Name: 어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 어레이 기반 비교 Genomic 교잡(CGH)을 사용하여 Medicago truncatula 돌연변이체에서 복사 수 변이를 신속하게 탐지하는 방법을. 이 기술은 콩과 식물의 유전적 변이 연구에 높은 민감도를 제공합니다.

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이 작품의 자금에서 제공 됩니다 일부 권한을 부여 하 여 NSF 식물 게놈 연구 (IOS-1127155).

참고: 그림 1 배열 CGH 프로토콜에 대 한 5 단계를 보여 줍니다. 그들은: 1); 식물 재료의 준비 2) 격리의 고품질 DNA 샘플; 3) 레이블 및 정화의 DNA 샘플; 4) 교 잡, 세척, 그리고 검색의 전체 게놈 배열; 그리고 5) CGH 데이터 분석. M. truncatula 전체 게놈 타일링 어레이 50000 개 이상의 유전자 나 게놈 (참조 자료의 테이블)에 유전자 모델을 대상으로 하는 971,041 독특한 올리고 프로브의 총 포함 되어 있습니다. 고유의 프로브 간격 약 모든 150의 기본적인 쌍 (bp) exonic 지역 및 261에 M. truncatula 게놈의 intronic 지역에서 bp.
 1. 식물 재료의 준비 <ol><li>Scarify 야생 타입 (WT; M. truncatula cv Jemalong A17)와 8 분에 대 한 집중된 한 황산을 가진 FN6191 돌연변이 씨앗 (재료의 표 참조). 제거 하 고 액체 폐기물 컨테이너에 황산 삭제.</li>
	<li>린스 씨앗 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번.</li>
	<li>표면 소독 씨앗 10 분에 대 한 20% 표 백제 솔루션</li>
	<li>린스 씨앗 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번.</li>
	<li>3 일 동안 4 ° C에 저장 씨앗. Vernalization, 후 전송 및 성장 챔버와 16/8 h에에서 1 주일 명암 주기 및 150 µE/m 2 /s 빛 강도 대 한 토양에 씨앗을 발 아.</li>
	<li>1 갤런 냄비에 묘 종을 이식 하 고 16 h/8 h 명암 주기, 3 ~ 4 주에 대 한 150 µE/m 2 /s 빛 강도 가진 온실에서 성장. DNA 분리에 대 한 식물에서 젊은 잎 샘플을 수집.</li>
</ol> 2. 높은 품질 DNA 샘플의 절연 <ol><li>단일 공장에서 젊은 잎 조직 1 g 하 고 액체 질소에 즉시 동결.</li>
	<li>박격포와 유 봉 미세 분말을 액체 질소에서 냉동된 잎 조직이 갈기.</li>
	<li>DNA 분리와 게놈 DNA 분리 키트 (재료의 표 참조).</li>
	<li>Resuspend 정화 DNA 샘플 압력가 이중 이온된 H 2 O의 50 µ L (ddH 2 O) 또는 TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) x 1.</li>
	<li>측정 DNA 농도 분 광 광도 계와 (재료의 표 참조).</li>
