Name: 고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 고체 임상 시편에서 기본 난소 상피암 세포를 분리하고 배양하는 방법. 이 기술은 효소 소화, 여과, 원심분리를 통해 순수한 암 세포를 얻어 개별 환자 맞춤 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 환자의 조직 샘플 수집에 대한 지원은 미네소타 대학의 조직 조달 시설의 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB에 미네소타 난소 암 얼라이언스와 MB의 부인과 종양학 부서 기금에 의해, 랜디 면도기 암 연구 및 MB에 커뮤니티 기금, 국방부의 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB에 OC093424에 의해 지원되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 결정 또는 원고의 준비에 역할을했다.

윤리 정책 난소 암의 고체 시료는 기관 심사위원회위원회 후 미네소타 대학의 조직 조달 시설 (TPF)으로 하였다 : 인간의 제목위원회 (IRB)의 승인을. 1. 시약 설치 <ol><li> 10 % FBS, 100 단위 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완하여 완전한 DMEM 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 미디어를 저장하고 따뜻한 37 ° C는 사용하기 전에. </li><li> 다수의 동결을 방지하기 위해 5 ~ 10 ㎖를 별도의 볼륨으로 나누어지는 디스 파제 II는 nonfrost없는 냉동고에 -20 ° C에서 해동 및 저장. </li></ol> 2. 조직 컬렉션 <ol><li> 거시적으로 병리학 자에 의해 암으로 확인 된 지역에서 수술시 난소 암 (크기 ~ 5의 g)의 고체 시료를 수집합니다. 임상 표본 드 식별 및 기관 프로토콜에 따라 등록됩니다. </li><li> 멸균, 사우스 캐롤라이나에있는 표본을 배치REW 뚜껑, 폴리 프로필렌은 빙냉 PBS 30 ㎖로 채워진 용기 표본. 시험편 컬렉션에서 30 분 (그림 1) 내에서, 얼음 처리를 위해 연구소에 외과 병리 실험실에서 시료를 수송한다. </li></ol> 3. 조직 처리 <ol><li> 멸균 조건 하에서 작동하는 페트리 접시 위에 시료 (60mm X 60mm) 신선 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하고 추가로 (2 ㎜ 이하)가 가능한 작은 조각으로 잘라 멸균 면도날을 사용하여 (전송 도 2a 및도 2 B). </li><li> DMEM에 디스 파제 II (2.4 U / ㎖) (30 분 37 ° C) 데워진 10 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 30 분 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. 표본의 최적의 소화를 보장하기 위해, 수동으로 세포 슬러리마다 5 분을 선동. </li><li> 30 분 배양, 전송 (사용 후10 ㎖의 혈청 피펫) 셀 스트레이너 (70 μM 메쉬) 상으로 세포 슬러리를 50 ㎖ 원추형 튜브의 상단에 배치하고 시린지 플런저를 사용하여 메시에 대해 완만 한 압력을 적용 할 수있다. (메쉬의 상단에 남아있는) 모든 해리되지 않은 조직을 무시하고 50 ㎖ 멸균 원뿔 관에서 얻은 세포 현탁액을 수집합니다. 4 ° C에서 7 분 (그림 3)에 대한 320 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버리고 10 % FBS를 함유하는 DMEM으로 10 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀 5 % CO 2에서 배양 접시에있는 서스펜션과 37 ° C (그림 4)을 품어. </li><li> 초기 도금에서 24 시간 후 매체를 변경합니다. 이 세포 파편의 제거 및 문화에 존재하는 적혈구의 대부분을 수 있습니다. </li><li> 매체에게 차 EOC의 문화가 다운 스트림 애플리케이션을위한 준비가 된 후 다음 두 주 동안 매 3 일, 변경합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

