Name: 고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 학습하세요 차세대 시퀀싱을 활용한 고체 및 액체 종양의 실행 가능한 돌연변이 검출 방법을. 이 기술은 FLT3, IDH2, NPM1 등의 유전자 변이를 식별하여 정밀 의료를 위한 진단 및 예후 정보를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 생산에 원고와 도움이 읽어 다니엘 야생의 도움을 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

<html> 이 논문에서 설명 된 두 NGS 시험은 임상 적으로 제공되는 바와 같이 가장 중요한 실제적인 고려 사항은 품질 관리된다. 특히, 가까운 고려 사항은 품질과 추출 된 DNA의 양에 지불해야합니다. 이것은 종종 변수 DNA 수율이 매우 저하되어 FFPE 샘플에 특히 중요하다. 이소프로판올 침전 법 컬럼 - 기반 방법은 때때로 제한 용출 부피와 DNA 전단 이어질 것으로 나타났다로 FFPE 시료로부터 DNA 수율을 최대화하기 위해 개발되었다. 따라서, 검체가 너무 낮은 농도를 산출하거나 분석 너무 저하되는 대부분의 시간 인한 조직의 크기, 형태 또는 고정이 아닌 추출 처리에 가장 쉽다. 추출 오류가있는 경우 혈액 / 골수 시험편 들어, 인해 샘플 인 hemodilute 통상 (즉, 백혈구 또는 종양이 연신 세포의 충분한 수가 갖지 않는) 절제 또는 항암 치료. . 검증 동안 NT &quot;는&gt; DNA의 질과 양의 수용성에 대한 단절을 확립한다 (100)의 추천 입력 - 250 NG들은 상기 분석에 사용되는 상기 DNA의 품질이 좋은 경우에는 다음 낮은 입력 양이 성공적 일 수있다. (증폭 DNA의 양이 권장 된 입력에 도달 할 것이기 때문에)을 높은 입력 양 시퀀싱 결과의 품질을 향상시킬 수있다 - DNA의 품질이 나쁘면 또한 (NG (250) 즉, 증폭 DNA 양은 적은 100 초과) . DNA의 품질과 수량에 대한 메트릭 라이브러리 준비에 DNA를 진행하기 전에 각 시료에 적용해야합니다. 그 샘플에 &quot;회색 지대&quot;(그림 2 참조)는 연구소 책임자 또는 지정 인의 재량에 따라 실행해야합니다. 현재 가장 DNA가 서열 중에 잘 수행하지 않을 경우 예측하는 방법은 입력 된 DNA의 정량, 품질 평가를 허용하는 qPCR에 기반 분석을 수행하는 것이다.이 방식은 bioavailab을 해결다른 크기의 조각 (예를 들어, 100 bp의 150 bp의 200 bp의 300 bp의)와 비교 수율의 증폭을 통해 표본의 크기가 다른 조각의 ility. 현재 라이브러리 준비는 몇 가지 고비 중 하나에서 실족 라이브러리에 오류가 있거나 품질이 좋지 질 수 있습니다 수동 단계의 큰 숫자를 포함한다. 마이크로 유체 겔 분석은 시퀀싱 전에 라이브러리 준비 문제를 확인하는 유일한 QC 공정이다. 