Name: 게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 유전 질환 진단을 위한 배열 비교 게놈 교잡(aCGH) 기법으로 환자 DNA의 게놈 불균형을 정확하게 탐지하는 방법을. 형광 표지 및 하이브리드화를 통해 복사 수 변이를 식별하고 유전 증후군 진단의 정확성을 높입니다.

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1. 라벨 반응 <ol><li> 사용할 준비가 -20 C에서 접시와 상점 96 웰으로 제조업체가 권장하는 농도에서, 미리 나누어지는 메틴 3, 5 표지 dUTPs, 레이블이없는 뉴클레오티드 랜덤 프라이머를 사용하기 전에. 이 프로토콜, 분취 적절한 표지 된 dUTP의 10.5 μL 10.5 μL 뉴클레오티드와 표지되지 않은 각 웰 랜덤 프라이머의 목적. </li><li> 빛으로부터 보호는 약 1 시간 동안 12 ° C에서 뉴클레오티드 프라이머가 즉시 사용 96 웰 플레이트를 해동. </li><li> 해동 후, 빛으로부터 보호 적어도 30 분 동안 실온에서 평형이 플레이트. </li><li> 적어도 15 분 동안 60 ° C에서 DNA 샘플을 평형. </li><li> 액체 핸들링 로봇을 이용하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 클레아없는 물을 분배. 주 : 물의 부피는 각각의 입력 샘플 DNA의 농도에 의존 할 것이다 NG 50 / UL의 최종 농도 야기하기에 충분해야한다. </li><li> 액체 한 사용dling 로봇, 96- 웰 플레이트의 웰에 피펫 1 μg의 DNA가 (1.5 참조) 20 μL에 전량을 가지고. 주 : 결과 데이터의 품질이 저하 될 수 있지만, DNA의 소량이 사용될 수있다 (귀중한 샘플 400 NG 아래로 입력 DNA 량을 사용할 수있다). </li><li> 액체 핸들링 로봇을 이용하여 DNA의 희석 플레이트의 각 웰에 평형화 뉴클레오티드 프라이머의 20 μl를 옮긴다. </li><li> 스트립 캡 (단단히 밀착이 중요하다)와 함께 96 웰 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 가열 뚜껑 PCR 기계에서 10 분 동안 99 ° C에서 DNA를 변성하고 어닐링 프라이머 5 분 동안 얼음 냉각 스냅. </li><li> 액체 핸들링 로봇을 이용하여 각 DNA를 철저히 혼합하고 피펫으로 엑소 클레 나우 DNA 폴리머 라제 효소의 10 μL를 추가한다. 참고 : 전체 볼륨이 50 μl를해야한다. </li><li> 96 웰 플레이트를 밀봉하고 16 시간 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 4 시간의 짧은 배양 그러나의 O / N 충분하다cubation 더 편리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 액체 처리 로봇을 사용하여, 각 웰에 정지 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 주 : 라벨에 사용되는 반응 시약의 개요를 표 1에 나타낸다. </li></ol> 비법 인 뉴클레오티드 2. 제거 <ol><li> 실리카 막 기반 스핀 열 및 전용 스핀 열 처리 로봇 (스핀 열을 수동으로 처리 될 수있다)를 사용하여 비법 인 뉴클레오티드를 제거합니다. 제조업체의 지침을 따르십시오. <ol><li> 웰 2 ㎖의 튜브에 각각의 내용을 전송; 잘 ID 년대와 사전 라벨이는. 주 :이 단계는 액체 핸들링 로봇을 이용하여 수동으로 또는 바람직하게 수행 될 수있다. </li><li> 스핀 컬럼 처리 로봇을 사용하면, 2 ㎖의 튜브, DNA 정제 스핀 컬럼과 연관된 버퍼와로드 로봇. </li><li> 실리카에 표시된 DNA에 결합하는 라벨링 반응 250 ㎕의 높은 소금, DNA 결합 버퍼 (완충 PB)를 추가합니다막. </li><li> 500 μL 세척 버퍼 (PE 버퍼)로 두 번 막을 세척하여 불​​순물을 제거합니다. </li><li> ~ 12 μL의 부피 정제, 표지 된 DNA를 회수하는 막에 15 μL 저염 용출 완충액 (EB 버퍼)에 추가. </li></ol></li></ol> 3. 