게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 유전 질환으로 이어질 수 있는 게놈의 불균형을 식별하기 위해 비교 게놈 혼성화를 배열하는 것입니다. 이것은 먼저 형광 염료로 환자의 DNA를 라벨링함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 환자, DNA와 다르게 표지된 참조 DNA가 어레이에 혼성화됩니다.

다음으로, 어레이를 스캔하여 각 프로브에 풍부한 환자와 참조 DN의 양을 측정합니다. 마지막 단계에서 스캔된 이미지를 처리하여 환자의 DNA가 참조 DNA가 최종적으로 배열하는 것보다 더 많거나 적은 물질을 가지고 있는 게놈 영역을 식별합니다. 비교 게놈 혼성화(Comparative genomic hybridization)는 환자가 유전적 증후군을 유발하는 복제 수 변이를 가지고 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다.

이 방법의 시각적 시연은 어레이 슬라이드의 조립이 어려울 수 있고 하이브리드화가 용이하기 때문에 중요합니다. 라벨링 반응을 시작하기 전에 챔버에서 유출된 물을 혼합하십시오. 바로 사용할 수 있는 뉴클레오티드 및 프라이머의 96웰 플레이트를 섭씨 4도에서 해동하고 약 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다.

해동되면 실온에서 30분 더 덮인 플레이트를 평형화하고 이때도 섭씨 60도에서 15분 동안 DNA 샘플을 평형화합니다. 샘플이 가열되는 동안 액체 처리 로봇을 사용하여 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 충분한 뉴클레아제가 없는 물을 분배합니다. 그런 다음 DNA가 준비되면 웰당 1마이크로그램의 샘플을 96웰 플레이트의 물로 옮깁니다.

이제 20마이크로리터의 평형 뉴클레오티드와 프라이머를 희석된 DNA 샘플이 들어 있는 각 플레이트에 옮기고 단단히 밀봉되도록 주의하면서 스트립 캡으로 플레이트를 밀봉합니다. 다음으로, 10분 후 가열된 뚜껑이 있는 PCR 기계에서 섭씨 99도의 DNA를 변성시키고 얼음 위에서 플레이트를 5분 동안 스냅 냉각하여 프라이머를 무릎 꿇게 합니다. 그런 다음 액체 처리 로봇을 사용하여 각 샘플에 10마이크로리터의 세척 exo DNA 중합효소를 추가합니다.

피펫으로 샘플을 혼합한 다음 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 다음날, 웰 당 5 마이크로 리터의 정지 버퍼로 반응을 종료 한 다음 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거합니다. 각 웰의 내용물을 사전 라벨링된 개별 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.

샘플과 DNA 정제 스핀 컬럼을 스핀 컬럼 처리 로봇과 적절한 관련 완충액에 로드합니다. 제조업체의 지침에 따라 스핀 컬럼 처리 로봇은 튜브당 250마이크로리터의 고염 DNA 결합 버퍼로 라벨링된 DNA를 실리카 멤브레인에 결합한 후 각각 500마이크로리터의 세척 버퍼를 두 번 세척하여 멤브레인에서 불순물을 제거합니다. 그런 다음 로봇은 멤브레인에 15마이크로리터의 저염 용액 완충액을 추가하여 약 12마이크로리터 부피의 정제된 라벨링된 DNA 샘플을 회수하여 샘플을 하이브리드화합니다.

다음으로, 혼성화 오븐을 섭씨 65도로 예열하고 백킹 슬라이드와 혼성화 챔버를 예열합니다. 혼성화 혼합물을 준비하려면 1.1마이크로리터의 cot 1D NA, 제조업체가 제공한 차단 혼합물 4.95마이크로리터, 24.75마이크로리터의 혼성화 완충액을 결합합니다. 액체 취급 로봇을 사용하여 이 혼합물을 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 할당하고 각 팁을 미리 적셔 전달 정확도를 향상시킵니다.

다음으로 적절한 서명의 9.35 마이크로 리터, 3 개의 표지 된 DNA, 9.35 마이크로 리터의 적절한 서명, 5 개의 표지 된 DNA를 피펫으로 만듭니다. 각 웰에 플레이트를 밀봉하고, 1분 동안 샘플을 포렉스하고, 플레이트를 빠르게 회전시켜 각 웰의 바닥에 내용물을 수집합니다. pre hybridization incubator에서 표지된 DNA를 잘 변성시킵니다.