따라서, 여분의 마음 챙김은 성공적인 반응의 확률을 높일 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 올바른 샘플 올리고 뉴클레오티드 풀 각 시험편에 사용되는 보장 필수적이다. 보장과 제대로 각 샘플은 듀얼 인덱스 PCR 프라이머 쌍 중 하나 (96)의 고유 한 조합을 포함 기록은 샘플 믹스 업에 대한 가능성을 줄일 수 있습니다. 또한, 필터 판 (FPU)를 올바르게 배수되도록하는 것이 중요하다; 이 적절하게 배출하지 않을 경우이는 exte을 일으킬 수 있습니다라이브러리 준비 nsion 결찰 단계는 suboptimally 수행하고 품질이 좋지 시퀀싱 데이터로 이어질 수 있습니다. 라이브러리 QC 후에는 LNB1 비드가 완전히 현탁되도록하는 것이 중요하고 LNB1 / LNA1 용액 혼합물의 농도는 라이브러리의 몰 농도를 결정하는 데 사용되는 샘플에 첨가하기 전에 잘 혼합된다. 비드 용출 단계는 비드를 용출 라이브러리의 최적 량 시킨다면 마지막으로 클러스터링 밀도를 감소 할 가능성이 라이브러리는 평균 충분한 커버리지를 획득하지 않는 원인이된다. 반대로, 도서관의 과잉은 품질이 좋지 읽기에 이어질 것입니다. 따라서, 시퀀서 라이브러리 최적 풀링 및 클러스터링을 할 수 있도록 비드 기반 정규화 단계에서 일치하는 것이 중요하다. 라이브러리의 제조뿐만 아니라, 그 원료, 역 다중화 fastq 파일의 정확한 돌연변이 호출을 생성하는 생물 정보학 파이프 라인을 확인하는 것이 중요하다. 선택하나를 통해 선별해야 할 것이다 많은 오픈 소스와 시판 얼 라이너, 변형 발신자 및 NGS 소프트웨어 패키지 있기 때문에 사용자 정의 솔루션은 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 맞춤 알고리즘은 필수적 성능 통계를 추출 대부분 오픈 소스 도구를 회피 고유 반복 돌연변이를 식별하고, 각각의 궤적 위에 카피 수의 상태를 결정하도록 설계 될 필요가있다. 생물 정보학 파이프 라인의 검증 프로세스 동안, 충족 또는 품질 여과 후 따르면 최소 깊이 (예, (250)의 최소 판독) 및 최소 대립 유전자 빈도를 모두 초과 변이체에 대한보고 단절을 결정하는 것이 중요하다 (예를 들어, 4 %). 이 다중화 된 앰플 리콘 기반 분석하기 때문에, 그 최소 범위의 평균 깊이를 결정하는 것이 중요하다 (예를 들면, 1000 배) 라이브러리의 읽기의 최소 깊이까지 최저 수행 앰플 리콘을 얻을 수있게 달성 할 필요가있다. 또한, 분석의 다중 특성은 C를 수행ause 오프 대상 효과와이 &#39;유물&#39;발견 완전히 실행하기 전에 심사해야합니다. 기재된 분석 또 다른 중요한 한계는 유효 최소 대립 유전자 빈도를 얻기 위해서는 10 % 이상의 종양을 포함하는 샘플이 필요하다. 저주파 1 %, FLT3 삽입의 검출은 수동 검토를 여전히이 과정에서 바람직하다고 증거이다. 심지어 5 %의 대립 유전자 주파수 차단과 함께, 몇 가지 중요한 돌연변이는 아마 놓친 때문에 수동 검토는 이러한 변형을 확인하는 것이 필수적 일 것이다. FLT3-ITDs에 들어, 엑손 (14)의 육안 검사가 주목하지 않는 로우 레벨 혹은 큰 삽입 / 복제를 위해 모든 AML 환자에 대해 수행된다. 