Murine 췌장 아일릿 격리

안녕하세요, 저는 Greg Zott입니다. 저는 Bluestone Laboratory의 UCSF 당뇨병 센터에서 일하고 있으며, 오늘은 쥐 구멍을 분리하는 과정을 보여 드리겠습니다. 이 절차는 C3 H 기증자 마우스의 췌장에 콜라겐 분해 효소 용액을 주입한 다음 췌장을 제거하고, 소화하고, 구멍을 fial gradient에서 정제한 다음, 당뇨병성 NOD 마우스의 신장 캡슐에 최종적으로 이식하기 위해 직접 선택하는 것입니다.

우리가이 절차를 시작하기 전에, 우리는 수정 된 행크스 버퍼에 우리의 ATE 용액을 희석하고 우리는 우리가 C3 H.We를 사용하여 마우스의 변형에 대한 특정 농도를 조정했습니다 우리는 밀 콜라겐 분해 효소 용액 당 0.8 mgs에서 더 나은 소화물을 발견하고, 우리는 췌장을 팽창시키기 위해 일반적인 담관에 주입하기 위해 그것을 사용할 것입니다. 수행. 오늘 절차는 당뇨병 센터의 Pavo codre가 될 것입니다. 그는 주사하고, 마우스를 열고, 장을 노출시킨 다음, 총담관에 주사합니다.

우리는 머리카락을 내리지 않기 위해 마우스에 에탄올을 뿌린 다음 발가락 꼬집기로 마우스가 적절하게 희생되었는지 확인합니다. Pavo는 이제 마우스를 열고 정중선 절개로 장과 췌장을 노출시킵니다. 마우스가 희생될 것임을 확인하기 위해 다이어프램도 절단됩니다.

시작하기 전에 몇 가지 중요한 구조를 지적하고 싶습니다. 위는 바로 여기에 놓여 있으며 췌장은 십이지장 아래와 위에 붙어 있습니다. 이곳은 담낭과 총담관이 있는 간인데, 바로 여기에서 볼 수 있습니다.

그래서 파보가 다음으로 할 일은 소장을 분리해서 총담관이 소장으로 들어가는 곳을 찾는 것입니다. 장이 노출되면 모기 클램프로 총담관의 양쪽을 고정합니다. 우리는 이렇게 하면 더 많은 콜라겐 화합물이 췌장으로 들어갈 수 있는 반면 다른 그룹은 총담관 위에 클램프를 놓으려고 한다는 것을 발견했습니다.

우리는 이것이 효소가 췌장으로 들어갈 수 있도록 하는 더 나은 기술이라는 것을 발견했습니다. 이것은 간단한 절차입니다. 장을 찢고 싶지 않습니다.

클램프가 총담관의 양쪽에 부드럽게 놓이도록 하고 싶습니다. 이제 우리는 담낭을 찾을 것이고, 일단 담낭이 노출되면 이를 총담관에 콜라겐분해효소를 주입하기 위한 지침으로 사용할 것입니다. Powell은 30 게이지 바늘과 3 밀의 콜라겐 분해 효소 용액이 들어있는 5cc 주사기를 사용하고 있습니다.

총담관으로 들어갈 때, 그는 콜라겐분해효소 용액으로 담관을 팽창시킨 다음 장 근처에 도달할 때까지 총담관을 따라 이동합니다. 그리고 그가 내려갈 때, 효소 용액이 췌장으로 주입됩니다. 이제 췌장이 콜라겐분해효소 용액으로 부풀려졌으니, 파월은 지혈제를 제거한 다음 쥐의 췌장을 조심스럽게 장에서 떼어낼 것입니다.

그는 그것을 뱃속에서 꺼낸다. 좋아요, 그런 다음 비장을 손잡이로 사용하여 췌장을 들어 올린 다음 총담관에서 천천히 잘라냅니다. 췌장을 펴고 비장을 제거한 다음 중장 조직을 제거한 다음 췌장을 2밀 콜라겐분해효소 용액과 멸균된 유리 바이알에 넣고 다시 얼음 위에 놓습니다.

유리 바이알에 넣은 분리된 췌장은 이제 약 17분 동안 37도 수조에 넣습니다. 우리는 그것들을 50mil 원뿔형 랙에 넣어 뜨지 않도록 했습니다. 목욕 중에 한 번 타이머가 시작되고 소화가 시작됩니다.

분해 시간이 완료되면 바이알을 제거한 다음 부드럽게 흔들어 파괴합니다. 그리고 조직이 떨어져 나가기 시작하면 바이알을 얼음 위에 놓습니다. 멸균 스크린은 세척 버퍼가 포함된 400mil 비커 위에 배치됩니다.