	<li>평가 260 nm/280 nm와 DNA 샘플의 260 nm/230 nm 비율. 
	참고: 고품질 DNA 샘플 260 nm/280 nm 비율 있어야 &#8805; 1.8와 260 nm/230 nm 비율 &#8805; 2.0.</li>
	<li>추가 agarose 젤 1%에서 그들을 실행 하 여 DNA 샘플 평가. 
	참고: 고품질 DNA 샘플 높은 분자 무게 있고 RNA에 의해 오염 되지 해야 합니다. 이상적으로, DNA 샘플의 최종 농도 ~ 150 ng / µ L 되어야 합니다.</li>
</ol> 3. DNA 라벨 및 정화 <ol><li>ddH 2 O 500 µ L 원심 분리기 튜브에서 20 µ L의 최종 볼륨을 희석 1 µ g의 genomic DNA 샘플.</li>
	<li>임의의 뇌관의 추가 5 µ L (재료의 표 참조) 관.</li>
	<li>소용돌이 짧게 튜브로 품 어 10 분에 98 ° C에서 DNA를 변성 하 thermocycler</li>
	<li>thermocycler에서 튜브를가지고 고 5 분에 대 한 진정 얼음 물에 바로 넣어</li>
	<li>표 1과 같이 믹스 준비 2 라벨.</li>
	<li>믹스 1과 2 참조 DNA와 DNA 샘플에 라벨의 추가 25 µ L 튜브, 각각.</li>
	<li>세 번 pipetting으로 라벨 믹스와 DNA를 혼합 하 고 튜브를 짧게 회전.</li>
	<li>그리고 20 분 엑 소 Klenow 효소 비활성화 65 ° C에서 37 ° C 2 h에서 품 어 하 thermocycler로 튜브를 넣어 (재료의 표 참조).</li>
	<li>테 버퍼 각 튜브를 x 1의 추가 430 µ L.</li>
	<li>내용을 혼합 하 고 튜브를 짧게 회전.</li>
	<li>전송 솔루션 2 mL 컬렉션 정화 열에 관에서 관 (재료의 표 참조).</li>
	<li>분리기 14000 x g 10 분에 대 한 정화 열</li>
	<li>솔루션을 통해 패스 삭제.</li>
	<li>추가 480 x 각 열으로 TE 버퍼 1 µ L.</li>
	<li>분리기 14000 x g 10 분에 다시 열</li>
	<li>통과 솔루션 삭제.</li>
	<li>새 원심 분리기 튜브에 열에의 하단 부분에 남아 있는 레이블이 DNA 샘플을 전송.</li>
	<li>는 피 펫을 사용 하 여 레이블이 지정 된 DNA 샘플의 볼륨을 측정 하 고 x TE 버퍼 1 80 µ L를 최종 볼륨을가지고.</li>
	<li>는 분 광 광도 계를 사용 하 여 레이블이 DNA 샘플의 농도 측정 (재료의 표 참조).</li>
	<li>레이블된 샘플 DNA의 동일한 금액을 혼합 하 고 DNA를 참조 테 버퍼 x 1와 160 µ L를 최종 볼륨을가지고.</li>
	<li>교 잡 버퍼, 인간 침대 1 DNA의 50 µ L 10 × aCGH 차단 에이전트의 50 µ L x 2 µ L 추가 256 (재료의 표 참조) 3 번 pipetting으로 잘 섞는다.</li>
	<li>짧게 튜브를 회전 하 고 10 분에 98 ° C에 품 어 하 thermocycler에 넣어</li>
	<li>20 분 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어</li>
