게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

이 절차의 전반적인 목표는 어레이 비교 게놈 하이브리다이제이션(array comparative genomic hybridization)을 수행하여 다양한 유전 질환을 유발할 수 있는 게놈 내의 불균형을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 환자의 DNA를 형광 염료로 라벨링함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 라벨링된 환자의 DNA와 다르게 라벨링된 대조군 DNA를 어레이에 하이브리다이제이션합니다.

다음으로, 각 프로브에 결합된 환자 및 대조군 DNA의 양을 측정하기 위해 어레이를 스캔합니다. 마지막 단계에서는 스캔된 이미지를 처리하여, 환자의 DNA가 대조군 DNA 어레이보다 물질이 더 많거나 적은 게놈 영역을 식별합니다. 비교 게놈 하이브리드화를 통해 환자가 유전 증후군을 유발하는 복제수 변이(copy number variant)를 보유하고 있는지 여부를 결정합니다.

어레이 슬라이드 조립이 까다롭고 하이브리디제이션 과정에서 챔버 밖으로 용액이 넘쳐흐르기 쉽기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 라벨링 반응을 시작하기 전에 챔버 밖으로 흘러나온 액체를 혼합하십시오. 사용 준비가 완료된 뉴클레오타이드 및 프라이머가 담긴 96-웰 플레이트를 4°C에서 빛을 차단한 상태로 약 1시간 동안 해동하십시오.

해동 후, 덮개가 덮인 플레이트를 실온에서 30분 동안 더 평형화하고, 동시에 DNA 샘플을 60 °C에서 15분 동안 평형화합니다. 샘플이 가온되는 동안 액체 핸들링 로봇을 사용하여 새로운 96-well 플레이트의 각 웰에 충분한 양의 nuclease free water를 분주합니다. 이후 DNA 준비가 완료되면, 웰당 1 µg의 샘플을 water가 담긴 96-well 플레이트로 옮깁니다.

이제 희석된 DNA 샘플이 들어 있는 플레이트의 각 웰에 평형화 뉴클레오타이드와 프라이머 20 µL를 옮기고, 스트립 캡으로 플레이트를 밀봉하되 빈틈없이 밀착되도록 주의하십시오. 다음으로, 가열 덮개가 장착된 PCR 기기에서 99 °C로 10분간 DNA를 변성시킨 후, 플레이트를 얼음 위에 올려 5분 동안 급냉시켜 프라이머를 어닐링하십시오. 그런 다음 액체 핸들링 로봇을 사용하여 각 샘플에 clean out exo DNA polymerase 효소 10 µL를 첨가하십시오.

피펫으로 샘플을 혼합한 다음, 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 웰당 5 µL의 정지 완충액을 넣어 반응을 종료시킵니다. 그 후 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거합니다. 각 웰의 내용물을 미리 라벨을 붙인 개별 2 mL 튜브로 옮깁니다.

샘플과 DNA 정제 스핀 컬럼, 그리고 이에 적합한 관련 버퍼들을 스핀 컬럼 처리 로봇에 적재합니다. 제조사의 지침에 따라, 스핀 컬럼 처리 로봇은 튜브당 250 µL의 고염 DNA 결합 버퍼를 사용하여 표지된 DNA를 실리카 막에 결합시키며, 이후 500 µL의 세척 버퍼로 두 번 세척하여 막에서 불순물을 제거합니다. 그 다음 로봇이 15 µL의 저염 용출 버퍼를 막에 첨가하여, 샘플 하이브리드화에 사용할 정제된 표지 DNA 샘플을 약 12 µL 부피로 회수합니다.

다음으로 하이브리다이제이션 오븐을 65 °C로 예열하고, 백킹 슬라이드와 하이브리다이제이션 챔버를 미리 데워줍니다. 하이브리다이제이션 믹스를 준비하려면 cot 1D NA 1.1 µL, 제조사 제공 블로킹 믹스 4.95 µL, 그리고 하이브리다이제이션 버퍼 24.75 µL를 혼합합니다. 액체 핸들링 로봇을 사용하여 이 믹스를 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하며, 이때 전송 정확도를 높이기 위해 각 팁을 미리 적셔줍니다.

다음으로 적절한 시그닌(signing) 3-표지 DNA 9.35 µL를 분주한 후, 적절한 시그닌 5-표지 DNA 9.35 µL를 분주합니다. 각 웰에 대해 플레이트를 밀봉하고, 샘플을 1분 동안 처리한 다음, 플레이트를 빠르게 원심 분리하여 각 웰의 바닥에 내용물을 모읍니다. 전하이브리드화 인큐베이터에서 표지된 DNA를 변성시킵니다.

