전체 게놈 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 기술의 데모

다음의 짧은 프리젠테이션은 27 K sub megabase ting array에 대한 hybridization protocol을 보여주는 비디오이다. 이 어레이 또는 스마트 어레이는 단일 슬라이드에 인쇄된 26, 946개의 개별적으로 염기서열화된 백 클론으로 구성됩니다. 그들은 18 x 54mm 영역에서 인쇄 된 슬라이드 당 총 54, 000 개의 요소에 대해 중복으로 발견됩니다.

결과 데이터는 생물정보학의 데이터 해석이 필요 없는 고밀도 올리고 어레이와 비슷합니다. 백 클론과 같은 대형 인서트 어레이 사용의 주요 장점 중 하나는 증폭 없이 100나노그램의 샘플 DNA를 사용할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 혈액 냉동 조직, 분류된 세포의 DNA, FFPE 물질과 같은 다양한 샘플을 분석할 수 있습니다.

스마트 어레이는 임상 환경에서 유용한 것으로 입증되었습니다. BC Cancer Agency에서는 여러 환자의 검체 분석을 평균 주당 근무 시간에 쉽게 적용할 수 있습니다. 세포 유전학의 경우.

어레이 CGH에 사용되는 대부분의 단계는 기존 CGH 또는 물고기와 유사합니다. 확립된 실험실에 프로토콜을 빠르게 도입할 수 있습니다. DNA의 품질은 어레이의 결과에 가장 큰 영향을 미치는 단일 요소입니다.

CGH 혼성화, 낮은 품질 또는 오염된 DNA는 제품에 PSI 통합에 부정적인 영향을 미쳐 데이터에 흐릿한 이미지나 노이즈를 발생시킵니다. NanoDrop 분광 광도계는 혼성화 전에 DNA 품질을 평가할 수 있는 훌륭한 도구입니다. DNA 세트를 정량화하기 위해 NanoDrop은 핵산을 측정하고 모드는 DNA 50 blank를 측정하기 위해 NanoDrop은 재현탁 샘플과 동일한 용액 1.5마이크로리터를 사용합니다.

이 경우 water Tris입니다. EDTA는 PS D 통합에 잠재적으로 부정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났습니다. Kim 와이프로 빈 와이프를 제거하고 1.5마이크로리터의 샘플 측정값을 추가하고 샘플 농도를 기록합니다.

NanoDrop에서 2개의 60 대 2개의 80 판독값은 1.8 비율이 최적인 DNA 품질의 좋은 지표입니다. 이중 비율 분석법인 2 60 over two 80 및 2 60 over two 30은 시료의 순도를 측정하는 더 나은 방법을 제공합니다. NanoDrop은 파장에 대한 상대적인 흡광도를 나타내는 곡선을 표시합니다.

피크가 없는 부드러운 곡선은 양질의 DNA를 나타내며 NanoDrop을 물과 Kim 와이프로 세척하거나 샘플이 제한적인 경우 받침대에서 샘플을 피펫팅합니다. 이 프로토콜은 100-400나노그램의 샘플에 최적화되어 있습니다. 200나노그램은 좋은 품질의 DNA를 위한 목표량입니다.샘플에 라벨을 붙이려면 다음 시약과 장비가 필요합니다.

완충액, SCI, 3 SCI, 5 무작위 응급실 10 배, DNTP 믹스 참조 DNA, 멸균 물, 0.2 마이크로 리터, 멸균 PCR 튜브, 섭씨 100도의 얼음 열 블록, 섭씨 45 도의 인큐베이터. 참조 DNA용 반응관 1개와 반응관 1개를 설정합니다. 샘플 DNA의 경우 각각 sci-fi와 SCI three로 표시됩니다.

연구 환경에서는 오존 분해에 더 강하기 때문에 샘플 DNA에 CY three를 사용하는 것을 선호합니다. DNA, 물, 근관 완충액을 샘플에 결합하고 참조 DNA에 대해 반복합니다. 우리 실험실에서는 10배 버퍼를 무작위 Optimus와 결합합니다.

