어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

이 어레이 기반 비교 게놈 혼성화 프로토콜의 전반적인 목표는 콩과 식물 Medicago truncatula의 고속 중성자 폭격 유도 돌연변이에서 복제 수 변이를 신속하게 식별하는 것입니다. 이 방법은 콩과 식물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 콩과 식물의 결절 발달을 조절하는 것과 관련된 낮은 부위에서 공감 물질의 식별을 용이하게합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 콩과 식물 Medicago truncatula의 중성자 폭격 돌연변이에서 결실 돌연변이와 같은 복제 수 변형을 감지하는 데 가장 평판이 좋고 민감하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 저와 유전자 연구소의 호스트 닥터 펠로우인 Hongcheng Wang이 할 것입니다. 단일 식물에서 수집한 어린 잎 조직 1g을 액체 질소로 빠르게 동결합니다.

그런 다음 절구와 절굿공이를 사용하여 얼어붙은 잎 조직을 액체 질소 내의 미세한 가루로 갈아냅니다. DNA 분리 키트를 사용하여 미세 분말에서 야생형 및 돌연변이 게놈 DNA 샘플을 추출합니다. 500마이크로리터 원심분리 튜브를 사용하여 각 야생형 및 돌연변이 게놈 DNA를 이중 증류수로 1마이크로그램씩 최종 부피 20마이크로리터로 희석합니다.

그런 다음 5마이크로리터의 무작위 프라이머를 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 빠르게 소용돌이치게 하고 빠르게 회전한 후 열순환기에 10분 동안 넣어 DNA 샘플을 섭씨 98도에서 변성시킵니다. 10분 후 써모사이클러에서 튜브를 제거하고 즉시 5분 동안 얼음물에 올려 놓습니다.

그런 다음 두 개의 라벨링 믹스를 준비하고 25마이크로리터의 라벨링 믹스를 야생형 및 돌연변이 DNA 튜브에 각각 1개 및 2개로 추가합니다. DNA와 라벨링 혼합물을 세 번 피펫팅한 다음 튜브를 짧게 돌립니다. 회전 후 열순환기의 튜브를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 엑소 클레노우 효소를 비활성화합니다.

그런 다음 430마이크로리터의 One X TE Buffer를 넣고 각 튜브의 내용물을 혼합합니다. 다음으로, 튜브를 간단히 돌리고 튜브의 용액을 2밀리리터 수집 튜브가 있는 정제 컬럼으로 옮깁니다. 14, 000 시간 G에 정화 란을 10 분 동안 원심 분리하고 처음부터 끝까지 교류를 버리십시오.

각 컬럼에 480마이크로리터의 One X TE Buffer를 추가하고 다시 14, 000회 G로 10분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 버립니다. 컬럼 하단에서 야생형 및 돌연변이 표지된 DNA를 각각 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다.

피펫으로 라벨링된 각 DNA의 부피를 측정한 후 One X TE Buffer를 사용하여 최종 부피를 80마이크로리터로 조정한 다음 분광 광도계에서 라벨링된 DNA의 농도를 측정합니다. 다음으로, 동일한 부피의 돌연변이형 DNA와 야생형 DNA를 혼합하여 비교 혼성화를 위해 마이크로 어레이 칩에서 프로브를 혼성화합니다. One X TE Buffer를 사용하여 최종 부피를 160마이크로리터로 가져옵니다.

다음으로, 혼성화 용액을 준비하고 3회 피펫팅하여 3개의 제제와 혼합된 DNA를 잘 혼합합니다. 튜브를 잠시 회전시킨 후 섭씨 98도의 온도에서 10분 동안, 섭씨 37도에서 20분 동안 열순환기로 배양합니다. 혼성화 4시간 전에 혼성화 오븐을 예열하기 위해 온도를 섭씨 67도로 설정하는 것을 잊지 마십시오.

그런 다음 혼성화 챔버 바닥에 개스킷 슬라이드를 놓고 열순환기에서 섭씨 37도에서 20분 배양 후 490마이크로리터의 혼성화 용액을 그 위에 로드합니다. 혼성화 챔버를 형성하려면 개스킷 슬라이드를 Medicago truncatula 게놈 마이크로 어레이 칩으로 덮은 다음 혼성화 챔버를 덮고 클램프로 단단히 조입니다. 조립된 혼성화 챔버를 섭씨 67도의 혼성화 오븐에서 40-48시간 동안 배양합니다.

