마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

이 절차의 전반적인 목표는 Ribonuclease ridge mouse pancreas에서 높은 무결성을 가진 RNA를 분리하는 것입니다. 이것은 안락사된 쥐의 사체에서 췌장을 신속하게 제거함으로써 이루어집니다. 다음으로, 췌장이 용해 시약에 잠기고 조직이 균질화됩니다.

원심분리 후 표준 프로토콜을 사용하여 RNA를 상층액에서 분리하고 RNA 억제제 용액을 최종 RNA 용액에 첨가합니다. 마지막 단계는 블레이드에 걸린 조직 덩어리를 제거한 다음 일련의 에탄올 및 물 세척을 수행하여 균질화 장치 블레이드를 조심스럽게 청소하는 것입니다. 궁극적으로 이 절차를 통해 RNA 무결성 수가 7 이상인 마우스 췌장에 대한 RNA를 분리하여 일상적인 유전자 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

제 이름은 톰 슈미트(Tom Schmid)이고 저는 20년 넘게 RNA를 연구해 왔는데, 이 모든 시간 동안 쥐의 췌장을 위해 높은 무결성으로 RNA를 분리하는 것만큼 어려운 일을 경험한 적이 없습니다. 우리가 보여줄 기술은 쥐의 췌장을 위해 개발되었지만, 실제로 인간 세포의 조직, 세포주 또는 비장과 같은 갈비뼈 뉴클레아제가 풍부한 조직을 포함한 쥐의 다른 조직을 포함한 다양한 다른 조직에 사용되지 못할 이유가 없습니다. 이 프로토콜의 제안을 사용하면 마우스 췌장에서 높은 무결성을 가진 RNA를 분리할 수 있습니다.

이는 QPCR, 유전자 발현 어레이 또는 RNA-Seq와 같은 많은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 올라 엘가말. 내 연구실의 선임 대학원생은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 안락사시킨 후 이 기술을 시연할 것입니다.

멸균 수술 기구를 사용하여 25게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 4개의 발로 각 동물을 평평한 표면에 뚫어 사체를 고정합니다. 마우스의 중간 부분을 잘라 열고 마우스에서 췌장을 빠르게 제거합니다. 집게를 사용하여 췌장을 잡고 스프링 가위를 사용하여 비장과 소장에서 잘라냅니다.

마우스에서 제거하는 동안 췌장이 늘어나지 않도록 주의하십시오. 조직이 파괴되면 리보뉴클레아제가 방출될 수 있습니다. 췌장 전체를 8ml의 얼음 저온 용해 시약이 들어 있는 50입방센티미터 튜브에 넣습니다.

튜브를 덮고 짧게 흔들어 조직을 시약에 담그고 지체 없이 즉시 다음 단계로 진행합니다. 다음으로, 5초 동안 췌장을 균질화합니다. 효율적인 균질화를 위해 조직이 블레이드로 당겨질 수 있도록 원심분리기 튜브의 바닥에 균질화기 블레이드를 누르는 것이 중요합니다.

소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 용해된 췌장을 포함하는 2mL의 용해 시약을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화되지 않은 조직을 펠릿으로 만들기 위하여 4 섭씨 온도, 12, 5 분 동안 000 시간 G에 고립 분리기 당 homogenate의 2개의 마이크로 분리기 관을 모으십시오. 이는 분해되지 않은 조직이 후속 RNA 용액으로 전달되면 샘플이 리보뉴클레아제로 오염될 가능성이 높기 때문에 중요한 단계입니다.

균질화 블레이드를 10 밀리리터의 70 % 에탄올에 넣어 청소하십시오. 약 20초 동안 균질기를 작동하여 블레이드에 걸렸을 수 있는 조직 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 균질기 블레이드에 남아 있는 조각을 제거합니다.

균질화기 블레이드를 물, 일반 RNA syn 활성제 및 70% 에탄올로 다시 청소합니다. 마지막으로 깨끗한 Kim 물티슈로 균질화 샤프트를 건조시킵니다. 1ml의 SNA를 2mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

균질산염이 포함된 모든 튜브를 젖은 얼음 위에 놓고 다음 단계를 진행합니다. 즉시 RNA 분리를 진행하고 나중에 사용할 수 있도록 복제 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 남은 용해 시약은 적절한 화학 폐기물 용기에 폐기하십시오.