그리고, Hyb 쌍을 결합 <ol><li> 시아닌 3, 5 표지 DNA의 적절한 쌍을 결합, COT-1 DNA, 제조업체에서 제공 차단 믹스와 액체 처리 로봇을 사용하여 제조업체에서 제공 하이브리드 버퍼입니다. 참고 : 공유 CNVs는 문제가되지 않습니다 경우 이러한 HYB 쌍 (예를 들어, 우리가 일상적으로 그들은 매우만큼, 같은 두개골 조기 유합 환자 대 신 이형성증 환자 등의 표현형 - 일치하지 않는 샘플을, 쌍 샘플 대 샘플과 기준, 또는 샘플이 될 수 있습니다 ) 같은 임상 적으로 유의 CNV 운반 가능성. 기준 DNA를 사용하는 경우, 상용 전원 DNA를 권장하고, 시료와 함께 처리되어야한다. <ol><li> 액체 취급 RO 사용로봇, COT-1 DNA (3333 NG / μL)을 추가 제조업체 제공 각 웰 1.1 μL의 COT-1 DNA, 4.95 ㎕의 블로킹 믹스 24.75 포함되도록 96 웰 플레이트의 각 웰에 혼합하고 혼성화 블로킹 완충액 μL 하이브리드 버퍼입니다. </li><li> 각 웰에 해당 시아닌 3 표지 DNA의 9.35 μl를 추가합니다. 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상. </li><li> 각 웰에 해당 시아닌 5 표지 DNA의 9.35 μl를 추가합니다. 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상. </li><li> 1 분 동안 96 웰 플레이트와 소용돌이 인감. 각 웰의 바닥에 내용을 수집하기 위해 96- 웰 플레이트 스핀. </li></ol></li></ol> 4. 하이브리드 <ol><li> 65oC에 하이브리드 오븐을 예열 한 백업 슬라이드 및 각 배열 슬라이드 한 하이브리드 챔버를 prewarm. <ol><li> 배열에 적용되기 전에 미리 하이브리드 배양에 표시된 DNA를 변성. 24 시간 동안 회전 오븐에서 하이브리드를 수행합니다. </li><li> 30 분 동안 70 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션 후 적어도 5 분 동안 37 ° C에서 떠난다. </li><li> 42 ° C에서 가열 된 플랫폼에서 작업 사용하기 전에 하이브리드 실에 각각의 백업 슬라이드를로드합니다. 가스켓 슬라이드의 투명한 부분은 하이브리드 챔버의 &#39;윈도 윙&#39;부분과 정렬되었는지 확인합니다. </li><li> 피펫 이전에 제조 된 하이브리드 믹스의 42 μl의 슬라이드를 백업 어레이의 적절한 위치에 (섹션 3 참조). 사전 젖은 각각의 팁은 정확성을 피펫 팅 향상. 피펫 천천히 확인하고 각 위치의 중심에 액상 고무 링 경계를 만지지 않습니다. </li><li> 백업 슬라이드에 모든 위치가 작성되면,주의 깊게에 배열 슬라이드를 낮추고 하이브리드 챔버를 조립한다. 그것을 쓰기로 배열의 측면 등판이 슬라이드를 향하고 있는지 확인하십시오. 완전히 하이브리드 실 나사를 조이십시오. </li><li> 조립 된 하이브리드 챔버를 검사합니다. E이 고무 링 경계 외부 혼성화 믹스의 누설이없고, 혼성화 챔버의 수직 단부에 얹혀 때마다 기포 높이 ~ 4mm로되어 nsure. 하이브리드 챔버를 돌려 위치 및 이동되지 붙어있는 기포가 없는지 확인합니다. 이들 중 하나라도있을 경우, 챔버를 벤치에 예리한 탭을 준다. 모든 기포가 이동하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 24 시간 동안 65 ° C에서 회전 오븐에 하이브리드 챔버를 놓습니다. 