난소 암의 병인학 및 개발의 더 나은 이해가이 파괴적인 질환에 의해 영향을 여성의 결과를 개선하기 위해 매우 중요하다. 이러한 상황에서의 사용은 설립 &quot;시판되는&quot;난소 암 세포주는 의심 할 여지없이 대단히 유용왔다. 그러나 오늘 우리는 암 세포 라인들은 이성 9,10의 부족 등 많은 측면에서 시작된 인간의 종양을 반영하지 않고 있다는 것도 알고있다. 여기, 우리는 직접 수술 표본 격리의 30 분 이내에 난소 암의 임상 검체에서 분리 및 기본 난소 암 세포의 배양을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 일차 전지는 복수의 유체 대 고체 시료로부터 분리되어 있기 때문에,이 종래 복수 유체 형성이 발생 시간으로 질병의 초기 단계에서 세포를 분리하는 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 ADV가 여기특정 사이트에서 일차 난소 암 세포를 단리 ANTAGE. 이 프로토콜을 이용하여 실행 가능한 기본...

상대적으로 낮은 발병률에도 불구하고, 난소 암은 부인과 질환과 여성, 2 중 암 사망의 다섯 번째 주요 원인의 치명적인입니다. 이 충실히 질병 3의 개시 및 진행을 요점을 되풀이 신뢰할 수있는 도구와 모델의 부족에 주로 기인한다. 난소 암에 대한 우리의 지식 오늘날 대부분 ascitic 유체 4-7로부터 회수 불멸화 난소 표면 상피 세포 (잃었 지), 난소 암 세포주 및 일차 난소 암 세포의 사용을 통해 가능했습니다. 불행히도, 그들의 사용은 불멸화 과정 또는 체외 통로에 관련된 유전자와 표현형의 변화의 수와 ascitic 유체 준비로 인한 인구의 이질성 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 따라서 난소 암의 식별과 특정한 고체 시료 유래 차 난소 암세포 UNIQU을 나타내는난소 암의 진행을 연구하는 전자 도구입니다. 획득이 악성 세포에 관련된 주요 문제는 생존의 손실이 EOC 세포의 배양에서 증식 능력의 조기 부족과 함께 간질 세포 또는 섬유 아세포의 증식에 기인한다. 고형 종양에서 단일 세포 현탁액을 만들 수있는 몇 가지 방법은 현재 기계적인 방법 또는 효소 분해를 통해, 그러나 특정 기술을 선호하는 결과 8의 큰 금액을 산출 존재한다. 여기, 우리는 표시가 가능한, 섬유 아세포 무료 EOC 세포의 효과적인 복구 디스 파제 II 결과에 소화 효소. 이렇게 얻어진 EOC의 문화 유전자 조작에 매우 민감하고 또한 약물 선별 검사에 유용하다, 이러한 EOC 문화가 다양한 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다는 것을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, 멸균&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>나사 뚜껑, 폴리프로필렌 표본 용기, 멸균</td><td>Thermo Scientific</td><td>02 1090</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 매체, 멸균&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 멸균</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>100x 페니실린-스트렙토마이신, 액상</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, 멸균</td><td>Roche</td><td>04942 078 001</td><td></td></tr><tr><td>소형 미세 팁 겸자 및 메스 블레이드, 멸균</td><td>Fisher Scientific</td><td>겸자: 08-953E, 블레이드: 08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>작은 해부 가위, 멸균</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 캡이 있는 튜브, 멸균</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 캡이 있는 튜브, 멸균</td><td>BD Falcon</td><td>352027</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학적 피펫, 멸균&nbsp;</td><td>Corning</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>6 ml 주사기 플런저, 멸균&nbsp;</td><td>Tyco Healthcare</td><td>8881516911</td><td></td></tr><tr><td>나일론 필터(70 &mu; m ) 세포 여과기, 멸균</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5cm 페트리 디쉬, 멸균&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시, 멸균&nbsp;</td><td>코닝</td><td>430167</td><td></td></tr></tbody></table>