처음에는 섭씨 95도에서 3분 동안, 그 다음에는 섭씨 37도에서 30분 동안 지속됩니다. 그런 다음 섭씨 42도의 가열 플랫폼에서 작업합니다. 백킹 슬라이드를 혼성화 챔버에 배치하고 사전 습식 팁을 사용하여 개스킷의 투명한 부분이 혼성화 챔버의 창이 있는 부분과 정렬되도록 합니다.

이제 천천히 42 마이크로 리터의 혼성화 혼합물을 어레이 백킹 슬라이드의 적절한 위치 중앙에 피펫팅합니다. 액체가 고무 링 경계에 닿지 않도록 주의하십시오. 모든 위치가 채워지면 어레이를 조심스럽게 내리고 백 슬라이드로 밀어 혼성화 챔버를 조립합니다.

글씨가 있는 어레이의 측면이 백킹 슬라이드를 향하도록 주의한 다음 혼성화 챔버 나사를 완전히 조이고 조립된 혼성화 챔버를 검사하여 혼성화 누출이 없는지 확인합니다. 고무 링 경계 밖에서 혼합하고 각 기포의 높이가 약 4mm가 되도록 합니다. 혼성화 챔버를 수직으로 끝부분에 놓았을 때 혼성화 챔버를 회전시켜 이를 확인합니다.

각 위치의 모든 기포가 움직입니다. 거품 중 하나라도 붙어 있으면 챔버를 벤치를 세게 두드립니다. 그런 다음 혼성화 챔버를 섭씨 65도의 회전 오븐에 24시간 동안 넣습니다.

다음날 혼성화 챔버를 세척 버퍼 1에 담그고 한 쌍의 플라스틱 평평한 모서리 집게를 사용하여 슬라이드를 들어 올립니다. 그런 다음 개스킷 슬라이드를 버리고 어레이 슬라이드를 새 버퍼 1에 담근 랙에 넣습니다. 어레이 슬라이드를 약 700ml의 세척 버퍼로 1-5분 동안 세척하고 벼룩과 마그네틱 스타로 세게 저어줍니다.

그런 다음 어레이 슬라이드를 약 700ml의 세척 버퍼로 옮기고, 두 번째 세척이 끝날 때 더 격렬하게 저어주면서 90초 동안 두 번 이동합니다. 어레이 슬라이드를 버퍼 밖으로 부드럽게 들어 올립니다. 그들은 건조하게 나타나야 합니다.

그런 다음 어레이 슬라이드를 슬라이드 보호기와 함께 스캐너의 슬라이드 홀더에 넣은 다음 샘플을 스캔합니다. 어레이 제조업체의 지침에 따라 하이브리드화된 어레이의 각 프로브는 빨간색과 녹색 형광 색소의 혼합물로 시각화됩니다. 각 프로브에 대한 적색 대 녹색 형광 신호의 비율은 스캐너에 의해 정량화되고 관련 소프트웨어는 게놈 위치에 따라 로그 2 비율로 배치합니다.

결과 어레이 추적을 통해 유전체학적으로 불균형한 것으로 식별된 영역을 해석할 수 있습니다. 예를 들어, 7번 염색체의 근위 영역에서 낮은 복제 반복에 의해 매개되는 재발성 미세 결실 증후군인 윌리엄스 증후군을 앓고 있는 어린이의 이 추적에서 게놈 불균형은 소프트웨어에 의해 빨간색 선으로 식별되었습니다. prop 형광 로그 비율은 0 주위와 밀접하게 밀접하게 클러스터링되어야 하며, 이는 게놈의 정상 영역에 대해 1:1의 녹색 대 빨간색 비율을 나타냅니다.

이 스캔에서 관찰된 산란된 어레이 추적은 비정상 영역의 부정확한 호출 또는 게놈 불균형을 식별하지 못하는 결과를 초래할 수 있으며 낮은 DNA 품질 또는 광선의 존재, 대기 영역의 오존 수준을 포함한 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CGH에 의한 테스트를 위해 환자 샘플을 처리하는 방법과 다운스트림 분석 및 복제 수 변동 감지를 위한 우수한 품질의 데이터를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.