오븐 로터가 균형을 확인하십시오; 필요한 경우 다른 빈 챔버를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 5. 세탁 스캔 슬라이드 <ol><li> 초과 표지 DNA를 제거한 다음 각 프로브의 형광을 측정하기 위해 스캔 배열을 씻으십시오. <ol><li> 오븐과 분해에서 하이브리드 챔버를 가져 가라. 배열 및 가스켓 슬라이드 붙어됩니다; 세척 버퍼 1이 잠수함과 간격을 캐 내려고 플라스틱, 평면 깨끗 포셉 한 쌍을 사용합니다. </li><li> 디가스켓 슬라이드를 scard 버퍼 1에 잠긴 랙에 배열 슬라이드를 배치합니다. </li><li> 격렬하게 교반, 5 분 동안 신선한 세척 버퍼 1 ~ 700 ml의에 배열 슬라이드를 씻으 (벼룩과 자석 교반기를 사용). </li><li> ~ 700 ml의 세척 버퍼 (2)에 배열 슬라이드를 전송하고 격렬하게 교반, 90 초 동안 세척한다. 부드럽게 세척 버퍼 2 중 배열 슬라이드를 올려, 그들은 건조 등장한다. </li><li> 슬라이드 방지기를 사용하여 스캐너의 슬라이드 홀더에 배열 슬라이드를 넣습니다. 배열 스캐너로 슬라이드를 넣고 배열 ​​제조업체의 지침에 따라 검사합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

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어레이 CGH는 triploidy로 균형 재 배열 또는 배수성 이상을 감지하지 않습니다. 또한, 낮은 수준의 모자이크 불균형을 감지 할 수없는 문제점이있다. 그러나, 배열 CGH는 많은 세포 유전학 실험실에서 대체하고 G 줄무늬 염색체 분석보다 CNV 검출을위한 높은 해상도를 가지고있다. 따라서 게놈 전체의 CNV 감지를위한 황금의 현재 표준입니다. 이것은 향후 차세대 시퀀싱 기술로 대체 될 수 있지만, 현재, 그 비용 및 기술적 인 복잡성이 아직 임상 사용에 적합하지 않은 것으로 의미 CNV 감지 판독 짧은 사용과 관련된. 여기에 설명 된 프로토콜은 임상 서비스 실험실에서 일상적인 사용 중입니다. 96 샘플을 각각 두 실행은 액체 처리 로봇과 전용 실리카 막 스핀 열 처리 로봇을 사용하여 각 주에 처리됩니다. 자동화는 매우 일관성을 개선하고 품질을 유지하는 것이 좋습니다. DNA 혈액에서 추출타액, 산전 샘플 (예, 융모 또는 양수) 또는 조직 샘플이 될 수...

이것은 염색체 결실 또는 세그먼트들의 추가 복사본들이 지적 장애, 및 dysmorphism congentical 기형을 일으킬 그 수년 동안 알려져 있고, 어떤 경우에는 하나의 유전 적 증후군을 야기하고있다. 그러나 이러한 변화의 게놈 전체의 검출을위한 2000 년대 중반까지 사용할 수있는 유일한 기술은 할 수없는 불균형의 지역 및 특성에 따라 5-10Mb 주위의 해상도를 가지고 염색체 분석을, 줄무늬 G, 그리고 어떤 재료가 동일한 밴딩 패턴 다른 염색체 영역에 의해 대체 된 염색체 이상을 검출한다. 이러한 현장 하이브리드 멀티 플렉스 결찰 특정 프로브 증폭 형광 등의 보조 세포 유전 학적 기술이 의심되는 특정 syndromic 불균형의 경우, 특정 유전자좌의 심문에 사용할 수 있었지만,이 배열 비교 게놈 교잡의 도입까지이지 않았다 (배열 CGH) 일상적인 임상 진단의에카피 수의 게놈 넓은 감지 (CNVs) 변종 서 비 스 2-5 (일반적으로 1백20킬로바이트 정도) 크게 증가 해상도로 가능하게되었다. 일부 지역은 일반 인구의 6-7에 널리 퍼져에 대한 조사 연구와 함께 임상 서비스 작업은 다른 CNVs 반면, 이전에 발견 할 수없는, 자폐증과 간질 8-11로 neurodisabilities과 관련된, CNVs 것으로 나타났습니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜은 우리의 영국 국민 건강 서비스 (NHS) 임상 진단 실험실에서 사용된다 우리는이 국가 재정 지원 서비스 비용을 최소화하기 위해 새로운 하이브리드 전략, 배치 테스트 및 로봇을 사용합니다. 