또한, 일반적으로 프라이머 서열 옆에있는 HER2 엑손 (20) 삽입은 수동 개입이 필요합니다. 강력한 생물 정보학 파이프 라인을 가지고에도 불구하고, 일부 변종은 하드 컷을 갖는 단지 성격 인 간과 갈 수있다대부분의 통계는 위에서 언급 한 오프. 더 나은 생물 정보학은이 문제를 완화하기 위해 필요한 것 같은 것보다 도서관 준비 및 / 또는 시퀀싱 방법, 그것은 더 적은 유물과 오탐 (false positive)를 포함하는 더 낮은 컷오프에서 양질의 데이터가 더 유리하기 때문이다. 탐지 및 대립 유전자 주파수 해석에 의한 종양의 백분율을 결정하고, 게놈의 일부 영역의 증폭 바이어스 곤란하기 어려울 수있다. 이는 이형 (LOH) 이벤트의 손실로 해석되는 케이스 (2)의 관찰뿐만 아니라, 50 % 이상의 대립 유전자 빈도가 돌연변이의 명백한 증가로 이어지는 어느 인해 정상 대립 유전자의 손실을 검출 할 수는 읽는 돌연변이 대립 유전자 (예를 들어,이 돌연변이와 하나의 정상 사본) 또는 다른 메커니즘의 이득. 이러한 메커니즘은 배열 비교 게놈 혼성화 (aCGH 19) 및 / 또는 SNP 유전자형 어레이를 이용하여 설명 될 수있다. (20). 현재 대상 농축 방법은 더 시퀀싱 단일 샘플의 범위와 대상 시퀀싱 읽기 오프 더의 필요성이 발생할 비효율적 인 하이브리드 캡처 또는 다중 PCR 기법 중 하나의 전일 절차에 의존하고 있습니다. 가까운 장래에 기대 NGS 분자 종양학 추가 애플리케이션이 완전히 오토메이션하고 입력 DNA의 매우 낮은 양의 샘플을 처리 할 수있다 쉽게 라이브러리 제조 방법을 포함한다 (즉, 1 NG 미만)과 샘플 높은 분해로 DNA. 이러한 문제를 해결하기 위해, 대부분의 방법은 아마도, PCR 기반이 될 것 중 하나 다단계 PCR 방법 또는 대규모 병렬 싱글 브레이크 PCR 방법을 주도했습니다. 또한, 각각의 증폭 분자 바코드 대폭 배경 시퀀싱 소음의 저감을 도시 한 하부 대립 유전자 빈도를 달성 circulat 캡처를 향해 이동하는 종양 세포의 낮은 비율로 샘플을 테스트 할 수있게종양 세포를 보내고. 암 표본에서 질병 관련 돌연변이의 검출은 수십 년 동안 치료의 표준이되어왔다. 역사적으로, 유전자는 종종 테스트 시퀀스의 끝 선도 돌연변이의 식별로, 한 번에 연속적으로 한 유전자 / 엑손을 시험 하였다. NGS의 출현은 종양과 관련된 다수의 돌연변이의 식별에 이르는 병렬로 많은 암과 관련된 여러 유전자 시퀀싱에 덜 편향된 접근 허용했다. 암 체세포 돌연변이 검출 용 NGS의 임상 적 유용성이 더욱 명백하다. 사실상, 종양 샘플 NGS 기반 분석은 기존의 단일 유전자 테스트 도전 새로운 패러다임을 나타내고 있지만 임상 적 유용성은 매우 명백하다. 임상 실험실 오늘이 강력한 기술의 응용 프로그램과주의 방법 검증 및 시험 해석을 결혼 할 수있는 흥미로운 기회를 가질 수있다.

