Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 췌장에서 췌도(islets)를 성공적으로 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 주변 조직으로부터 췌장을 분리합니다. 그다음, 담관에 캐뉼라를 삽입하여 췌장에 콜라게나제 프로테아제 혼합액을 주입해 팽창시킵니다.

팽창이 완료되면 췌장을 적출하고 섬세하게 췌도(eyelets)를 분리합니다. 마지막으로, 분리된 췌도를 여과하여 추후 사용을 위해 플레이트에 분주합니다. 결과적으로, 정제된 콜라게나제(collagenase)와 중성 프로테아제(protease)를 이용한 이 췌도 분리법은 췌도의 수득률을 극대화하고 최적의 췌도 형태를 얻기 위해 사용됩니다.

기존의 Islet 분리 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 정제된 효소를 사용하여 배치 간 변동성을 제거했다는 점입니다. 또한, Islet의 형태를 개선하기 위해 일부 프로토콜을 변경하거나 개선했습니다. 안락사 후, 항문부터 횡격막까지 복강을 완전히 절개하기 전 몸통을 70% ethanol로 덮어줍니다.

다음으로 마우스를 해부 현미경의 플랫폼 위에 놓습니다. 맹장과 상행 결장을 끌어내어 체강 왼쪽 바깥으로 배치하고, 간의 엽들을 횡격막 쪽으로 밀어둡니다. 만약 간의 엽들이 그 위치에 고정되지 않는다면, 체강의 절개 부위를 더 넓힙니다.

곡선 포셉으로 십이지장을 잡고 간으로 이어지는 간동맥, 문맥 및 담관 다발의 위치를 확인합니다. 다른 곡선 포셉 한 쌍을 사용하여 동맥, 정맥 및 담관 다발 아래에 봉합사를 삽입하고, 간에 최대한 가깝게 조입니다.

두 쌍의 곡면 핀셋을 사용하여 십이지장을 조심스럽게 잡고 유두에 연결된 담관을 찾습니다. 핀셋의 한쪽 끝을 사용하여 담관 바로 아래이자 유두 근처의 췌장과 결합 조직을 뚫습니다. 빠르게 핀셋을 구멍에 통과시켜 봉합사를 삽입합니다. 90도 핀셋을 사용하여 담관 주위에 봉합사를 느슨하게 묶어 작은 원을 만듭니다.

담관이 팽팽해질 때까지 소장을 당깁니다. 소장을 잡은 상태에서 담관이 유두에서 이탈하지 않도록 주의하며 초미세 가위로 유두를 가로질러 수평으로 한 번 절개합니다. 담관에 캐뉼라를 삽입한 후, 캐뉼라 주변의 봉합사를 부드럽게 당겨 조입니다.

다음으로, 3 mL 주사기에 2.0 mL의 collagenase protease 혼합물을 채웁니다. 이 혼합물을 느리고 일정한 속도로 캐뉼라에 주입합니다. 췌장의 팽창이 완료되면 담관에서 캐뉼라를 제거합니다.

내림결장에서 시작하여, 담관에 도달할 때까지 장을 위로 들어 올리면서 결합 조직을 잘라냅니다. 다음으로, 췌장을 비장 및 주변 조직으로부터 분리합니다. 마지막으로, 봉합사를 자르고 췌장을 적출합니다.

췌장을 적출한 후, 얼음 위에 놓인 5 mL의 HBSS가 들어 있는 50 mL 튜브에 넣습니다. 모든 샘플 수집이 완료되면, 췌장 조직이 들어 있는 50 mL 튜브들을 37 °C 항온수조에 넣습니다. 15분 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 주며 조직이 해리되었는지 확인합니다.

튜브 뚜껑을 잡고 조직이 쉽게 분리되는지 확인하십시오. 조직을 더 분해하기 위해 12회 소용돌이치듯 섞어줍니다. HBSS를 30 milliliters 이하로 첨가하고 원심분리하십시오.

상층액을 조심스럽게 흡입하되, 세포 펠렛이 손상되지 않도록 바닥에 소량의 상층액을 남겨둡니다. 14 gauge 바늘이 장착된 30 milliliter 주사기를 사용하여 HBSS를 10 milliliters 이하로 첨가하고, 현탁액을 두 번 위아래로 흡입하여 섞어줍니다. 세포 혼합물을 플라스틱 T 스트레이너를 통해 50 milliliter 튜브에 여과합니다.

HBSS 10 milliliters로 다시 헹군 후 원심 분리합니다. 상층액을 따라내고 튜브를 뒤집어 흡수성 종이 타월 위에서 1분 동안 배수합니다. 각 튜브를 10 milliliters로 재현탁합니다.

1100로 냉각합니다. 불투명한 오버레이의 경우, 10 mL의 HBSS를 넣고 원심분리합니다. 25 mL 대구경 피펫을 사용하여 상층액 20 mL 전체를 제거하고, 이를 뒤집힌 70 micron 필터에 통과시킵니다.

안구 조직(eyelet)을 페트리 접시에 직접 여과하고, 필터 배양물에 10 milliliters의 안구 조직 배지를 피펫팅하여 헹굽니다. 실험 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터에 안구 조직을 보관합니다. 안구 조직의 수율, 형태 및 품질은 안구 조직 분리의 성공 여부를 판단하는 일반적인 파라미터입니다.

전형적인 아일렛(eyelet)의 형태가 여기에 나타나 있습니다. 아일렛은 비교적 균일한 크기를 가지며 둥글거나 타원형의 모양을 띱니다. 분리된 아일렛을 대상으로 포도당 자극 인슐린 분비 분석을 수행하였습니다.

Sigma Type 11로 준비한 췌도와 ci zyme TM, MABP로 준비한 췌도 간의 인슐린 자극 정도는 유사하게 나타났으며, 이는 췌도 분리 준비의 품질이 높음을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스 담관에 캐뉼라를 삽입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 어떠한 분석법에서도 췌도를 분리하기 위해 zyme collagenase와 neutro proteases를 사용하여 작업하십시오.