아래 설명 프로토콜 이전에, 고품질의 DNA가 적절한 출발 물질, 일반적으로 혈액, 세포 배양 또는 조직 샘플로부터 추출한다. 280 흡광도 비 (B한다 :이 측정법 농도를 측정하는데 사용될 수 있고 (260)을 확인 (&gt; 50 NG / UL이 있어야한다)전자 1.8 ~ 2.0). 젤 전기 영동은 DNA가 크게 저하없이 높은 분자량 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 자동화 된 액체 처리 로봇을 사용하여 런타임 당 96 샘플에 레이블 높은 처리량 실험실을 위해 설계되었습니다. 그러나, 낮은 처리량없이 자동화 실험실 위해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>CGH 마이크로어레이 8 x 60K</td><td>애질런트</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>어레이 CGH 세척 버퍼</td><td>애질런트</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>어레이 CGH 혼성화 버퍼</td><td>애질런트</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>어레이 CGH 라벨링 키트</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 cgh)

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

게놈 복제 수 변이체 검출을 위한 Array CGH가 G 밴드 핵형 분석을 대체했습니다. 이 백서는 임상 진단 서비스 실험실에서의 기술과 그 적용에 대해 설명합니다. 환자의 샘플(혈액, 타액 또는 기타 조직 유형)에서 추출한 DNA는 형광 색소(시아닌 5 또는 시아닌 3)로 표시됩니다. 참조 DNA 샘플은 반대쪽 형광 색소로 표시되어 있습니다. 표지된 DNA가 혼합되어 혼성화 완충액에 재현탁되고 임상적으로 중요한 영역에서 높은 프로브 밀도로 게놈 전체의 유전자좌에서 ~60,000개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된 어레이에 적용되기 전에 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위한 정화 단계가 따릅니다. 혼성화 후 어레이를 세척한 다음 스캔하고 결과 이미지를 분석하여 각 프로브의 적색 및 녹색 형광을 측정합니다. 소프트웨어는 각 프로브 측정의 품질을 평가하고, 적색 형광과 녹색 형광의 비율을 계산하고, 잠재적인 복제 수 변형을 검출하는 데 사용됩니다.

혼성화 된 각 프로브 어레이에 적색, 녹색의 형광체의 혼합물로서 가시화된다 (도 1 참조). 각 프로브에 대한 녹색 형광 신호에 빨간색의 비율은 스캐너에 의해 정량화하고 관련 소프트웨어는 자신의 게놈 위치에 따라 LOG2 비율 이러한 플롯, 외부 프리셋 경계 떨어지는 영역을 식별합니다. 결과 배열 트레이스는 genomically 불균형으로 식별 영역의 해석을 할 수 있습니다. 예를 들어, 윌리엄스 증후군, 염색체 7의 인접 지역에서 낮은 복사 반복에 의해 매개 되풀이 microdeletion 증후군을 가진 아이의 추적이 그림 2에 도시되어있다.이 불균형은 소프트웨어에 의해 확인되었다 빨간 선으로 표시. 게놈의 정상 영역에 대한 1 : 1의 녹색 / 적색의 비율을 나타내는,도 2에 도시 된 바와 같이 형광 로그 비율은, 0 주위에 클러스터링한다 밀접 프로브. 흩어져 배열 흔적 resul ...

유전자 복제 수 변이의 검출을위한 어레이 CGH는 G-밴드 핵형 분석을 대체하고있다. 이 문서는 기술 및 진단 서비스 실험실에서의 응용 프로그램을 설명합니다.