임상 종양학 표본의 차세대 시퀀싱 (NGS)는 타겟팅 유전 적 변화와 예측 / 예후 분자 마커를 식별의 중요성에 과학 문헌 포인트를 성장으로 더 널리 사용할 수있는 지난 몇 년 동안이되고있다. 다중 유전자 패널 분석과 질병의 진행 및 재발로 두 상피 1, 2, 혈액 3 악성 종양의 전체 엑솜 시퀀싱 연구는 종양 이질성의 개념과 클론 진화를 응고있다. 또한, 이러한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 생거 시퀀싱 같은 경쟁 기술과 달리, NGS 번의 시험 4의 모든 임상 적 암 유전자의 대부분의 게놈 변화를 검출 할 수있다. 처음 두 개의 임상 NGS 패널, 사용자 정의 혈액 학적 패널 (헴-NGS 패널)와 기성 FFPE 표본에 대한 암 패널 (솔리드 NGS 패널)를 출시 맞춤 진단을위한 센터 (참조 <strong&gt; 그림 1). 이 패널은 선택된 유전자의 임상 적 또는 높은 관심 영역을 커버; 모든 유전자 또는 엑손 완전히 덮여 없습니다. 증폭은 확장 및 결찰 다음 프로브 하이브리드 화에 의해 생성됩니다. 대상 지역은 추가 시퀀싱 풀링 할 96 샘플까지 허용, 보편적 인 듀얼 인덱스 프라이머와 PCR을 이용하여 증폭된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> 그림 1 :. 패널에서 해당 유전자의 목록 라이브러리 준비 사용하여 수행하거나 사용자 정의 혈액 학적 패널 (33) 유전자 또는 기성 앰플 리콘 암 패널 (47)의 유전자 (솔리드 NGS)의 (헴-NGS 패널). 유전자 또는 엑손의 모든 일부 증폭가 특정 핫스팟을 커버 할 수있다. 전체에 적용되지는 않습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. &lt;</a>가 /&gt; 헴-NGS 패널에 대한 내용은 여러 소스에서 유래하지만, 이전에 임상 적 유용성 5의 높은 수준을 보여주는 설명 급성 골수성 백혈병 (AML)에 돌연변이 16 유전자를 중심 하였다. 고체 NGS 패널은 상업적으로 (COSMIC) 데이터베이스 (6) 암에 체세포 돌연변이의 카탈로그에보고 된 암에서 일반적으로 돌연변이 유전자에 따라 대상 지역으로 생산된다. 몇 가지 주요 단계는 임상 NGS에 대한 전반적인 워크 플로우를 특징. 임상 테스트를 정렬 한 후, 병리학 종양 비율 및 샘플 볼륨에 대한 분석에 따라 시험편의 적절성을 결정한다. 우리 기관에서는 기술의 배경 시퀀싱 에러 레이트 ( &quot;잡음&quot;)과 목표 접근의 효율성으로 인해 10 % 이상의 종양을 필요로한다. 조직 테스트에 적합한 경우, 게놈 DNA를 추출한다. 이 DNA 후 (복수의 품질 관리를 실시한다QC) 단계. DNA가 QC를 통과 할 경우, 앰플 리콘 라이브러리가 생성 순서가된다. 얻어진 데이터는 사내 정보학 파이프 라인을 통해 분석된다. 생물 정보학 분석에 따라, 변형 수동으로 검토하고 임상 보고서로 통합하기 전에 병원성에 대한 해석했다. 우리가 설명 아래 궁극적으로이 엄격한 워크 플로우를 통해 가서 두 가지 경우 임상 관리의 변화로 이끌어 냈다. 사례 1 - 급성 골수성 백혈병 환자 A로부터 골수 조직 검사는 성숙하지 않고, AML 진단했다. 유전 학적 연구는 골수 시편상에서 전송 및 정상 핵형 여성을 입증 하였다. 이 현재의 95 % 순환 폭발이었다, 그래서 말초 혈액 표본은 헴-NGS 패널의 맞춤 진단 테스트에 보내졌다. 급성 골수성 백혈병 (AML)은 백혈구의 골수 계통의 혈액 악성 종양이다. 검출재발 유전자 돌연변이 기전과 예후 7에서 중요하게 인식과 AML에서 유전자 변이의 예후 및 치료에 점점 더 중요 해지고있다. FLT3 내부 탠덤 중복 (ITDs에이) 덜 유리한 결과 8과 관련이있는 반면 NPM1과 CEBPA 돌연변이는 양호한 예후 위험과 관련이있다. 증거의 성장 몸은 AML 9 이들과 다른 돌연변이에 대한 병원성 역할을 지원합니다. 사례 2 - 폐 선암 환자 B에서 왼쪽 쇄골 대량의 조직 검사는 폐 선암을 보여주었습니다. 50 % 이상 종양 롤 / 컬은, 돌연변이가 대상으로 치료 적 개입의 존재 여부를 확인하기로 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 림프절 질량에서 생검 재료는 게놈 테스트 (솔리드 NGS 패널)을 위해 보내졌다. 폐 cancER은 미국의 암 관련 사망의 주요 원인이며, 두 가지 유형의 비 - 소세포 폐암 (NSCLC) 및 소세포 폐암 (SCLC)로 분할된다. NSCLC는 또한 병변의 조직학에 기초 선암 또는 편평 세포 암종로 정의 될 수있다. 폐 선암종 흡연자와 비 흡연자 모두에서 가장 흔한 폐암 서브 타입이며, 비 흡연자 10 폐암의 가장 흔한 형태이다. 폐 선암의 분자 연구는 여러 종양 유전자 (11)에 돌연변이를 확인했다. 흡연자에서 식별 된 가장 일반적인 드라이버 돌연변이 KRAS 및 BRAF 돌연변이이다. 비 흡연자에서 가장 일반적인 돌연변이 EGFR의 돌연변이와 유전자 ALK, RET와 ROS1을 포함하는 재 배열입니다. 폐 종양 유전자 ERBB2에서의 프레임 삽입 엑손 20 (HER2 / NEU)으로 설명되었다. HE에서 가장 일반적인 이상R2 / NEU는 표적 치료 (: HER2 / NEU에 대한 인간화 단클론 항체 트라 스투 주맙)이 사용할 수있는 유방암에서이 궤적의 증폭이다. 이 관찰되는 HER2 / neu의 엑손 20 삽입 - 폐의 4 %는 12 (각각 네 라티 닙과 temsirolimus) 13 HER2 / neu의과 mTOR의 억제제와 병용 요법에 부분적 반응을 보였다 adenocarcimomas.