</ol> 4. 교 잡, 세척, 그리고 게놈 배열의 검색 <ol><li>미리 따뜻한 교 잡 시작 하기 전에 67 ° C 이상 4 h 교 잡 오븐.</li>
	<li>교 잡 챔버의 기지에 가스 켓 슬라이드 배치.</li>
	<li>가스 켓 슬라이드에 단계 3.23에서 교 잡 솔루션의 부하 490 µ L.</li>
	<li>개자리속 truncatula 게놈 microarray 칩 교 잡 챔버를 가스 켓 슬라이드 커버.</li>
	<li>교 잡 챔버 커버에 넣고 클램프와 챔버를 단단히 조입니다.</li>
	<li>조립된 교 잡 실 교 잡 오븐에 넣고 40-48 h. 67 ° C에서 품 어</li>
	<li>설거지 준비 3 슬라이드: 나 실 온에서 보관 하는 두 버퍼를 세척 하는 250 mL와 버퍼 II 세척 한 37에서 보관 ° c.</li>
	<li>항아리 세척 준비 2 슬라이드: 70 mL 이기와 70 mL 안정화와 건조 솔루션 하나, 모두 유지 실내 온도에서 증기 두건에서 (재료의 표 참조).</li>
	<li>교 잡 챔버 오븐에서 제거 하 고 챔버 클램프 및 덮개 제거.</li>
	<li>Microarray 칩 및 가스 켓 나 워시 버퍼와 슬라이드 세척 접시를 슬라이드와 커버 슬라이드에서 칩을 분리 이동.</li>
	<li>두 번째 슬라이드 세척 하는 microarray 칩 이동 나 워시 버퍼와 접시와 부드럽게 순환 5 분에 대 한 실 온에서 자기 저 어 접시에 볶음 바 솔루션</li>
	<li>전송에 microarray 칩을 미리 데워 세척 버퍼 II와 접시 세척 세 번째 슬라이드 1 분 37 ° C에서 자기 저 어 접시에 볶음 bar로 부드럽게 씻어</li>
	<li>Microarray 칩 세척 증기 두건에서 이기와 단지 슬라이드를 전송과 30 씻고 s.</li>
	<li>Microarray 칩 슬라이드 안정화와 함께 항아리를 세척 하 고 건조 솔루션에 전송 하 고 30 씻어 s.</li>
	<li>칩 밖으로 천천히 하 고 1 분에 대 한 그것을 건조합니다</li>
	<li>검색 microarray 칩 스캐너를 사용 하 여 참조 테이블의 자료 2 µ m 해상도. 여러 개의 이미지를 저장 하 고 전체 검사를 슬라이드에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 채널 1과 2 이익 100% 설정 하 고 자동 이득 취소.</li>
</ol> 5. CGH 데이터 분석 <ol><li>추출 Cy3와 Cy5 형광 검색 소프트웨어를 사용 하 여 배열에서 각 프로브에 대 한 농도 (재료의 표 참조).</li>
	<li>세분화 분석 샘플 DNA 사이의 참조 DNA 복사 번호 유사 (CNVs)를 감지 하는 소프트웨어의 사용. CNVs를 결정 하기 위한 세그먼트 의미 로그 2 샘플/참조 비율 ± 2.5 표준 편차의 임계값을 사용 하 여.</li>
	<li>신호 매핑 소프트웨어를 사용 하 여 전체 게놈에서 로그 2 샘플/참조 비율의 분포를 검사 (재료의 표 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