5회 용액을 만들려면 총 17마이크로리터의 양에 멸균수를 추가합니다. 튜브를 열 블록으로 옮기고 섭씨 100도에서 5분 동안 변성시킵니다. 즉시 얼음으로 옮기십시오.

10 배 DNTP 믹스의 4 마이크로 리터를 추가합니다. 측면 눈을 추가합니다. 2마이크로리터의 SCI 3 labeled DCTP를 DNA의 샘플에 추가합니다.

DNA를 참조하기 위해 DCTP라고 표시된 2마이크로리터의 scifi를 추가합니다. 2.5마이크로리터의 운하를 넣고 섞습니다. 용액은 손으로 혼합하거나 와류일 수 있습니다.

탁상용 원심분리기에서 빠른 펄스로 용액을 튜브 바닥으로 짧게 회전시킵니다. 오븐에 옮겨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 교잡 시간은 라벨링 공정에 부정적인 영향을 미치지 않고 14시간에서 24시간 사이로 조정할 수 있습니다.

MicroCon YM 30 컬럼을 사용하여 실험실 스케줄에 맞추려면 컬럼에 100마이크로리터 걸린 1D NA를 추가합니다. 피펫 팁이 끼인 멤브레인을 만지지 않도록 주의하십시오. DNA 배치 간 변동은 주요 유통업체에서 구매한 경우에도 발생하는 것으로 알려져 있습니다.

사용하기 전에 대량 배치를 구입하여 테스트하는 것이 좋습니다. 이제 각 샘플 혼성화에 대해 두 개의 튜브가 있으며, 하나는 파란색으로, 다른 하나는 빨간색으로 표시됩니다. 각 샘플에 대한 튜브를 결합하고 피펫팅으로 혼합합니다.

그런 다음 전체 용액을 MicroCon 멤브레인으로 옮깁니다. 제공된 MicroCon 튜브에 컬럼을 넣고 13, 000G에서 10분 동안 회전합니다. MicroCon 컬럼은 크기 배제 컬럼이며 통합된 side dye로 DNA를 트랩하고 uninformed dye가 membrane을 통해 세척될 수 있도록 합니다.

잔류 비통합 뉴클레오티드 또는 측면을 세척하려면 멤브레인에 200마이크로리터의 멸균 증류수를 추가합니다. 13, 000G에서 10분 동안 다시 돌립니다. 튜브를 버리고 45마이크로리터의 혼성화 용액을 MicroCon 농축기 컬럼 상단에 추가합니다.

우리가 사용하는 하이브리드화 솔루션은 Roche Scientific의 Dig Easy이며, 5마이크로리터 공유 청어 정자도 솔루션에 추가될 수 있습니다. 전통적으로 이것은 슬라이드 표면에 대한 비경쟁적 바인딩을 차단하는 데 사용되었습니다. 새로운 결합 물질의 출현으로 이 단계를 제거할 수 있게 되었습니다.

그러나, 때때로 혼성화 용액의 점도를 증가시키기 위해 첨가됩니다. MicroCon 컬럼을 뒤집어 레이블이 지정된 새 튜브에 넣습니다. 3000G에서 튜브를 3분 동안 돌립니다.

용액은 새 튜브의 바닥에 고입니다. 1.5 마이크로 리터의 용액은 SD Incorporation의 정량화에 사용됩니다. NanoDrop To microarray 분석을 공백으로 설정합니다.

1.5마이크로리터의 dig를 가진 NanoDrop. 쉬운 혼성화 버퍼. NanoDrop으로 블랭크를 측정합니다.

판독값은 0이어야 합니다. 김 닦기로 빈 물티슈를 제거하고 샘플 측정기 1.5마이크로리터를 추가하고 샘플 통합을 기록합니다. NanoDrop은 S3 및 공상 과학 염료 혼입 샘플의 마이크로리터당 PICA 몰 농도를 아래와 같이 제공합니다.

마이크로리터당 3올레는 Fluor four가 너무 적은 것으로 간주되어야 합니다.계속하려면 NanoDrop은 파장 대비 흡광도 그래프를 표시합니다. 두 개의 봉우리가 보여야 하며, 양쪽 눈 각각에 하나씩 NanoDrop을 물과 김 닦기로 닦고 청소합니다. 커버 슬립을 슬라이드 워머 또는 열 블록에 놓고 섭씨 45도로 예열하여 하이브리드화 온도를 유지합니다.