<table><tbody><tr><td>게놈 DNA 스크리닝 테이프</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 시약</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 스크린 테이프</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 시약</td><td>애질런트 기술</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>애질런트 기술</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 분석 소프트웨어</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 이상</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 튜브 보관 랙</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml 튜브 랙</td><td>어떤 벤더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트 랙</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 0.5&ndash; 2.5 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 1&ndash; 10 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 2&ndash; 20 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 10&ndash; 100 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 20&ndash; 200 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 단일 채널, 100&ndash; 1,000 &뮤; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청 학적 피펫 터</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 (튜브 및 스트립 튜브 용)</td> <td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉동고, -20 &deg; C</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 또는 구슬 목욕</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 (37 &deg; C)</td> <td>모든 공급</td><td></td><td></td></tr><tr><td>업체 혈청 학적 피펫, 1&nbsp; ml</td><td>모든 공급</td><td></td><td></td></tr><tr><td>업체 혈청학 피펫, 5&nbsp; ml</td><td>모든 공급</td><td></td><td></td></tr><tr><td>업체 혈청학 피펫, 10&nbsp; ml</td><td>모든 공급</td><td></td><td></td></tr><tr><td>업체 혈청학 피펫, 25&nbsp; ml</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도날/스케이프 모든</td><td>공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 증거 에탄올</td><td>가연성 캐비닛에 모든</td><td>공급 업체</td><td></td> 상점</tr><tr><td>2- 프로판올 (이소프로판올)</td> <td>가연성 캐비닛에 모든</td> <td>공급 업체</td><td></td> 상점</tr><tr><td>25 ml 저장소</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 8 채널, 1 &ndash; 10 &mu; l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 8 채널, 10 > 100 & l</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫, 8 채널, 20 &ndash; 300 &mu; l</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 얼음 양동이,</td><td>모든 공급업체,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물, 분출 병</td><td>, 모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>알코올 분출 병,</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>렌즈 청소지</td>, <td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>플레이트, 96-웰 PCR, 반스커트,</td><td>모든 공급업체,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>튜브 스트립, 8-웰, 0.2&nbsp; ml</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 구슬</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ 또는 3000-T 느릅나무</td><td>Bulldog Bio / Q.Instruments</td><td>1808-0506 / 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>캘리퍼</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>캘리퍼</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>캘리퍼스 (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant 소프트웨어</td><td>캘리퍼스(Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 씰링 필름</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 씰 호일</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리, 순수 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>15 ml 튜브 및 플레이트 로테이터를 모두 사용할 수 있으며, 최대 2,500 x g까지 올라갈 수 있는 원심분리기를 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 튜브, DNA LoBind 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>모든 plate rotator 원심분리기 