고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법
2014년 2월 4일
이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 고형 임상 검체에서 원발성 난소암 세포를 분리하고 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 난소 종양 표본을 채취하여 페트리 접시에 넣음으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 샘플을 조각으로 자르고 배양을 위한 분해 시약이 있는 원뿔형 튜브로 조각을 옮기는 것입니다.
다음으로, 세포 슬러리는 세포만 수집되는 필터를 통해 통과됩니다.원심분리를 위해 마지막 단계는 상층액을 버리고 세포를 배지에 재현탁시켜 밤새 배양하는 것입니다. 궁극적으로 상피 난소암 세포는 몇 주 동안 배양에서 성장하여 다운스트림 적용이 가능합니다. 이 방법은 각 개별 환자에게 가장 적합한 치료 옵션이 무엇인지와 같은 난소암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 기술의 의미는 유전자 조작에 매우 취약하고 약물 스크리닝 검사에 더 유용한 보다 현실적인 세포 배양을 사용할 수 있기 때문에 난소암 치료로 확장됩니다. 시작하려면 500ml의 델코, 변형 독수리, 미디엄 또는 DMEM에 10%의 소 태아 혈청 또는 FBS와 1%의 페니실린, 스트렙토마이신 또는 ps를 보충합니다. 매체를 섭씨 4도에서 보관하십시오.
수술실에서 샘플을 채취하여 얼음에 담아 운송된 컨테이너 안에 있는 실험실로 운반합니다. 샘플을 생물학적 안전 후드에 넣습니다. 50ml 원추형 튜브에서 10ml의 신선한 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm x 60mm 페트리 접시로 샘플을 옮깁니다.
그런 다음 멸균 면도날을 사용하여 샘플을 2mm 이하로 자릅니다. 그런 다음 15리터 원추형 튜브에 디스크 페이스트 튜브로 DMEM을 처리합니다. 다진 조직을 DMEM dispa two mixture tube로 옮깁니다.
그런 다음 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 최적의 소화를 보장하기 위해 5분마다 세포 슬러리를 수동으로 교반합니다. 배양 후 50ml 원추형 튜브 위에 놓인 70마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 통해 세포 슬러리를 이동합니다.
주사기 플런저를 사용하여 메쉬에 부드럽게 압력을 가하고, 메쉬 위에 남아 있는 관련 없는 조직을 버리고, 얻어진 세포 현탁액을 50ml 멸균 원뿔형 튜브에 수집합니다. 다음은 원심분리기입니다. 원뿔형 튜브는 섭씨 4도에서 7분 동안 320배 G
로 회전합니다.상층액을 버리고 10%FBS 및 1%ps를 함유한 10ml의 DMEM에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 페트리 접시로 옮기고 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 현탁액을 배양합니다. 초기 도금 후 24시간 후에 배지를 변경하여 배양물에 존재하는 세포 파편과 대부분의 적혈구를 제거합니다.
마지막으로, 다음 2주 동안 3일마다 배지를 교체한 후 1차 EOC 세포의 배양이 다운스트림 응용 프로그램을 위해 준비됩니다. 도금 직후. 상피 난소암 세포 또는 EOC 세포는 단일 세포 현탁액으로 나타나며 적혈구와 세포 파편이 풍부한 덩어리로 나타납니다.
도금 3일 후 EOC 세포 배양은 반부착 EOC 세포 클러스터와 적혈구 오염이 적은 것을 보여줍니다. 초기 도금 후 일주일 후, EOC 세포 배양은 조직 배양 플라스틱에 퍼지는 세포 클러스터와 같은 소용돌이가 됩니다. 전형적인 상피 조약돌 형태는 배양에서 14일 후에 EOC 세포의 합류 단층에서 볼 수 있습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 고체 임상 검체에서 원발성 난소암 세포를 분리하고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 연구는 고형 임상 검체로부터 일차 난소암 세포를 분리하고 특성화하는 상세한 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 상피성 난소암 세포를 배양하여 성장시킬 수 있으며, 이는 후속 응용 연구를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 종양학
- 세포 생물학
- 임상 연구
배경
- 난소암은 치료 옵션이 복잡하여 중요한 보건 문제로 간주됩니다.
- 생존 가능한 암세포의 분리는 맞춤형 의학을 위해 매우 중요합니다.
- 기존 방법으로는 순수한 상피성 난소암 세포를 얻지 못할 수 있습니다.
- 본 연구는 더 나은 연구 결과를 위해 분리 공정을 개선하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 임상 시료에서 원발성 난소암 세포를 분리하는 것.