다음 섹션에서는 RNA 정제 키트를 사용합니다. 정제 키트의 장점은 작은 RNA를 포함한 전체 RNA를 분리한다는 것입니다. 균질화 용액에 200마이크로리터의 클로로포름을 첨가하여 분리를 시작합니다.

튜브의 뚜껑을 닫고 15초 동안 손으로 세게 흔듭니다. 그런 다음 튜브를 12, 000 회 G 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리 후 2-3 분 동안 실온에 서있게하십시오. 상부 수성층을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

1.5 부피의 이소프로판올을 넣고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 최대 700마이크로리터의 시료를 2밀리리터 수집 튜브에 있는 스핀 컬럼으로 이동합니다. 뚜껑을 닫고 실온에서 8, 000회 G에서 15초 동안 원심분리기를 한 다음 흐름을 버립니다.

다음으로, 700마이크로리터의 버퍼 RWT를 스핀 컬럼과 원심분리기에 추가합니다. 이전과 마찬가지로 500마이크로리터의 버퍼 RPE를 통한 플로우를 스핀 컬럼에 버리고 다시 원심분리하여 컬럼을 세척합니다. 플로우 스루를 버린 후, 또 다른 500마이크로리터의 버퍼 RPE를 스핀 컬럼 원심분리기에 8, 000회 2분 동안 첨가 G.To 컬럼을 건조시키고, 스핀 컬럼을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 피펫 100마이크로리터의 늑골핵 자유수로 8시에 1분 동안 스핀 컬럼 멤브레인 원심분리기에 직접 이동하고, 000 번 G로 RNA를 용리합니다.

그런 다음 RNA 용액에 1마이크로리터의 RNA 억제제를 추가하고 텍스트 프로토콜 비교에 설명된 대로 모세관 전기영동 분석을 사용하여 RNA 무결성을 측정하십시오. 마우스 췌장에서 분리된 RNA의 RNA 무결성 번호 또는 RIN은 균질화에 사용된 용해 시약의 부피와 RNA 무결성 사이의 직접적인 상관관계를 보여줍니다. 결과는 8ml의 용해 시약을 사용해야 함을 나타냅니다.이 프로토콜에서는 RNA 수용액에 리보뉴클레아제 억제제를 첨가하고 동결 해동 시 RNA 무결성을 비교했습니다. 억제제가 있는 RNA 용액의 RIN은 7.3 플러스 마이너스 0.15인 반면, 억제제가 포함되지 않은 용액의 경우 2.9 플러스 마이너스 0.65로 반복적인 동결 해동이 리보뉴클레아제 억제제를 변성시켜 효과를 잃게 할 가능성을 조사했습니다.

리보뉴클레아제 억제제를 함유하는 RNA 용액을 시험하였다. 최대 5회까지 동결 및 해동된 RNA 용액은 여전히 7 이상의 RIN을 생성했습니다. 6회 이상 동결 및 해동된 용액은 7 random prime 미만의 RIN을 생성했지만 RNA에서 CDNA를 합성하고 3개의 하우스키핑 유전자의 발현을 QPCR로 측정했습니다.

이 데이터는 표준 기술을 사용하여 표준 분자 생물학 기술에서 마우스 췌장 RNA의 성공적인 사용을 입증합니다. 제대로 교육을 받은 대학원생과 박사후 연구원은 약 30분 안에 이 기술을 완료할 수 있습니다. 저희가 이 기술을 어떻게 사용하고 있는지에 대해 조금 말씀드리고 싶습니다.

우리는 췌장암의 형질전환 마우스 모델을 연구하고 있으며 이 기술을 사용하여 RNA를 분리하고 있습니다. 그런 다음 RNA를 얻으면 이 동물에서 마이크로 RNA의 유전자 발현을 연구할 것입니다.