작동</td></tr><tr><td>Hybex Microsample Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0.2 ml 튜브 블록</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 앰플리콘 &ndash; 암 패널</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 반응</td></tr><tr><td>TruSeq 맞춤형 앰플리콘</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 반응</td></tr><tr><td>TruSeq 맞춤형 앰플리콘 인덱스 키트</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 인덱스, 384 샘플</td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v3, 500 사이클</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2, 300 사이클</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2, 500 사이클</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 이상</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 이상</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Viewer</td><td>Illumina</td><td>1.8 이상</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 인덱스 플레이트 고정 장치 및 칼라 키트</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 맞춤형 앰플리콘 필터 플레이트</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>인덱스 어댑터 교체 캡</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml 튜브</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 광범위 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 마그네틱 스탠드, 사이드 스커트</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (금/은 블록)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 혈액 키트</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>탈파라핀화 용액(16ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 ATL(4 x 50ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>단백질 침전 용액 (50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA 수분 공급 용액 (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 용액 (500&nbsp; &뮤; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181; l 멸균 랙의 길쭉한 필터 피펫 팁, 10 개의 팁 (966 팁)의 960 랙.</td><td>USA 사이언티픽</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181; l 멸균 랙의 천연 비스듬한 필터 피펫 팁, 96 팁 (960 팁)의 10 랙</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l 랙, 멸균 랙, 96 팁 (960 팁)의 10 랙에 자연, 비스듬한 필터 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu; l 랙, 멸균 랙, 96 팁 (960 팁)의 10 랙에 자연, 비스듬한 필터 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1,000 &mu; l 자연, 눈금이 매겨진 XL 여과기 피펫</td>은 <td>미국 과학적인</td><td>1182-1830</td><td></td>년에 있는 기울어집니다</tr></tbody></table>

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

암의 시작과 진행에 필요한 드라이버 돌연변이에 대한 이해가 향상됨에 따라 종양의 특정 분자 프로필이 치료제에 대한 반응을 예측하거나 예후에 대한 지식을 제공할 수 있는 방법에 대한 중요한 정보를 얻습니다. 본 기관에서는 일상적인 임상 치료의 일환으로 종양 유전형 분석 프로그램을 수립했으며, 두 가지 차세대 염기서열분석(NGS) 패널, 즉 말초 혈액 및 골수에 사용하기 위한 맞춤형 33개 유전자 혈액 악성 종양 패널과 암에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 47개의 유전자를 표적으로 하는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에 사용하기 위해 상업적으로 생산된 고형 종양 패널을 사용하여 광범위한 돌연변이에 대해 혈액 및 고형 종양을 스크리닝합니다. 당사의 워크플로우에는 분석에 적합한 양의 종양이 있는지 확인하기 위한 생검에 대한 병리학자의 검토가 포함되며, 검체에 대해 맞춤형 DNA 추출이 수행됩니다. 검체의 품질 관리에는 수량, 품질 및 무결성에 대한 단계가 포함되며 추출된 DNA가 이러한 지표를 통과한 후에만 앰플리콘 라이브러리가 생성되고 염기서열 분석됩니다. 결과 데이터는 사내 생물정보학 파이프라인을 통해 분석되고 변이체는 병원성에 대해 검토 및 해석됩니다. 여기에서는 잘 설계된 NGS 워크플로우가 임상 결과 최적화에 어떻게 기여할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하기 위해 두 가지 임상 사례를 사용하여 각 패널의 유용성에 대한 스냅샷을 제공합니다.