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

이 절차의 전반적인 목표는 어레이 비교 게놈 하이브리다이제이션(array comparative genomic hybridization)을 수행하여 다양한 유전 질환을 유발할 수 있는 게놈 내의 불균형을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 환자의 DNA를 형광 염료로 라벨링함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 라벨링된 환자의 DNA와 다르게 라벨링된 대조군 DNA를 어레이에 하이브리다이제이션합니다.다음으로, 각 프로브에 결합된 환자 및 대조군 DNA의 양을 측정하기 위해 어레이를 스캔합니다. 마지막 단계에서는 스캔된 이미지를 처리하여, 환자의 DNA가 대조군 DNA 어레이보다 물질이 더 많거나 적은 게놈 영역을 식별합니다. 비교 게놈 하이브리드화를 통해 환자가 유전 증후군을 유발하는 복제수 변이(copy number variant)를 보유하고 있는지 여부를 결정합니다.어레이 슬라이드 조립이 까다롭고 하이브리디제이션 과정에서 챔버 밖으로 용액이 넘쳐흐르기 쉽기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 라벨링 반응을 시작하기 전에 챔버 밖으로 흘러나온 액체를 혼합하십시오. 사용 준비가 완료된 뉴클레오타이드 및 프라이머가 담긴 96-웰 플레이트를 4°C에서 빛을 차단한 상태로 약 1시간 동안 해동하십시오.해동 후, 덮개가 덮인 플레이트를 실온에서 30분 동안 더 평형화하고, 동시에 DNA 샘플을 60 °C에서 15분 동안 평형화합니다. 샘플이 가온되는 동안 액체 핸들링 로봇을 사용하여 새로운 96-well 플레이트의 각 웰에 충분한 양의 nuclease free water를 분주합니다. 이후 DNA 준비가 완료되면, 웰당 1 µg의 샘플을 water가 담긴 96-well 플레이트로 옮깁니다.이제 희석된 DNA 샘플이 들어 있는 플레이트의 각 웰에 평형화 뉴클레오타이드와 프라이머 20 µL를 옮기고, 스트립 캡으로 플레이트를 밀봉하되 빈틈없이 밀착되도록 주의하십시오. 다음으로, 가열 덮개가 장착된 PCR 기기에서 99 °C로 10분간 DNA를 변성시킨 후, 플레이트를 얼음 위에 올려 5분 동안 급냉시켜 프라이머를 어닐링하십시오. 그런 다음 액체 핸들링 로봇을 사용하여 각 샘플에 clean out exo DNA polymerase 효소 10 µL를 첨가하십시오.피펫으로 샘플을 혼합한 다음, 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 웰당 5 µL의 정지 완충액을 넣어 반응을 종료시킵니다. 그 후 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거합니다. 각 웰의 내용물을 미리 라벨을 붙인 개별 2 mL 튜브로 옮깁니다.샘플과 DNA 정제 스핀 컬럼, 그리고 이에 적합한 관련 버퍼들을 스핀 컬럼 처리 로봇에 적재합니다. 제조사의 지침에 따라, 스핀 컬럼 처리 로봇은 튜브당 250 µL의 고염 DNA 결합 버퍼를 사용하여 표지된 DNA를 실리카 막에 결합시키며, 이후 500 µL의 세척 버퍼로 두 번 세척하여 막에서 불순물을 제거합니다. 그 다음 로봇이 15 µL의 저염 용출 버퍼를 막에 첨가하여, 샘플 하이브리드화에 사용할 정제된 표지 DNA 샘플을 약 12 µL 부피로 회수합니다.다음으로 하이브리다이제이션 오븐을 65 °C로 예열하고, 백킹 슬라이드와 하이브리다이제이션 챔버를 미리 데워줍니다. 하이브리다이제이션 믹스를 준비하려면 cot 1D NA 1.1 µL, 제조사 제공 블로킹 믹스 4.95 µL, 그리고 하이브리다이제이션 버퍼 24.75 µL를 혼합합니다. 액체 핸들링 로봇을 사용하여 이 믹스를 새로운 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하며, 이때 전송 정확도를 높이기 위해 각 팁을 미리 적셔줍니다.다음으로 적절한 시그닌(signing) 3-표지 DNA 9.35 µL를 분주한 후, 적절한 시그닌 5-표지 DNA 9.35 µL를 분주합니다. 