먼저 95 °C에서 3분간 처리한 후, 이어서 37 °C에서 30분간 처리합니다. 그 다음 42 °C 가열 플랫폼 위에서 작업을 수행합니다. 가스켓의 투명한 부분이 하이브리다이제이션 챔버의 윈도우 부분과 일치하도록 확인하며 배킹 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에 넣습니다. 이때 미리 적신 팁을 사용하십시오.

이제 하이브리다이제이션 믹스 42 µL를 어레이 백킹 슬라이드의 해당 위치 중앙에 천천히 피펫팅합니다. 이때 액체가 고무 링 경계에 닿지 않도록 주의하십시오. 모든 위치가 채워지면 어레이 슬라이드를 백킹 슬라이드 위로 조심스럽게 내리고 하이브리다이제이션 챔버를 조립합니다.

글씨가 적힌 어레이 면이 받침 슬라이드 쪽을 향하도록 주의한 다음, 하이브리드화 챔버 나사를 완전히 조이고 조립된 하이브리드화 챔버를 점검하여 하이브리드화 시 누출이 없는지 확인하십시오. 고무 링 경계 밖에서 혼합하며, 각 기포의 높이가 약 4 mm가 되도록 합니다. 하이브리드화 챔버를 수직으로 세운 상태에서 챔버를 회전시켜 이를 확인하십시오.

각 위치의 모든 공기 방울이 움직이고 있는지 확인하십시오. 만약 공기 방울이 정체되어 있다면, 챔버를 실험대 위에 가볍게 톡톡 쳐주십시오. 그 다음 하이브리드화 챔버를 65 °C로 설정된 회전 오븐에 넣고 24시간 동안 유지하십시오.

다음 날 하이브리드화 챔버를 세척 버퍼 1에 담그고, 플라스틱 평면 핀셋을 사용하여 슬라이드를 분리합니다. 그런 다음 가스켓 슬라이드는 폐기하고 어레이 슬라이드를 신선한 버퍼 1에 담긴 랙에 넣습니다. 약 700 milliliters의 세척 버퍼에서 어레이 슬라이드를 1~5분 동안 세척하며, 이때 플리(flea)와 마그네틱 스터(magnetic stirrer)를 사용하여 격렬하게 교반합니다.

그 후 어레이 슬라이드를 약 700 milliliters의 세척 버퍼로 옮겨 두 번 세척하며, 각 회당 90초 동안 진행하고 두 번째 세척의 마지막 단계에서는 더 강하게 교반합니다. 어레이 슬라이드를 버퍼에서 조심스럽게 들어 올립니다. 이때 슬라이드는 건조된 상태여야 합니다.

그런 다음 어레이 슬라이드를 슬라이드 보호대와 함께 스캐너의 슬라이드 홀더에 장착하고 샘플을 스캔합니다. 어레이 제조사의 지침에 따라, 하이브리드화된 어레이의 각 프로브는 적색 및 녹색 형광색소의 혼합물로 시각화됩니다. 각 프로브에 대한 적색 및 녹색 형광 신호의 비율은 스캐너에 의해 정량화되며, 관련 소프트웨어가 이를 게놈 위치에 따라 log two ratio로 플롯합니다.

결과로 얻은 어레이 트레이스(array traces)를 통해 게놈 불균형으로 식별된 영역을 해석할 수 있습니다. 예를 들어, 7번 염색체의 근위부 영역에 있는 저복제 반복 서열(low copy repeats)에 의해 발생하는 재발성 미세 결실 증후군인 윌리엄스 증후군(Williams syndrome) 환아의 트레이스에서, 소프트웨어는 게놈 불균형 영역을 빨간색 선으로 식별하였습니다. 정상 게놈 영역의 경우 녹색 대 적색 비율이 1:1임을 나타내며, 형광 로그 비율(fluorescent log ratio)은 0 근처에 밀집되어야 합니다.

이 스캔에서 관찰되는 것과 같이 흩어져 있는 어레이 트레이스는 비정상 영역의 부정확한 판독이나 게놈 불균형 식별 실패로 이어질 수 있으며, 이는 낮은 DNA 품질, 방사선 존재, 대기 중의 오존 농도 등 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, aCGH 검사를 위해 환자 시료를 처리하는 방법과 후속 분석 및 복제수 변이 검출을 위한 고품질 데이터를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.