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

난소 암의 개시 및 진행을 조사하는 신뢰할 수있는 도구가 절실히 필요합니다. 난소 암 세포주의 사용이 난소 암을 이해하기위한 유용한 도구가 남아 있지만, 이들의 사용은 많은 제한이있다. 이러한 이질성의 부족 및 확장 체외 계대과 관련된 유전 변경의 과다 있습니다. 여기에서 우리는 기본 난소 암 세포의 빠른 구축을 허용하는 방법은 수술시에 수집 된 고체 임상 검체를 형성 기술한다. 상기 방법은 30 분 동안 효소 소화에 임상 검체를 행하여 이루어져있다. 격리 된 세포 현탁액을 성장시킨다 및 약물 스크리닝 하류 애플리케이션에 사용될 수있다. 설립 난소 암 세포주 이상의 일차 난소 암 세포주의 이점은 그들이 유래되고 다른 사이트 여부로부터 유도 될 수있는 일본어 특정 임상 검체의 대표 점이다 프리마공예 또는 전이성 난소 암.

난소 암의 임상 검체는 신선한 (도 1)는 수술 후 수거하고, 세포 슬러리를 구성하는 작은 조각 (도 2a 및 2b)에서 절단된다. 이 효소 치료에 대한 표본의 최적의 노출을 할 수 있습니다. 셀룰라 슬러리 소화 효소에 노출하고, 30 분간 37 ℃에서 배양된다. 배양 시간 동안 슬러리 (특히 각 교반 후) 점차 구름이되고이 조직 세분화의 표시이다. 배양 시간의 끝에서, 슬러리는 임의의 해리되지 않은 조직 (도 3)로부터 EOC 세포를 분리하는 세포 고사에 전사된다. 회수 된 세포 현탁액은 5 % CO 2와 37 ° C (F의 igure 4)에 배치됩니다. 이 단계에서 세포 배양의 형태는 단일 세포 현탁액과 같은 작은 덩어​​리 모두 EOC 세포의 존재를 드러낸다. 이 시점에서 문화는 또한 프리젠 밝혀<html> 적혈구 및도 5에</strong...