어레이 기반 CGH 플랫폼 검색 및 빠른 중성자 사격 (FNB)의 특성에 대 한 개발 했습니다-cv. M. truncatula Jemalong A17에에서 돌연변이 유도. 배열 CGH 메서드 유전자 돌연변이 검출에서 사용을 보여 우리는 돌연변이 FN6191 S. meliloti Sm1021와함께 접종 때 야생 유형 식물, 달리 하이퍼 nodulation 형 전시의 aCGH 분석을 수행. 세분화 분석을 위해 세그먼트 로그2 비율의 의미는 세그먼트 내의 프로브 있었다면 그 주어진된 배열 비교에 대 한 낮은 임계값 상한 임계값 보다 크거나 중요 한 간주 되었다. 각 비교에 대 한 상한값은 모든 데이터 포인트의 95 번째 백분위 수의 로그2 비율 값을 결정 했다. 각 비교에 대 한 낮은 임계값은 모든 데이터 포인트245 백분위 수의 로그2 비율 값을 결정 했다.
<p class="jove_cont...

콩 (Fabaceae) 콩 (최대 글리신), 알 팔 파 (개자리속 sativa) 등 많은 경제적으로 중요 한 종 가진 꽃 식물의 3 번째로 큰 가족입니다. 콩과 식물 질소 담합 토양 박테리아, 일반적으로 Rhizobia 있는 대기 이질소 호스트 식물에 의해 사용 하기 위해 암모니아로 감소 된다 뿌리 혹을 개발 하 라는 작용할 수 있습니다. 이와 같이, 콩과 식물 작물의 재배는 질소 비료의 작은 입력 요구 하 고 따라서 지속 가능한 농업에 기여. 콩과 식물 작물 생산 나뭇잎과 씨앗 높은 단백질 콘텐츠, 우수한 사료 및 곡물 작물으로 봉사. 그러나, 재배 콩과 식물 종에는 일반적으로 복잡 한 게놈 구조, 성가신 콩과 식물-특정 프로세스에 핵심 역할을 하는 유전자의 기능 연구를 만드는 있다. 개자리속 truncatula 널리 채택 되었습니다 콩과 식물 연구에 대 한 모델 종으로 주로 하기 때문에 (1)는 상대적으로 작은 단일 게놈 크기 (550 ~ Mbp); 2 중 게놈 (2) 식물 유전자 기능 연구; 대 한 안정적으로 변형 될 수 있다 그리고 (3)은 밀접 하 게 관련 된 알 팔 파 (M. sativa로 구나), 사료의 여왕 및 변환 연구에 대 한 다른 많은 경제적으로 중요 한 작물. 최근, 게놈 시퀀스 M. truncatula cv의 Jemalong A17 발표1,2되었습니다. 게놈 주석 50000 개 이상의 예측된 유전자 나 게놈에 있는 유전자 모델을 보여 줍니다. M. truncatula 에 유전자의 대부분의 기능을 확인 하려면 게놈은 어려운 작업입니다. 유전자의 기능 연구를 촉진 하기 위해1 라인의 범위에서 돌연변이의 포괄적인 컬렉션 생성 된 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis M. truncatula 이력서에 사용 하 여 Jemalong A173 4. 빠른 중성자, 고 에너지 이온화 돌연 애기5,6, 쌀 (Oryza sativa)7, 토마토 (푸른 풀밭을 포함 하 여 많은 식물 종에 돌연변이 생성에 사용 되었습니다. lycopersicum), 콩 (글리신 soja; 최대 G.)8,9, 보 리 (Hordeum vulgare), 그리고 로터스 나무10. FNB mutagenesis에서 파생 된 변이의 큰 부분 DNA 삭제 메가 기본적인 쌍9,11몇 가지 기본적인 쌍 크기에서 범위는 한다. 많은 표현 형 관련 유전자 성공적으로 되었습니다 식별 및 특징4,12,13,,1415,16, 17 , 18 , 19. 이전, 지도 기반 접근 시간이 소모 하 고 분자 수준에서 특징을 돌연변이의 수를 제한에 의존 FNB 돌연변이에서 기본 유전자의 분자 클로닝. 최근에, 몇 가지 무료 방법을 사본 기반 메서드를 포함 하 여, 게놈 DNA 복사 번호 유사 검색, 및 전체 게놈 시퀀싱, 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 기와 고용 촉진 하는 동물과 식물20,21,22,23,,2425을 포함 한 다양 한 유기 체에서 삭제 돌연변이의 특성 26,,2728,29,30,31.
M. truncatula는 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH)에서 FNB 돌연변이의 특성화를 촉진 하기 위하여 플랫폼 개발 되어과 검증. 동물 시스템에 보고, CGH 배열 기반 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 전체 게놈 수준에서 복사 번호 유사 (CNVs)의 탐지를 허용 한다. 또한, 병 변 PCR에 의해 확인 될 수 있습니다 및 삭제 테두리 시퀀싱에 의해 확인 될 수 있다. 전반적으로, 배열 CGH 플랫폼 M. truncatula FNB 돌연변이에 병 변 식별에 효율적이 고 효과적인 도구입니다. 여기, 배열 CGH 절차 및 PCR 특성화 M. truncatula FNB 돌연변이에 삭제 테두리의 그림은.
다음 프로토콜 복사 번호의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 유사 식물에서. 예를 들어, 개자리속 truncatula FN6191 돌연변이 삭제 지역과 후보 유전자 돌연변이 고기와 관련 된 식별 하 사용 되었다. M. truncatula FN6191 돌연변이, 빠른 중성자 사격 유도 삭제 돌연변이 컬렉션32 에서 원래 고립 된 토양 접종 후 하이퍼 nodulation 표현 형을 전시 하는 ( 테이블의 자료참조) 박테리아, 야생 유형 식물 달리 Sihorhizobium meliloti Sm1021

