고, 진핵 세포의 세포 독성을 평가하기위한 실시간 분석을 개발 하였다. 특히, 실시간으로 세포 내 세균의 성장 검출은 세균 룩스 오페론 (1 차 세대 분석) 또는 형광 단백질 기자 (2 차 생성, 직교 분석) 중 하나와 세균 검사 균주를 표시하여 사용 하였다. 비 독성, 세포 막 impermeant 핵산 결합 염료또한 대 식세포의 초기 감염시 추가되었습니다. 이 염료는 가능한 세포에서 제외됩니다. 그러나, 비 - 실행 가능한 숙주 세포 엔트리 핵 DNA의 형광 표식 (디옥시리보 핵산)를 허용 막 완전성을 잃는다. 특히, DNA는 숙주 세포 사멸의 용액 기반의 판독을 제공하고, 형광 양자 수율이 크게 증가와 관련된 바인딩. 우리는 마이크로 플레이트 포맷에서 높은 처리량 스크린을 수행하고, 현미경으로 세포의 성장과 세포 독성을 평가하기 위해 결합 분석을 사용 하였다. 특히 항균제 함께 적용 둘 이상의 항균제의 결합 된 효과는 개별적으로 적용될 때보다 큰 시너지 효과를 입증 할 수있다. 다른 농도에서 항생제의 조합 순열을 평가해야하기 때문에 세포 내 병원균에 대한 시험 관내 시너지 효과를 테스트하는 것은 일반적으로 엄청난 작업입니다. 그러나, 우리는 우리의 실시간 분석이 자동화, 디지털 분배 기술 쪽과 함께 발견손쉬운 시너지 테스트 ermitted. 이러한 접근 방식을 사용하여, 우리는 체계적으로 세포 내 병원균, 레지오넬라 뉴모 필라에 혼자 항생제의 많은 수의 행동과 조합을 조사 할 수 있었다.

마이크로 세포 성장 분석 도 1은 분석 단계도이다. 도시 자동화 단계가 수동으로 수행 될 수있다. 그러나, 처리량이 큰 액체 핸들링 시스템을 이용하여 용이하게된다. 도 2는 384- 웰 마이크로 플레이트, 듀얼 판독 실시간 세포 성장 및 (Lp02)은 중 어느 하나에 lux 오페론 (도 2A, 2B) 또는 mNeptune2 형광 단백질로 표시된 레지오넬라 균주 (하여 진핵 세포 독성 분석에서 대표적인 결과를 나타낸다 그림 2C, 2D) 기자. 양성 및 음성...

