3 차원 Heterotypic 체외에서 모델링

다음 실험의 전반적인 목표는 초기 난소암 발병에 대한 3차원 유형 모델을 생성하는 것입니다. 먼저, 1차 정상 난소 상피 및 섬유아세포 조직에서 유래한 H turt 불멸 세포주를 생성합니다. 그런 다음 난소 공동 배양에 존재하는 생체 내 구조 및 복잡한 세포 세포 상호 작용을 재현하기 위해 3차원 S 스페로이드 모델에서 상피 및 기질 세포주를 진행하여 오가노이드 배양을 고정 및 염색하고 특정 마커의 발현을 분석하여 기질 상피 상호 작용의 분자 특징을 연구합니다.

얻어진 결과는 3D typic 모델의 기질 세포 구획의 변화가 공동 배양된 상피 세포의 표현형에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 3차원 유형 모델은 난소암 질병의 기원을 탐구하고 종양 시작 및 발달에서 기질 미세환경의 역할을 밝히는 것과 같은 난소암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 적용은 다른 3D 배양 방법에 비해 질병 진단 및 치료로 확장됩니다.

이 기술은 광범위한 세포 배양 부피 및 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 3D 호모 및 타이픽 배양은 체외 약물 테스트에 사용할 수 있습니다. 이 접근 방식은 다른 고형 종양 유형 또는 양성 질환 연구와 같은 다른 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다.

신선한 난소 조직을 추가 항생제와 익살로 보충된 불멸의 정상 난소 섬유아세포 성장 배지로 세포 배양 실험실로 운반합니다. PBS 5ml로 샘플을 세 번 세척하여 조직에 느슨하게 붙어 있는 상피 세포를 제거합니다. 다음으로, 시료와 PBS를 깨끗한 P 100 배양 접시로 옮깁니다.멸균 기기를 사용하여 조직을 두 번째 건조 P 100 깨끗한 배양 접시로 옮깁니다.

티슈를 0.5제곱센티미터 조각으로 자르고 각 조각을 별도의 P 100 접시에 옮깁니다. 조직을 1제곱밀리미터 미만의 조각으로 계속 자릅니다. 그런 다음 20ml의 INOF GM 배지를 추가하고 위상 현미경을 사용하여 세포 성장을 위한 모니터를 배양합니다.

세포가 24시간 이내에 접시에 부착되는지 확인하십시오. 위상 현미경 검사를 사용하여 세포 성장 모니터링 세포는 일반적으로 일주일 후 24시간 이내에 접시에 부착됩니다. 흡인에 의해 부착되지 않은 조직을 제거하고 배지를 보충한 다음 세포 집락이 약 500미크론 크기일 때 1-3주 이내에 일주일에 두 번 배양물을 다시 공급합니다.

트립 및 코팅된 클로닝 디스크를 사용하여 클론을 분리합니다. 100% 섬유아세포 세포를 확인하기 위해. 세포주 샘플을 유리 커버 슬립에 플레이트화하고 섬유아세포 마커, 상피 마커 및 내피 세포 마커에 대한 면역형광 염색을 수행합니다.

H Turt passage의 레트로바이러스 형질도입 하루 전, 정상 난소 섬유아세포 세포는 단일 P 100 접시에서 3개의 P 100 접시로 분리됩니다. 사전 제조된 바이러스 sup natan은 HEC 2 9 3 T 세포의 cot transfection을 위한 표준 프로토콜을 사용하여 사내에서 구매하거나 생산할 수 있습니다. 폴리 헤마 용액을 준비하려면 폴리 헤마 1.5g의 무게를 잰 다음 멸균 병에 넣습니다.

95 밀리리터 분자 생물학, 등급, 절대 에탄올 및 5 밀리리터 세포 배양 등급 증류수를 추가합니다. 폴리 헤마 용액을 완전히 용해될 때까지 섭씨 65도의 수조에 넣습니다. 조직 배양 접시에 갓 만든 폴리 헤마 용액을 코팅합니다.

층류 후드 내부의 세포 배양 접시를 자연 건조합니다. 흔들 플랫폼에서 부드럽게 흔들면 더 큰 크기의 접시 또는 플라스크를 균일하게 코팅 할 수 있습니다. 폴리우스 용액이 너무 빨리 건조되면 표면이 매끄럽지 않습니다.

원하는 경우, 3D 배양 전에 섬유아세포를 전처리하거나, 예를 들어, 노화를 유도하기 위해, 치사량 이하의 과산화수소로 세포를 전처리합니다. INOF 및 상피 세포 배양을 in vitro에서 회수 및 확장하여 3D 이종성 스테로이드를 확립하기에 충분한 세포를 준비합니다. 5분 PBS 세척 후 폴리 헤마 플레이트에 15ml의 미디엄을 첨가합니다.

한편, 불멸의 정상 난소 섬유아세포 세포에 트립신을 첨가하여 배양 접시에서 분리합니다. 3-5분 후, 동일한 부피의 배양 배지로 트립신을 중화하고 원심분리로 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 5ml 배지에 재현탁시키고 위아래로 피펫팅하거나 부드럽게 볼텍싱하여 잘 혼합합니다.