각 웰에 대해 플레이트를 밀봉하고, 샘플을 1분 동안 처리한 다음, 플레이트를 빠르게 원심 분리하여 각 웰의 바닥에 내용물을 모읍니다. 전하이브리드화 인큐베이터에서 표지된 DNA를 변성시킵니다.먼저 95 °C에서 3분간 처리한 후, 이어서 37 °C에서 30분간 처리합니다. 그 다음 42 °C 가열 플랫폼 위에서 작업을 수행합니다. 가스켓의 투명한 부분이 하이브리다이제이션 챔버의 윈도우 부분과 일치하도록 확인하며 배킹 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에 넣습니다. 이때 미리 적신 팁을 사용하십시오.이제 하이브리다이제이션 믹스 42 µL를 어레이 백킹 슬라이드의 해당 위치 중앙에 천천히 피펫팅합니다. 이때 액체가 고무 링 경계에 닿지 않도록 주의하십시오. 모든 위치가 채워지면 어레이 슬라이드를 백킹 슬라이드 위로 조심스럽게 내리고 하이브리다이제이션 챔버를 조립합니다.글씨가 적힌 어레이 면이 받침 슬라이드 쪽을 향하도록 주의한 다음, 하이브리드화 챔버 나사를 완전히 조이고 조립된 하이브리드화 챔버를 점검하여 하이브리드화 시 누출이 없는지 확인하십시오. 고무 링 경계 밖에서 혼합하며, 각 기포의 높이가 약 4 mm가 되도록 합니다. 하이브리드화 챔버를 수직으로 세운 상태에서 챔버를 회전시켜 이를 확인하십시오.각 위치의 모든 공기 방울이 움직이고 있는지 확인하십시오. 만약 공기 방울이 정체되어 있다면, 챔버를 실험대 위에 가볍게 톡톡 쳐주십시오. 그 다음 하이브리드화 챔버를 65 °C로 설정된 회전 오븐에 넣고 24시간 동안 유지하십시오.다음 날 하이브리드화 챔버를 세척 버퍼 1에 담그고, 플라스틱 평면 핀셋을 사용하여 슬라이드를 분리합니다. 그런 다음 가스켓 슬라이드는 폐기하고 어레이 슬라이드를 신선한 버퍼 1에 담긴 랙에 넣습니다. 약 700 milliliters의 세척 버퍼에서 어레이 슬라이드를 1~5분 동안 세척하며, 이때 플리(flea)와 마그네틱 스터(magnetic stirrer)를 사용하여 격렬하게 교반합니다.그 후 어레이 슬라이드를 약 700 milliliters의 세척 버퍼로 옮겨 두 번 세척하며, 각 회당 90초 동안 진행하고 두 번째 세척의 마지막 단계에서는 더 강하게 교반합니다. 어레이 슬라이드를 버퍼에서 조심스럽게 들어 올립니다. 이때 슬라이드는 건조된 상태여야 합니다.그런 다음 어레이 슬라이드를 슬라이드 보호대와 함께 스캐너의 슬라이드 홀더에 장착하고 샘플을 스캔합니다. 어레이 제조사의 지침에 따라, 하이브리드화된 어레이의 각 프로브는 적색 및 녹색 형광색소의 혼합물로 시각화됩니다. 각 프로브에 대한 적색 및 녹색 형광 신호의 비율은 스캐너에 의해 정량화되며, 관련 소프트웨어가 이를 게놈 위치에 따라 log two ratio로 플롯합니다.결과로 얻은 어레이 트레이스(array traces)를 통해 게놈 불균형으로 식별된 영역을 해석할 수 있습니다. 예를 들어, 7번 염색체의 근위부 영역에 있는 저복제 반복 서열(low copy repeats)에 의해 발생하는 재발성 미세 결실 증후군인 윌리엄스 증후군(Williams syndrome) 환아의 트레이스에서, 소프트웨어는 게놈 불균형 영역을 빨간색 선으로 식별하였습니다. 정상 게놈 영역의 경우 녹색 대 적색 비율이 1:1임을 나타내며, 형광 로그 비율(fluorescent log ratio)은 0 근처에 밀집되어야 합니다.이 스캔에서 관찰되는 것과 같이 흩어져 있는 어레이 트레이스는 비정상 영역의 부정확한 판독이나 게놈 불균형 식별 실패로 이어질 수 있으며, 이는 낮은 DNA 품질, 방사선 존재, 대기 중의 오존 농도 등 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, aCGH 검사를 위해 환자 시료를 처리하는 방법과 후속 분석 및 복제수 변이 검출을 위한 고품질 데이터를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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