- 분리된 세포를 특성화하여 향후 응용 연구에 활용하는 것.
- 난소암 환자의 치료 옵션에 대한 이해를 높이는 것.
사용된 방법
- 난소 종양 표본 수집.
- 조직 샘플의 효소 소화.
- 생존 세포 분리를 위한 여과.
- 원심분리 및 배양 배지로의 재부유.
주요 결과
- 섬유아세포가 제거된 상피성 난소암 세포의 성공적인 분리.
- 세포를 수 주 동안 배양할 수 있어 광범위한 연구가 가능함.
- 이 방법은 연구를 위한 신뢰할 수 있는 암세포 공급원을 제공함.
- 개인 맞춤형 치료 전략 수립에 기여할 가능성이 있음.
결론
- 설명된 방법은 난소암 세포를 분리하는 데 효과적입니다.
- 이 방법은 난소암 치료에 관한 후속 연구를 지원합니다.
- 향후 연구는 이 방법을 바탕으로 환자의 예후를 개선할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
고형 임상 검체로부터 일차 난소암 세포를 확립하면, 유전적 변이가 축적된 계대 배양 세포주에 대한 의존도를 낮추어 환자 관련 모델을 구현할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 일차 병변 또는 전이 병변의 종양 이질성과 부위 특이적 생물학적 특성을 보존함으로써, 타겟 검증 과정에서 기전적 위험 요소를 제거하는 데 도움이 됩니다. 이렇게 얻은 배양 세포는 후속 스크리닝을 위한 재생 가능한 자원을 제공하여, 전임상 의사 결정의 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 원래 임상 검체의 유전적 및 표현형 프로파일을 반영하는 세포를 사용하여 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 장기간 계대 배양된 세포주와 관련된 인위적 결과물(artifact)을 배제함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 예측적 가치: 질환 관련 시스템 내에서 생물학적 위험이 제거된 타겟 검증을 통해 포트폴리오 우선순위 선정(triage)을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 종양 형성 특성이 유지되어 약물 스크리닝에 적합한 상피성 난소암 세포를 생성합니다.
- 운영적 가치: 효소 소화 및 여과 후 표준화되고 재현 가능한 세포 현탁액을 제공합니다.
- 확장성: 다양한 시료로부터 여러 1차 배양물을 준비하여 병렬 분석 테스트를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 환자의 검체에서 직접 유래된 세포를 사용하여 발견 단계와 전임상 연구를 연결합니다.
- 바이오마커 정렬: 환자의 종양을 반영하는 환경에서 타겟과 바이오마커의 평가를 지원합니다.
- 위험 조정 추진: 임상 결과를 더 잘 예측하는 일차 세포의 반응을 바탕으로 진행 여부(go/no-go) 결정을 내립니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 생물학 연구부터 리드 물질 발굴까지의 발견 연속체 내에 적합하며, 하위 스크리닝 및 검증 작업의 연관성을 높여주는 일차 세포를 제공합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 종양 특이적 특성이 유지된 세포를 사용하여 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 화합물 평가를 위해 성정과 형태를 정량화할 수 있는, 분석 가능한 상태의 일차 상피성 난소암 세포를 제공합니다.
- 분석(Analytics): 유전적으로 안정적이고 계대 배수가 낮은 시스템에서 약물 반응, 증식 및 표현형 변화의 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 검체로부터 직접 유래하여 임상적 관련성을 유지함으로써 바이오마커 및 타겟 검증을 지원합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 검체로부터 일차 배양 세포를 생성할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축하여, 한정된 세포주에 대한 의존도를 낮춥니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 원래 종양의 이질성과 생물학적 특성을 반영하는 세포를 사용하여 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 효소 소화, 여과 및 배양 시작 단계를 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 더 나은 전임상 타겟 검증을 통해 후기 단계의 실패 위험을 줄임으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 환자 유래 일차 세포에서의 활성을 기반으로 후보 물질의 위험 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 무균 조직 취급, 효소 소화 및 일차 세포 배양 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 무균 조건하에 수집된 신선하거나 적절하게 보존된 난소 종양 표본의 확보 여부에 따라 달라집니다.
- 원심분리, 여과 및 생물안전 작업대(biosafety hood)와 CO2 배양기를 포함한 배양 장비가 필요합니다.
- 섬유아세포 오염을 최소화하면서 상피세포 수율을 최대화하기 위해 소화 시간과 기계적 분리 과정의 최적화가 수반됩니다.
- 수술 시점과 운송 조건에 따라 달라질 수 있는 표본의 가용성 및 생존능에 의해 제한됩니다.