그런 다음 10마이크로리터 샘플을 사용하여 trian blue를 사용하여 생존 가능한 세포를 열거합니다. 이제 poly hema coated plate에 이미 분주된 배지에 400만 개의 INOF 세포를 추가합니다. 배양 배지 부피를 20 밀리리터로 구성하고 섭씨 37도, 5 % 이산화탄소에서 배양합니다.

2-3일마다 S 스페로이드 배양물을 재공급하기 위해 위상 현미경을 통해 다세포 스테로이드로의 세포 응집을 모니터링합니다. 플레이트를 피펫에 비스듬히 놓습니다. 스페로이드가 가라앉을 때까지 기다렸다가 5ml 피펫으로 약 16ml의 소진된 매체를 조심스럽게 제거합니다.

16ml의 신선한 배지를 배양액에 추가하고 7일째에 인큐베이터로 돌아갑니다. 섬유아세포 phe에 상피 세포를 추가하여 이형형 배양을 생성합니다. 먼저, 세포를 열거한 후 앞서 설명한 대로 트립신에 의한 난소 상피 세포의 현탁액을 준비합니다.

INOF GM 배지에서 한 번 세척하여 성장 인자가 상피 성장 배지에서 전달되는 것을 방지합니다. 섬유아세포 OID 배양의 배지를 보충한 후, 상피세포 배양에 4:1의 섬유아세포의 비율로 상피세포를 첨가합니다. INOF GM의 이종성 OID는 추가로 14일 동안 2-3일마다 유형 배양에 재공급합니다.

면역조직화학을 위해 PHE를 중성 완충 포르민으로 고정하고 PHE를 펠렛화한 다음 포르말린을 70% 에탄올로 교체하십시오. 인체 조직에 사용되는 표준 프로토콜을 사용하여 파라핀으로 가공을 진행합니다. 파라핀 내장 스테로이드는 면역 화학을 사용하여 특정 분자 마커의 h 및 e로 절편 및 염색 할 수 있습니다.

또는 PBS에서 스테로이드를 세척하고 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 그런 다음 샘플을 OCT 배지에 삽입하고 유세포 분석을 위한 저온 유지 물질 절편 및 면역 형광 염색을 위해 스냅 프리즈합니다. PBS에서 스테로이드를 세척하고 섭씨 37도에서 트립신 또는 아큐탄 소화로 해리합니다.

스테로이드를 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리하는 것은 1밀리리터 피펫 팁으로 용액을 위아래로 피펫팅하여 촉진할 수 있습니다. 세포가 너무 커지지 않도록 주의하고, 동일한 부피의 배양 배지로 반응을 중화하고, 40-70 미크론 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 세포를 펠렛화하고 PBS로 세척하고 제조업체의 지침에 따라 실제로 완충 및 염색하여 원하는 수의 세포를 열거하고 재현탁시킵니다. 우리 실험실에서는 난소 상피 세포를 부분적으로 변형시키고 이 세포를 정상 및 노화 난소 섬유아세포와 공동 배양하여 초기 난소암 발생을 모방했습니다.

폐경 전 난소에서 불멸화된 정상 난소 섬유아세포의 면역형광 염색은 원발성 정상 난소 섬유아세포와 불멸화된 정상 난소 섬유아세포 모두 섬유아세포 특이적 단백질을 발현하지만, 사이토케라틴 7을 발현하지 않고 멘톤을 발현합니다. 3D 형태의 PHE에서 단독으로 배양된 정상 난소 섬유아세포 세포는 방추형 형태와 풍부한 세포외 기질을 나타냅니다. 여기서, 정상 난소 섬유아세포를 과산화수소에 노출시켜 7일 동안 노화를 유도한 후 14일 동안 부분적으로 형질전환된 난소 상피 세포를 배양했습니다.

두 가지 세포 유형을 구별하기 위해, 생성된 스테로이드는 증식 마커로 mim one으로, 상피 마커로 범 사이토케라틴에 대해 면역 염색되었습니다. 데이터의 정량화는 노화 미세환경이 부분적으로 형질전환된 상피세포의 종양성 특징을 촉진하는 반면, 정상적인 미세환경은 단층이 복원됨에 따라 세포를 배양할 때 검출되지 않는 정상 및 악성 세포의 종양 진행, 조직학적 특징을 억제한다는 것을 시사합니다. 예를 들어, 세포가 스페로이드 배양으로 전환될 때, 투명 세포 난소암 세포주의 3D 배양에서는 투명 세포 난소암의 조직학적 특징을 검출할 수 있지만, 동일한 세포의 단층 배양에서는 검출할 수 없습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 상피 세포와 기질 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 3차원 유형 배양을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 초기 종양 발생 동안. 3D 배양을 설정할 때 다운스트림 응용 분야에 따라 세포 수를 조정하여 처리 중에 재료가 약간 손실될 수 있도록 하는 것이 중요합니다.

마스터하면 이 절차에 따라 1시간 안에 3D 배양을 설정할 수 있습니다. 유전자 발현 마이크로레이 프로파일링과 결합된 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 3D 유형 배양에서 발생하지만 단층 배양 조건에서는 검출되지 않는 전반적인 유전자 발현 변화를 분석할 수 있습니다. 이를 통해 3D 코어 배양에서 특이적으로 발생하는 양방향 신호 전달 경로를 분석할 수 있습니다. 미시환경.