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula 게놈 어레이, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (돌연변이)</td><td>사내</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (참조)</td><td>사내</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag DNA 라벨링 키트</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Labnet international, Inc</td>, <td>Spectrafuge, 24D</td><td></td></tr>, <tr><td>안정화 및 건조 솔루션</td><td>, 애질런트</td><td>5185-5979</td><td></td></tr>, <tr><td>올리고 aCGH/ChIP-온-칩 하이브리드화 키트</td><td>, 애질런트</td><td>5188-5380</td><td></td></tr>, <tr><td>하이브리드화 챔버 개스킷 슬라이드</td>, <td>애질런트</td><td>G2505</td><td></td></tr>, <tr><td>Human Cot-1, DNA</td><td>, 애질런트</td>, <td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 1 및 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 챔버, 스테인리스</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>정제 컬럼</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐너</td><td></td><td>Roche MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>신호 맵 1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>신호 맵1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

어레이 기반 비교 genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

돌연변이 유전자 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원 이다. 돌연변이 컬렉션을 생성 하려면 세 가지 유형의 mutagens 활용할 수 있습니다, T DNA 또는 transposon 등 생물, 에틸 methanesulfonate (EMS), 같은 화학 또는 이온화 방사선 같은 물리를 포함 하 여. 돌연변이 관찰의 유형에 돌연 사용에 따라 다릅니다. 이온화 방사선 유발 돌연변이, 돌연변이 또는 삭제, 복제, 또는 재배치 포함. T-DNA 또는 transposon-기반 mutagenesis는 변환에 취약 종으로 제한, 화학 또는 물리적 mutagenesis 종의 광범위 한 범위에 적용할 수 있습니다. 그러나, 전통적으로 화학 또는 물리적 mutagenesis에서 파생 하는 돌연변이의 특성 지도 기반 복제 방식을, 노동 집중과 시간이 소모 되는 사용 합니다. 자, 우리 감지 하 여 효율적으로 복사 번호 유사 (CNVs) 돌연변이에 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis에서 파생 된 특성 고밀도 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (aCGH) 플랫폼을 적용할 수 있음을 보여합니다 개자리속 truncatula, 콩과 식물 종입니다. 전체 게놈 시퀀스 분석 50000 개 이상의 유전자 나 유전자 모델 M. truncatula에서 보여줍니다. M. truncatula 에서 현재, FNB 유발 돌연변이에서 150000 이상 m 1 라인을 대표 하는 게놈에 있는 유전자의 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원에서 파생 됩니다. 여기에 설명 된 aCGH 플랫폼 FNB 유발 돌연변이 M. truncatula에 특성화를 위한 효율적인 도구입니다.

그림 2 는 전체 게놈에서 돌연변이 WT 신호 대의 표준화 된 로그2 비율의 분포를 보여준다. CGH 데이터의 분석 공개 대략적인 전체 SUNN 유전자33 와 몇 가지 다른 염색체 4에 22 kb 삭제 주석 FN6191 돌연변이 (그림 2, 그림 3)에서 유전자. 후보자 삭제 된 지역 평균 정규화 된 로그2 비율 미만-2.5 (보충 표 1) 73 연속 프로브 배열에 의해 덮여 있었다. 삭제 테두리의 검사 제안이 돌연변이에 상 상속 삭제 좌표 22,313,168 및 22,334,934 염색체 4 (그림 3) 사이 위치한 프로브에 의해 ...

이 프로토콜에 복사 번호 유사의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비, 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 식물입니다.