사례 1 - 헴-NGS 패널 백혈병 말초 혈액에서 추출한 DNA는 헴-NGS 패널에 대한 충분한 품질과 수량 (176 NG / μL)이었다. 범위의 전체 평균 깊이 (1000 배의 범위의 최소 평균 깊이 위) 4,933x이었다. 추가 실행 통계를 표 3에있다. 250x 범위 아래 팔 영역 3 의한 프라이머의 부적절한 트리밍 (즉, 프라이머 서열이 제대로 인해 순서 오류로 제거되지 않은) 1 분석 알려진 아티팩트 하였다이었다 다른 4없이보고 변형에 다른 유전자의 엑손 부분 영역이었다. 임상 프로토콜은 적어도 250 읽 적용 변종을보고 포함하지만, 적어도 100 모든 데이터는 검토를 위해 데이터베이스로 가져 읽습니다. 데이터 처리부 (F)롬 생물 정보학 파이프 라인은 세보고, 질병 관련 돌연변이를 검출; FLT3의 과오 돌연변이, IDH2의 과오 돌연변이와 NPM1의 틀 이동 돌연변이. 그들의 대립 유전자 주파수와 엑손 변형은 표 4에 설명되어 있습니다. FLT3에서 일반적인 돌연변이가 자동으로 우리의 파이프 라인에 의해 호출과 엑손 (14)의 엑손 (14) 육안 검사의 육안 검사를 필요로하지 않는 FLT3 - 내부 탠덤 중복 (ITD)입니다 FLT3의 제출 된 시료에는 삽입 또는 중복을 보이지 않았다. FLT3 I836del 1 % 대립 유전자의 빈도에 있었다과 5 %의 검증 최소 대립 유전자 주파수를 하회하기 때문에 최종 보고서에 포함되지 않았습니다. 이 돌연변이는 FLT3의 D835Y 변화와 같은 DNA 분자에 있지 않은 (즉, 동일한 앰플 리콘 영역에서 관찰 아니라 &quot;CIS&quot;서열 중 판독에서의)하고 만 .bam 인터넷의 수동 검토으로 관찰레는 p.D835Y 변화를 확인할 때. 두 FLT3 돌연변이의 낮은 대립 유전자 주파수는 이러한 돌연변이가 이질성 및 / 또는 클론 진화를 나타낼 수 제안; 그러나, 차이점은 앰플 리콘 또는 근처에서 단일 염기 다형성 (SNP) 또는 이러한 대립 유전자의 증폭에 영향을 프라이머 서열을위한 중첩 분석 성능에 기인 될 수있다. FLT3, IDH2 및 NPM1의 AML 확인 된 돌연변이 사례 1 헴-NGS 패널 결과, FLT3에서 AML. 돌연변이 세 일반적으로 돌연변이 유전자는 AML (COSMIC 데이터베이스 17)와 성인 환자의 ~ 25 %에서 관찰과 하나되어 있습니다 티로신 키나아제 도메인에서의 내부 직렬 중복 (ITD) 또는 과오 돌연변이. FLT3-ITDs에는 일반적인 돌연변이이며, 표준 화학 요법에 가난한 응답과 관련된 동안 FLT3 키나제 (D)의 예후 중요성omain 점 돌연변이,이 AML 환자에서 볼 수 있듯이, 예후 (14)에 분명 영향을 미친다. 이소 시트 레이트 탈수소 효소 2 (NADP +), 미토콘드리아 (IDH2)는 일반적으로 AML에 돌연변이 된 후생 유전 학적 수정을 코딩하는 유전자이다. 후생 유전 학적 수정의 돌연변이는 유전자 조절 곤란으로 이어질 유전자의이 클래스의 다른 변이를 나타내는 IDH1 및 DNMT3A 돌연변이와 AML에서 비교적 일반적이다. nucleophosmin (NPM1) 유전자에서의 돌연변이는 AML에서 가장 흔한 돌연변이 획득 하나, 일반적으로 (a FLT3의 부재 - ITD) 좋은 예후 인자 인 것으로 간주된다. NPM1 및 IDH2 공동 돌연변이는 89 %의 3 년 생존율과 함께 양호한 예후 표시기 5로 문헌에 기재되어있다. 