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 단일 조합 실시간 분석법을 사용하여 숙주 세포에는 독성이 없으면서 세포 내 박테리아 성장을 억제하는 특정 저분자 억제제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 항균제 발견 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로, 어떤 유형의 화합물이 숙주 세포를 손상시키지 않고 세포 내 구획으로 침투하여 병원균을 사멸시킬 수 있는가에 대한 것입니다.이 기술의 주요 장점은 비파괴적 실시간 분석법을 사용하여 박테리아 성장과 포유류 세포 독성을 동시에 검출할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 이 기술이 제공하는 확장성으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 한 세션에서 만 개 이상의 화합물을 분석하려면 완전히 새로운 기술과 장비 세트가 필요합니다.Lucius 외에도, 학술적 항균제 발견 및 중개 진단 미생물학에 대한 공동의 헌신을 보여주고 있는 연구원들로는 박사후 연구원인 KP Smith, 강윤석, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn, 그리고 학부생 Kat Truelson이 있습니다. 숙주 세포를 준비하려면, 9% 철 보충 송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640에서 J774A. 1 대식세포를 부유 배양하십시오.처음에는 조직 배양 플라스크에서 세포를 계대 배양합니다. 75 cm² 조직 배양 플라스크 내의 15 mL 배지에서 세포가 합류(confluent) 상태가 되면, 세포를 긁어내어 동일한 종류의 배지로 65 mL까지 희석하여 분할합니다. 이 중 15 mL는 조직 배양 플라스크로 되돌리고, 50 mL는 250 mL 박테리아 쉐이커 플라스크로 옮깁니다.회전 속도를 약 120 rpm으로 설정하여 통기합니다. 일관된 성장을 위해 정확히 5%의 이산화탄소 농도와 37 °C에서 배양합니다. 세포 밀도가 2.5 x 10⁶ cells/mL에서 5 x 10⁶ cells/mL 범위에 도달했을 때 세포를 수확합니다.사멸 세포는 세포독성 분석에서 배경 소음을 증가시키므로, 사멸 세포의 비율이 25%를 초과하지 않도록 하십시오. 액체 핸들러로 대량의 대식세포와 박테리아를 분주할 때 리저버 내에서 세포가 가라앉지 않도록 하는 것이 중요합니다. 불균일성을 방지하고 분석 플레이트 웰에 고르게 분주하기 위해 분주하는 동안 몇 분마다 리저버를 흔들어 섞어주십시오.세포를 백색 조직 배양 처리된 384-웰 마이크로플레이트에 웰당 30 µL의 조직 배양 배지 내에 50,000 cells의 밀도로 분주합니다. 실험 당일에 90%의 합류도(confluence)에 도달하도록 마이크로플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 새로운 BCYE 플레이트에 균을 두껍게 도말하고 하루 동안 배양하여 합류 성장을 유도함으로써 실험에 사용할 박테리아 패치를 준비합니다.J774A.1 세포에 사용한 것과 동일한 조직 배양 배지에 유기체를 재현탁합니다. 대식세포 감염을 수행하려면, 스크리닝 화합물을 포함하여 관심 있는 시험 화합물과 진핵 세포 용해 시 세균 성장 억제를 위한 양성 및 음성 대조군을 첨가하십시오.DMSO 또는 수성 용액에서 500배 이상의 농도로 스톡 용액을 용해하여 용매를 충분히 희석할 수 있도록 합니다. 발광 박테리아를 조직 배양 배지에서 mL당 2.5 x 10⁶ CFU 목표 농도로 희석합니다. 그다음, 비독성 막 불투과성 핵산 탐지 염료를 최종 분석 농도의 2.5배로 첨가합니다.이 혼합액 20 µL를 각 배양 웰에 추가합니다. 최종 분석 부피는 50 µL이며, 최종 박테리아 농도는 lux epron 리포터의 경우 mL당 1,000,000 CFU, 형광 단백질 리포터의 경우 mL당 4,000,000 CFU가 되어야 합니다. 증발로 인한 엣지 효과(edge effects)를 방지하기 위해 5% CO₂ 및 100% 상대 습도 조건의 37 °C에서 1~3일 동안 배양합니다.분석 결과 판독 시 온도와 관련된 가장자리 효과(edge effects)를 방지하기 위해, 발광 측정 전 마이크로플레이트의 뚜껑을 살짝 열어 실험대 위에 한 층으로 배치하여 약 20분 동안 열적 평형을 맞춥니다. 사용 중인 리포터에 따라 마이크로플레이트 루미노미터(luminometer) 및 형광 광도계(flourometer)를 사용하여 박테리아 성장 및 진핵세포 독성을 측정합니다. 이후 시점에서 실시간 판독이 필요한 경우 마이크로플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 데이터를 분석하십시오. 용량 반응 및 시너지 테스트 실험의 경우, 이전과 같이 박테리아 내 대식세포를 준비하십시오. 대식세포 감염 또는 무균 배양 직전에 자동 액체 핸들링 시스템을 사용하여, 제조사 프로토콜에 따른 항균제 희석액의 직접 자동 첨가를 통해 조합 시너지 테스트 설정 내 단일 용량 반응을 용이하게 수행하십시오.실험 대상 항균제를 연속 2배 희석 시리즈로 첨가합니다. 목표는 고농도에서는 성장을 완전히 억제하고, 저농도에서는 뚜렷한 활성이 나타나지 않는 농도 범위를 포함하는 것입니다. 여기에는 박테리아 발광 및 세포 독성과 관련된 형광의 시간 경과에 따른 대표적인 결과가 표시되어 있습니다.항균 처리와 진핵 세포 세포독성 세제의 대조적인 효과에 주목하십시오. 항생제 Doxycycline의 선택성을 결정하기 위해 동일한 스크리닝 웰에서 IC50 및 CC50 농도 반응을 이중으로 측정하였습니다. 세균 복제는 항생제의 중간 농도에 의해 억제되었습니다.그러나 약 100의 선택성과 일치하게 고농도에서 세포 독성이 관찰되었습니다. Minocycline과 Azithromycin 조합의 2차원 용량 반응을 테스트하기 위해 동일한 분석 형식이 사용되었습니다. 등치선은 동일한 세포 내 성장 억제 지점들을 연결합니다.여기서 오목한 등고선은 두 약물의 강력한 시너지 효과를 시사했습니다. 분석 설정, 실시간 판독 및 고처리량 포맷을 위한 디지털 분주 로봇 공학을 통해 조합 삼중 시너지 테스트가 가능했습니다. 여기서 뚜렷하게 오목한 표면이 관찰되는 것은 Minocycline, Azithromycin 및 Rifampin의 조합이 legionella pheumophila의 세포 내 성장에 대해 높은 정도의 시너지 효과를 나타냄을 시사합니다.이 영상을 시청한 후에는 고처리량 분석 형식에서 형광 또는 발광 분석 판독법을 실시간 세포독성 테스트와 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 이어 공초점 현미경과 같은 다른 방법을 적용하여, 항균 활성 또는 전세포 세포독성과 관련된 전세포 내 생물학적 사건에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 본 연구에서는 레지오넬라(Legionella) 복제에 미치는 영향을 조사하였으나, 동일한 기술을 Brucella 및 마이크로박테리아와 같은 다른 세포 내 병원균에도 적용할 수 있습니다.우리는 매우 높은 처리량의 스크리닝 형식으로 사용할 수 있을 만큼 충분히 간단하고 신뢰할 수 있는 분석법을 찾던 중 처음으로 이 프로토콜을 고안했습니다. 박테리아 병원체, 세포주 및 로봇 장비를 다루는 작업에는 내재적인 위험이 따르므로, 본 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장구를 사용하는 등 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포...

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

여기에서 우리는 세포 독성을 설명하고 화합물의 신속하고 정확한 검사를 허용 한 라운드 감염의 분석은 세포 독성 (CC 50)을 결정하고, WT 및 약물 HIV-1 저항에 대한 IC 50 값.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

학습하세요 실시간 이중 판독 분석법을 통해 진핵 세포 침투성 항균제를 식별하고 세포 독성을 동시에 평가하는 방법. 이 고처리량 기술은 세포 내 세균 감염 치료제 발굴에 활용됩니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

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