그런 다음 췌장 소화물을 스크린 위의 세척 버퍼에 조심스럽게 붓습니다. 시연을 위해 후드를 끄고 후드의 유리를 올려 우리가 무엇을 하고 있는지 볼 수 있도록 했습니다. 췌장 소화액이 비커에 부어지면 바이알은 동일한 세척 버퍼와 세척 버퍼로 헹궈집니다.

세척 버퍼로 채워진 주사기가 있습니다. 우리는 그것을 사용하여 스크린을 통해 조직을 강제로 씻을 것입니다. 아이디어는 매트릭스에 부착되지 않은 느슨한 구멍을 분리하지만 멤브레인과 소화되지 않은 조직은 화면에 남겨두

그리고 티슈를 씻고 나면 절차가 끝날 때 일반적으로 볼 수 있는 것입니다. 튜브 바닥에 있는 췌장 조직은 이제 두 개의 50mil 원뿔형 조직으로 옮겨지고 조직을 세척하고 조직을 균일하게 혼합한 다음 균등하게 분배하여 각 튜브에 동일한 펠릿 부피를 갖도록 합니다. 비커는 이제 더 많은 세척 버퍼로 헹굽니다.

측면은 헹굼되어 비커에 들어간 모든 조직을 다시 얻을 수 있습니다. 그런 다음 둘 다 50mil인 각 두 개 사이에 균등하게 분포됩니다. 그런 다음 원뿔형으로 세척 버퍼로 마무리됩니다.

조직을 여러 번 뒤집은 다음 원심 분리기에 넣습니다. 이것은 빠른 스핀입니다. 원심 분리기는 1,000RPM에 도달 한 다음 꺼집니다.

이때 조직은 매우 S이고 구멍은 매우 민감하며 과도하게 압축하고 싶지 않습니다. 튜브가 제거되고 이 세척 단계를 세 번 더 수행합니다. 이것이 세 번째 세척의 끝입니다.

50 mil 원추형 튜브의 구성 요소는 1,000 RP M 동안 15 원추형 튜브와 원심 분리기로 이송 된 다음 정지됩니다. 슈퍼넷이 제거되고 FI 호출의 첫 번째 부분이 시작됩니다. 우리는 펠릿 디 췌장 소화물을 가지고 있는 단계에 있습니다.

우리는 그 조직을 다시 현탁시켜 펠릿에 멋지고 느슨하게 만들 것입니다. 첫 번째 밀도 구배인 1 1 0 8을 추가합니다. 각 튜브에 5mil을 추가합니다.

그런 다음 펠릿을 각 기울기에서 철저히 혼합합니다. 가장 무거운 구배에서 좋은 조직 분포를 얻는 것이 중요합니다. 이제 우리는 1 0 9 6 밀도의 2 mil을 레이어링합니다.

그런 다음 그 위에 1 0 6 9 밀도의 2mil을 층을 이룬 다음 그 위에 1 0 3 7 밀도를 겹쳐 놓습니다. 섞이지 않는 밀도를 겹쳐 놓는 것이 중요합니다. 그런 다음 모든 레이어가 튜브에 추가되었습니다.

보시다시피 이것은 1 1 0 8의 상단, 9 1 0 9 6의 상단, 1 0 6 9의 상단, 1 0 3 7의 상단입니다. 그리고 조직이 중심 융합 없이도 이미 적절한 밀도로 움직이기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 5단계 구배는 15분 동안 1800RPM에서 최대 속도로 올라가며 원심분리기에서 튜브를 제거한 후 브레이크를 끄십시오.

0 0 9 6과 0 0 7 레이어 사이에 멋진 아일릿 티슈 Pablo's가 있는 것을 볼 수 있습니다. 이제 0 3 7 층을 제거하여 처리 중에 방출되었을 수 있는 조직 파편과 DNA를 제거합니다. 그는 이제 멸균 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 섬 층을 제거하고 25mils의 세척 버퍼가 포함된 50mil 원뿔형 용액으로 옮깁니다.

fol은 구멍에 독성이 있으므로 이 단계를 빨리 수행해야 합니다. 실제로 0 6 9 및 0 9 6 레이어 전체를 제거했습니다. Pavo는 플라스틱 목초지 피펫의 상단을 자르고 세척 버퍼로 헹굽니다.

작은 구멍은 이전에 원심 분리기하는 것처럼 원심 분리기입니다. 원심분리기를 1,000RPM까지 끌어올린 다음 중지하고 흡인합니다. 상등액 구멍은 세척 매체로 세 번 세척됩니다.

그래서 우리는 세척 버퍼로 세 번째 세척한 후 다이제스트에서 fol gradient, 정제된 구멍까지 취한 눈꺼풀 분리 과정을 완료하고, RPMI 배지에 구멍을 다시 현탁시키고 조직 배양 플레이트에서 재생했습니다. 이 구멍은 이제 시험관 내 분석 또는 구멍 이식과 같은 생체 내 준비를 할 준비가 되었습니다.