42마이크로리터의 프로브 용액을 22mm x 60mm 커버 슬립에 놓습니다. 용액에 기포가 없는지 확인하십시오. 완고한 거품을 제거하는 빠른 방법은 새 커버 슬립을 가져 와서 날카로운 모서리로 거품을 터뜨리는 것입니다.

덮개를 덮고 미끄러짐과 프로브 용액 위에 슬라이드를 정렬합니다. 슬라이드의 한쪽 가장자리를 내려 혼성화 솔루션과 접촉할 수 있습니다. 커버 슬립이 표면 장력으로 슬라이드에 부착될 때까지 한쪽 가장자리를 계속 내립니다.

슬라이드를 반전시킵니다. 슬라이드를 하이브리드화 카세트에 넣고 섭씨 45도로 예열한 다음 하단 홈에 10마이크로리터의 물을 추가하여 습도를 제어합니다. 이 단계는 굴착이 더 낮은 온도에서 쉽게 결정화되고 슬라이드에 배경을 남기므로 연습해야 합니다.

이것은 용액이 매우 얇은 액체 층이기 때문에 슬라이드에 있을 때 특히 중요합니다. 이 시점에서 카세트를 밀봉하고 섭씨 45도에서 36-40시간 동안 배양합니다. 하이브리드화 카세트에서 슬라이드를 제거하는 것이 중요합니다.

파고 실온에서 쉽게 결정화됩니다. 슬라이드를 즉시 담그고 세척액에서 커버 슬립을 제거해야 합니다. 모든 세척 용액은 미리 만들어져 있어야 하며 pH가 7이고 중성이 아닌 pH는 측면 눈을 저하시킬 수 있습니다.

세척액을 섭씨 45도로 예열합니다. 혼성화 챔버를 열기 전에 약 60ml의 세척 용액을 Copeland 용기에 추가합니다. 챔버를 엽니다.

핀셋으로 슬라이드를 제거하고 세척 용액에 슬라이드를 추가합니다. 커버 슬립이 부착된 상태에서 10-20초 동안 기다렸다가 핀셋으로 커버 슬립을 회수합니다. 미끄럼틀에서 떨어졌어야 했습니다.

이것은 굴착 쉬운 버퍼가 결정화되는 것을 방지하고 커버 슬립을 기계적으로 제거하여 슬라이드의 잠재적인 긁힘을 줄이기 때문에 중요한 단계입니다. 세척 용액으로 슬라이드를 세 번 세척하십시오. 동요와 함께 각 1 분.

슬라이드를 세 번 헹굽니다. 마지막 세척 후 볼 수 있는 세척 용액의 SDS에 잔류 기포가 없어야 합니다. 원심분리기를 사용할 준비가 될 때까지 슬라이드를 세척 용액에 그대로 두십시오.

원심분리기 50ml Falcon 튜브에서 700G에서 1분 동안 사용합니다. 사용하기 전에 Falcon 튜브가 건조한지 확인하십시오. 신호 강도는 시간이 지남에 따라 감소하므로 즉시 슬라이드를 스캔하십시오.

주변 오존 수준에 따라 모든 스캐너가 다르지만 따라야 할 몇 가지 일반적인 지침이 있습니다. 슬라이드 이미징용. 주변 오존 수준은 스캔 과정에서 매우 중요합니다.

Sci-Fi Die는 오존에 민감하며 긴 스캔 시간 동안 빠르게 분해됩니다. 오존의 5ppm이 S 5에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이것은 맑은 날의 가벼운 교통 공해와 같습니다.

주변 오존 수준을 기록하기 위해 오존 미터를 사용하는 것이 좋습니다. 각 채널 S3 및 SCI 5에 대해 별도의 이미지가 생성됩니다. 채널은 스캐너의 노출, 시간, 여기, 입력 또는 캡처 감도를 변경하여 균형을 맞출 수 있습니다.

이제 이러한 이미지를 분석할 준비가 되었습니다.