한편, 실온에서 보관된 Washing Buffer One 250ml로 두 개의 슬라이드 세척 접시를 준비합니다. 그런 다음 섭씨 37도로 유지되는 Washing Buffer Two로 슬라이드 세척 접시 하나를 만드십시오. 그런 다음 70ml의 아세토니트릴이 함유된 슬라이드 세척 용기 하나와 70ml의 안정화 및 드로잉 용액이 들어 있는 다른 슬라이드 세척 용기를 준비합니다.

두 슬라이드 세척 용기를 실온의 흄 후드에 넣습니다. 배양 후 혼성화 오븐에서 혼성화 챔버를 제거하고 챔버 클램프를 풀어 덮개를 엽니다. 그런 다음 개스킷 슬라이드의 마이크로 어레이 칩을 제거하고 Wash Buffer One을 사용하여 슬라이드 세척 접시에 놓습니다.

커버 슬라이드에서 마이크로 어레이 칩을 분리합니다. 다음으로, Wash Buffer One을 사용하여 마이크로 어레이 칩을 두 번째 슬라이드 세척 접시로 옮깁니다. 교반 막대를 사용하여 실온에서 5분 동안 마그네틱 교반 플레이트에 용액을 부드럽게 저어줍니다.

예열된 Washing Buffer Two가 있는 슬라이드 세척 접시에 마이크로 어레이 칩을 놓고 교반 막대로 저어 용액을 섭씨 37도에서 1분 동안 세척합니다. 마이크로 어레이 칩을 제거하고 흄 후드에 슬라이드 세척 용기가 들어 있는 아세토니트릴에 넣어 30초 동안 세척합니다. 마이크로 어레이 칩을 안정화 및 건조 용액이 있는 슬라이드 세척 용기에 옮기고 30초 동안 다시 세척합니다.

칩을 조심스럽게 제거하고 흄 후드 내부에서 1분 동안 건조시킵니다. 2마이크로미터 해상도의 스캐너를 사용하여 마이크로 어레이 칩을 스캔합니다. 신호 매핑 소프트웨어는 8개의 염색체에 걸쳐 돌연변이 대 야생형 신호의 정규화된 로그 2개 비율의 분포를 분석하기 위한 인터페이스로 사용되었습니다.

추정 삭제의 경우, 로그 2의 비율이 마이너스 2 포인트 5 표준 편차와 같거나 작습니다. 소프트웨어의 세분화 분석은 그래프에 표시된 염색체 4에서 약 22킬로베이스 결실 영역을 보여줍니다. 마이크로 어레이 프로브에 의해 측면에 있는 삭제 경계의 분석은 감소된 평균 정규화된 로그 2 비율을 보여줍니다.

이 그래프는 또한 삭제된 영역을 포함하는 son 유전자를 포함하여 6개의 다른 주석이 달린 유전자를 보여줍니다. 아들 유전자는 Metecago truncatula에서 결절을 조절하는 역할을 합니다. 다음으로, 결실 경계를 확인하기 위해 수행된 PCR 증폭은 FN6191 돌연변이체로부터 증폭된 1포인트 5킬로베이스 생성물을 보여주지만, 야생형에서는 그렇지 않습니다.

검은색 화살표로 표시된 FN6191 돌연변이의 결실 접합을 보여주기 위해 DNA 염기서열분석을 수행했습니다. 삭제 경계의 위치를 확인하는 염기서열분석도 수행되었습니다. 이 기술을 한 번 마스터하면 제대로 수행하면 72시간 안에 완료할 수 있습니다.

고품질 데이터를 얻으려면 절차를 수행하는 방에서 오존 농도를 낮게 유지하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 모든 게놈 염기서열분석의 중합효소 연쇄 반응과 같은 다른 측정을 수행하여 게놈의 크기 및 복제 수 변화와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 사건 그리고 검증은 연구원들이 돌연변이체에 유도하는 복제 수 변이와 Garden P.Don't don't work with acetonitrile, stabilization and drying solution과 같은 식물 종의 자연 변이체를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

눈 보호 착용, 요원과의 직접적인 접촉 피하기, 주의 작업 등의 예방 조치는 절대적으로 중요합니다.