이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

이 절차의 전반적인 목표는 고형 임상 검체로부터 일차 난소암 세포를 분리하고 특성을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 난소 종양 검체를 수집하여 페트리 접시에 담는 것으로 시작됩니다. 두 번째 단계는 샘플을 여러 조각으로 자른 후, 이를 소화 시약이 들어 있는 원심 분리관으로 옮겨 배양하는 것입니다.다음으로, 세포 현탁액을 필터에 통과시켜 세포만을 수집합니다. 원심분리의 마지막 단계는 상층액을 제거하고 세포를 배지에 재현탁하여 하룻밤 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로 상피성 난소암 세포를 수주 동안 배양하며, 이를 통해 후속 응용 연구가 가능해집니다. 이 방법은 각 개별 환자에게 가장 적합한 치료 옵션이 무엇인지와 같은 난소암 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 함의는 난소암 치료로 확장되는데, 이는 유전적 조작에 매우 민감하고 약물 스크리닝 테스트에 더 유용한, 보다 실제적인 세포 배양법을 사용할 수 있게 해주기 때문입니다. 먼저, 500 milliliters의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin(ps)을 첨가합니다. 배지는 4 °C에서 보관하십시오.수술실(OR)에서 샘플을 채취하여 운송 용기에 담긴 상태 그대로 얼음 위에 올려 실험실로 운반합니다. 샘플을 생물학적 안전 작업대(biological safety hood) 안에 놓습니다. 50 mL 원심분리관(conical tube)에 들어있는 샘플을 10 mL의 신선하고 차가운 PBS가 담긴 60 mm x 60 mm 페트리 접시로 옮깁니다.다음으로, 멸균된 면도날을 사용하여 샘플을 2mm 이하의 크기로 더 잘게 자릅니다. 그런 다음 15mL 원추형 튜브에서 DMEM을 디스파스 페이스트 튜브로 처리합니다. 잘게 자른 조직을 DMEM-dispa two 혼합물 튜브로 옮깁니다.그런 다음 샘플을 5% carbon dioxide 및 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 최적의 소화를 보장하기 위해 5분마다 세포 현탁액을 수동으로 흔들어 줍니다. 배양 후, 50 mL 원추형 튜브 위에 놓인 70 µm 메쉬 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 옮깁니다.시린지 플런저를 사용하여 메쉬를 부드럽게 눌러 압력을 가하고, 메쉬 위에 남아 있는 결합되지 않은 조직은 제거한 후, 얻어진 세포 현탁액을 50 milliliter 멸균 원심분리관에 수집합니다. 다음으로, 해당 원심분리관을 4 °C에서 320 ×g로 7분간 원심분리합니다.상층액을 제거하고 10% FBS와 1% ps가 포함된 DMEM 10 milliliters에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 페트리 접시에 옮기고 5% carbon dioxide 및 37 degrees Celsius에서 배양합니다. 세포 부스러기와 배양액에 존재하는 대부분의 적혈구를 제거하기 위해 초기 플레이팅 24시간 후에 배지를 교체합니다.마지막으로, 이후 2주 동안 3일마다 배지를 교체하면 일차 EOC 세포 배양이 완료되어 후속 응용 단계에 사용할 수 있습니다. 플레이팅 직후, 상피성 난소암 세포 또는 EOC 세포는 단일 세포 현탁액 형태 및 적혈구와 세포 파편이 많은 덩어리 형태로 나타납니다.분주 3일 후의 EOC 세포 배양에서는 반부착성의 EOC 세포 클러스터가 관찰되며 적혈구 오염이 감소한 것을 확인할 수 있습니다. 초기 분주 일주일 후, EOC 세포 배양물은 조직 배양 플라스틱 위로 퍼져나가는 소용돌이 모양의 세포 클러스터를 형성합니다. 배양 14일 후 EOC 세포가 단층으로 합쳐지면 전형적인 상피세포의 자갈 모양(cobble stone) 형태가 관찰됩니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 고형 임상 검체로부터 일차 난소암 세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 프로토콜은 난소 절치와 나팔관 암 세포를 공동 배양하여 검체 준비 기술을 설명합니다. 이러한 샘플은 이미징 질량 분광법(IMS)을 사용하여 시각화하여 종양 발생으로 이어지는 세포와 조직 간의 소분자 교환을 감지합니다.

이미징 질량 분석 분석을 위한 난소암 커뮤니케이션 모델링: 전이성 난소 종양 발달에서 소분자 화학 전달자를 식별하는 방법

이 비디오에서는 고형 난소 종양 조직 표본에서 원발성 난소암 세포를 분리하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 상피암 세포는 난소암의 시작 및 발달로 이어질 수 있는 과정을 이해하는 데 적합합니다.

고체 표본에서 원발성 난소암 세포 채취: 난소 종양 표본에서 상피 난소암 세포를 배양하는 방법

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

종양 개시 세포(TIC)는 재발성이 높고 치명적인 질병인 난소암 치료를 위한 실행 가능한 치료 표적이 될 수 있습니다. 우리는 이 고도의 종양 형성 세포 집단을 풍부하게 하는 배양 조건에 대한 프로토콜을 제시합니다.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

전임상 약물 검사를 위한 난소암 환자 유래 오가노이드 모델

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

이 프로토콜은 다양한 질병 단계의 난소암 오가노이드 확립을 위한 체계적인 프레임워크를 제공하고 환자별 변동성 문제를 해결하여 수율을 높이고 후속 응용 분야에서 강력한 장기 확장을 가능하게 합니다. 여기에는 조직 처리, 파종, 배지 요구 사항 조정 및 면역형광 염색을 위한 자세한 단계가 포함됩니다.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

배우세요 고체 임상 시편에서 기본 난소 상피암 세포를 분리하고 배양하는 방법. 이 기술은 효소 소화, 여과, 원심분리를 통해 순수한 암 세포를 얻어 개별 환자 맞춤 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

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