Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 췌장에서 구멍을 성공적으로 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 주변 조직으로부터 췌장을 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 췌관이 콜라겐분해효소 프로테아제 혼합물로 팽창될 수 있도록 담관을 캐뉼레이트합니다.

일단 부풀어 오르면 췌장을 제거하고 구멍을 조심스럽게 분리합니다. 마지막으로, 분리된 구멍은 나중에 사용할 수 있도록 여과되고 도금됩니다. 궁극적으로, 정제된 콜라겐 분해효소 및 중성 프로테아제를 사용한 이 작은 구멍 격리 방법은 최대 작은 구멍 수율과 최적의 작은 구멍 형태를 얻는 데 사용됩니다.

기존 아일릿 분리 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정제된 효소를 사용하여 로트 간 변동성을 제거했다는 것입니다. 또한 아일릿 형태를 개선하기 위해 일부 프로토콜을 변경하거나 개선했습니다. 안락사 후에는 항문에서 횡격막까지 복강을 완전히 열기 전에 몸통을 70% 에탄올로 덮습니다.

그런 다음 마우스를 해부 현미경의 플랫폼에 놓습니다. 맹장과 상행 결장을 뽑아 체강 바깥쪽 왼쪽으로 놓고 간의 엽을 횡격막에 대항하여 변위시킵니다. 그들이 스스로 거기에 머물지 않으면 체강의 개방을 증가시키십시오.

구부러진 집게로 십이지장을 잡고 간으로 이어지는 간동맥 문맥과 담관 다발을 찾습니다. 또 다른 한 쌍의 곡선 집게로. 동맥 정맥과 관 다발 아래에 봉합사를 삽입하고 가능한 한 간에 가깝게 조입니다.

두 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 십이지장을 조심스럽게 잡고 연결된 담관을 찾습니다 유두에서 집게의 한 집게를 사용하여 담관 바로 아래와 유두가 작동하는 곳 근처에서 췌장과 결합 조직을 찔러냅니다. 재빨리 구멍을 통해 집게를 놓고 봉합사를 삽입합니다. 느슨하게. 담관 주위에 봉합사를 묶어 90도 집게를 사용하여 작은 원을 만듭니다.

담관이 타우가 될 때까지 소장을 당깁니다. 장을 잡고 있는 동안 유두에서 담관을 빼내지 않고 매우 가는 가위로 유두를 가로질러 한 번 수평으로 자릅니다. 캐뉼라를 담관에 삽입한 다음 캐뉼라 주위의 봉합사를 부드럽게 단단히 당깁니다.

다음으로, 3ml 주사기에 2.0ml의 콜라겐분해효소 프로테아제 혼합물을 채웁니다. 이 혼합물을 느리고 일정한 속도로 캐뉼라에 주입합니다. 췌장의 팽창이 완료되면 담관에서 캐뉼라를 제거합니다.

하행 결장에서 시작하여 담관에 도달할 때까지 장을 위로 당기면서 결합 조직을 잘라냅니다. 다음으로, 췌장을 비장 및 주변 조직과 분리합니다. 마지막으로 봉합사를 잘라내고 췌장을 제거합니다.

췌장을 제거한 후 얼음 위에 5ml의 HBSS가 들어 있는 50ml 튜브에 췌장을 넣습니다. 모든 샘플이 수집되면 췌장 조직이 들어 있는 50ml 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 15분 동안 튜브를 부드럽게 흔들고 조직 해리를 확인합니다.

조직이 쉽게 분리되어 뚜껑으로 튜브를 잡는지 확인하십시오. 조직을 더 해리하기 위해 12번 소용돌이칩니다. HBSS와 원심분리기를 30ml 이하로 첨가하십시오.

상층액을 조심스럽게 흡인하고 세포 팔레트를 방해하지 않도록 바닥에 소량의 상등액을 남겨 둡니다. 14게이지 바늘에 부착된 30ml 주사기를 사용하여 HBSS를 10ml 이하로 추가하고 서스펜션을 위아래로 두 번 흡입합니다. 플라스틱 T 스트레이너를 통해 세포 혼합물을 50ml 튜브로 여과합니다.

다른 10ml, HBSS 및 원심 분리기로 헹굽니다. 상층액을 디캔팅하고 튜브를 뒤집어 흡수성 종이 타월에 1분 동안 물기를 뺍니다. 각 튜브를 10밀리리터에 다시 현탁시킵니다.

추위 1100. 그의 불투명 오버레이, 그의 불투명 10 밀리리터, HBSS 및 원심 분리기. 대구경 25ml 피펫을 사용하여 20ml의 상층액을 모두 제거하고 거꾸로 된 70미크론 필터를 통해 상층액을 통과시킵니다.

구멍을 페트리 접시에 직접 여과하고 필터 배양물을 통해 10ml의 구멍 매체를 피펫팅하여 헹굽니다. 실험 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터의 구멍. 아일릿 수율, 형태 및 품질은 아일릿 분리의 성공 여부를 판단하는 데 사용되는 일반적인 매개변수입니다.

일반적인 구멍 형태가 여기에 나와 있습니다. 구멍은 비교적 균일한 크기의 원형에서 직사각형 모양을 가지고 있습니다. 여기. 포도당 자극 인슐린 분비에 대해 분리된 구멍을 분석했습니다.

인슐린 자극은 ci zyme TM과 비교하여 Sigma Type 11에 의해 제조된 구멍 간에 유사했으며, MABP는 구멍 준비의 품질이 높음을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 담관을 캐뉼레이션하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. zyme collagenase 및 neutro 프로테아제를 사용하여 모든 분석을 위해 눈꺼풀을 분리하십시오.