어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

이 어레이 기반 비교 게놈 혼성화 프로토콜의 전반적인 목표는 콩과 식물 Medicago truncatula의 고속 중성자 폭격 유도 돌연변이에서 복제 수 변이를 신속하게 식별하는 것입니다. 이 방법은 콩과 식물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 콩과 식물의 결절 발달을 조절하는 것과 관련된 낮은 부위에서 공감 물질의 식별을 용이하게합니다.이 기술의 가장 큰 장점은 콩과 식물 Medicago truncatula의 중성자 폭격 돌연변이에서 결실 돌연변이와 같은 복제 수 변형을 감지하는 데 가장 평판이 좋고 민감하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 저와 유전자 연구소의 호스트 닥터 펠로우인 Hongcheng Wang이 할 것입니다. 단일 식물에서 수집한 어린 잎 조직 1g을 액체 질소로 빠르게 동결합니다.그런 다음 절구와 절굿공이를 사용하여 얼어붙은 잎 조직을 액체 질소 내의 미세한 가루로 갈아냅니다. DNA 분리 키트를 사용하여 미세 분말에서 야생형 및 돌연변이 게놈 DNA 샘플을 추출합니다. 500마이크로리터 원심분리 튜브를 사용하여 각 야생형 및 돌연변이 게놈 DNA를 이중 증류수로 1마이크로그램씩 최종 부피 20마이크로리터로 희석합니다.그런 다음 5마이크로리터의 무작위 프라이머를 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 빠르게 소용돌이치게 하고 빠르게 회전한 후 열순환기에 10분 동안 넣어 DNA 샘플을 섭씨 98도에서 변성시킵니다. 10분 후 써모사이클러에서 튜브를 제거하고 즉시 5분 동안 얼음물에 올려 놓습니다.그런 다음 두 개의 라벨링 믹스를 준비하고 25마이크로리터의 라벨링 믹스를 야생형 및 돌연변이 DNA 튜브에 각각 1개 및 2개로 추가합니다. DNA와 라벨링 혼합물을 세 번 피펫팅한 다음 튜브를 짧게 돌립니다. 회전 후 열순환기의 튜브를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 엑소 클레노우 효소를 비활성화합니다.그런 다음 430마이크로리터의 One X TE Buffer를 넣고 각 튜브의 내용물을 혼합합니다. 다음으로, 튜브를 간단히 돌리고 튜브의 용액을 2밀리리터 수집 튜브가 있는 정제 컬럼으로 옮깁니다. 14, 000 시간 G에 정화 란을 10 분 동안 원심 분리하고 처음부터 끝까지 교류를 버리십시오.각 컬럼에 480마이크로리터의 One X TE Buffer를 추가하고 다시 14, 000회 G로 10분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 버립니다. 컬럼 하단에서 야생형 및 돌연변이 표지된 DNA를 각각 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다.피펫으로 라벨링된 각 DNA의 부피를 측정한 후 One X TE Buffer를 사용하여 최종 부피를 80마이크로리터로 조정한 다음 분광 광도계에서 라벨링된 DNA의 농도를 측정합니다. 다음으로, 동일한 부피의 돌연변이형 DNA와 야생형 DNA를 혼합하여 비교 혼성화를 위해 마이크로 어레이 칩에서 프로브를 혼성화합니다. One X TE Buffer를 사용하여 최종 부피를 160마이크로리터로 가져옵니다.다음으로, 혼성화 용액을 준비하고 3회 피펫팅하여 3개의 제제와 혼합된 DNA를 잘 혼합합니다. 튜브를 잠시 회전시킨 후 섭씨 98도의 온도에서 10분 동안, 섭씨 37도에서 20분 동안 열순환기로 배양합니다. 혼성화 4시간 전에 혼성화 오븐을 예열하기 위해 온도를 섭씨 67도로 설정하는 것을 잊지 마십시오.그런 다음 혼성화 챔버 바닥에 개스킷 슬라이드를 놓고 열순환기에서 섭씨 37도에서 20분 배양 후 490마이크로리터의 혼성화 용액을 그 위에 로드합니다. 혼성화 챔버를 형성하려면 개스킷 슬라이드를 Medicago truncatula 게놈 마이크로 어레이 칩으로 덮은 다음 혼성화 챔버를 덮고 클램프로 단단히 조입니다. 조립된 혼성화 챔버를 섭씨 67도의 혼성화 오븐에서 40-48시간 동안 배양합니다.한편, 실온에서 보관된 Washing Buffer One 250ml로 두 개의 슬라이드 세척 접시를 준비합니다. 그런 다음 섭씨 37도로 유지되는 Washing Buffer Two로 슬라이드 세척 접시 하나를 만드십시오. 그런 다음 70ml의 아세토니트릴이 함유된 슬라이드 세척 용기 하나와 70ml의 안정화 및 드로잉 용액이 들어 있는 다른 슬라이드 세척 용기를 준비합니다.두 슬라이드 세척 용기를 실온의 흄 후드에 넣습니다. 배양 후 혼성화 오븐에서 혼성화 챔버를 제거하고 챔버 클램프를 풀어 덮개를 엽니다. 그런 다음 개스킷 슬라이드의 마이크로 어레이 칩을 제거하고 Wash Buffer One을 사용하여 슬라이드 세척 접시에 놓습니다.커버 슬라이드에서 마이크로 어레이 칩을 분리합니다. 다음으로, Wash Buffer One을 사용하여 마이크로 어레이 칩을 두 번째 슬라이드 세척 접시로 옮깁니다. 교반 막대를 사용하여 실온에서 5분 동안 마그네틱 교반 플레이트에 용액을 부드럽게 저어줍니다.예열된 Washing Buffer Two가 있는 슬라이드 세척 접시에 마이크로 어레이 칩을 놓고 교반 막대로 저어 용액을 섭씨 37도에서 1분 동안 세척합니다. 마이크로 어레이 칩을 제거하고 흄 후드에 슬라이드 세척 용기가 들어 있는 아세토니트릴에 넣어 30초 동안 세척합니다. 마이크로 어레이 칩을 안정화 및 건조 용액이 있는 슬라이드 세척 용기에 옮기고 30초 동안 다시 세척합니다.칩을 조심스럽게 제거하고 흄 후드 내부에서 1분 동안 건조시킵니다. 2마이크로미터 해상도의 스캐너를 사용하여 마이크로 어레이 칩을 스캔합니다. 신호 매핑 소프트웨어는 8개의 염색체에 걸쳐 돌연변이 대 야생형 신호의 정규화된 로그 2개 비율의 분포를 분석하기 위한 인터페이스로 사용되었습니다.추정 삭제의 경우, 로그 2의 비율이 마이너스 2 포인트 5 표준 편차와 같거나 작습니다. 소프트웨어의 세분화 분석은 그래프에 표시된 염색체 4에서 약 22킬로베이스 결실 영역을 보여줍니다. 마이크로 어레이 프로브에 의해 측면에 있는 삭제 경계의 분석은 감소된 평균 정규화된 로그 2 비율을 보여줍니다.이 그래프는 또한 삭제된 영역을 포함하는 son 유전자를 포함하여 6개의 다른 주석이 달린 유전자를 보여줍니다. 아들 유전자는 Metecago truncatula에서 결절을 조절하는 역할을 합니다. 다음으로, 결실 경계를 확인하기 위해 수행된 PCR 증폭은 FN6191 돌연변이체로부터 증폭된 1포인트 5킬로베이스 생성물을 보여주지만, 야생형에서는 그렇지 않습니다.검은색 화살표로 표시된 FN6191 돌연변이의 결실 접합을 보여주기 위해 DNA 염기서열분석을 수행했습니다. 삭제 경계의 위치를 확인하는 염기서열분석도 수행되었습니다. 이 기술을 한 번 마스터하면 제대로 수행하면 72시간 안에 완료할 수 있습니다.고품질 데이터를 얻으려면 절차를 수행하는 방에서 오존 농도를 낮게 유지하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 모든 게놈 염기서열분석의 중합효소 연쇄 반응과 같은 다른 측정을 수행하여 게놈의 크기 및 복제 수 변화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 사건 그리고 검증은 연구원들이 돌연변이체에 유도하는 복제 수 변이와 Garden P.Don't don't work with acetonitrile, stabilization and drying solution과 같은 식물 종의 자연 변이체를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.눈 보호 착용, 요원과의 직접적인 접촉 피하기, 주의 작업 등의 예방 조치는 절대적으로 중요합니다.

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Research

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유전학

이 비디오 아카이브 포르말린 고정 재료를 포함한 다양한 소스에서 격리 수있는 DNA의 단지 25-100 NG를 사용하여 전체 인간 게놈을 검사 전체 게놈 기와 경로 배열 CGH에 대한 하이브 리다이 제이션 프로토콜의 기술 데모입니다.

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우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

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세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

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