전체적인 3 년 생존율과 비교했을 때 상당한 생존​​ 이점을 나타낸다야생형 NPM1 31 %의 IDH2. 예를 들어, 표준의 치료 방법은 NPM 1 돌연변이 분석 및 FLT3-ITD 변이를 포함한다. 이차 돌연변이가 유리한 수있는 바와 같이,이 시나리오에서는 오직 NPM1 돌연변이의 검출 위험 적절 계층화 환자에게 실패 (예 IDH2) (예 TET2) 또는 불리한, 골수 이식을 경감을위한 신뢰를 감소시킨다. 사례 2 - 솔리드 NGS 패널 FFPE 조직에서 추출한 DNA는 252 NG / μL의 농도와 1,000 염기쌍 (bp의) 아래의 DNA의 4 %로, 고체 NGS 패널에 대한 충분한 질과 양이었다. 데이터 분석 후 범위의 평균 깊이는 9167 250 읽기 깊이 아래에없는 지역으로 (물론 1000 우리의 최소 깊이 차단 읽고 위) 읽습니다. 추가 QC 측정은 웃음입니다표 3 WN. ERBB2 (HER2 / NEU)의 엑손 (20)에서의 프레임 삽입 및 TP53의 과오 돌연변이 : 생물 정보학 파이프 라인을 통해 처리 된 데이터는 두 질병 관련 돌연변이를 발견했습니다. 그들의 대립 유전자 주파수와 모든 엑손 변형은 표 5에 표시됩니다. 명명법에 반영된 ERBB2에 삽입 실제로 중복 탠덤 (HER2 / NEU) 순서를 나타냅니다. 식별 및 시퀀싱의에 프레임 삽입이 필요 수동 검토의 확인은 IGV를 읽습니다. TP53 및 HER2 모두 바와 같이 50 % 초과의 주파수 변이의 검출 / NEU 돌연변이 이형 (LOH) 이벤트 (논의를 참조)의 손실을 암시한다. 폐 선암 검출 돌연변이 사례 2의 솔리드 NGS 패널 결과 전N ERBB2 (HER2 / NEU) 및 TP53, 두 유전자는 일반적. HER2가 / NEU 폐암, EGFR 다른 통상적 돌연변이 유전자 유사 티로신 키나제 수용체를 코딩 폐암 환자의 현재 표준 진료의 일부로서 테스트되지 . 20 삽입 2에서 관찰되는 HER2 / NEU 엑손 활성화 - 폐 선암의 4 %, 폐암에서 관찰 HER2 / NEU 돌연변이의 대부분을 설명하고, 일반적으로 EGFR 및 ALK (12)와 같은 다른 드라이버 유전자 변이없이 종양에서 볼 수 있습니다 . HER2 / NEU과는 mTOR 억제제 (13)와 화학 요법 (15)과 함께 단일 클론 항체 트라 스투 주 마브으로 중요한 질병 관리와 병용 요법에 부분 반응을 포함 HER2 / NEU 삽입을 활성화 환자를위한 다양한 치료 옵션에 대한 증거를 보여주는 가능성의 몇 줄이 있습니다. TP53 변화를 발견하는 낯선되지 않습니다암 MMON하지만,이 시간에 더 실행 가능한 치료법이 없습니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 사례 1 </td><td> 사례 2 </td></tr><tr><td> 총 시작 읽고 </td><td> 2215926 </td><td> 2129110 </td></tr><tr><td> 의 비율 매핑을 읽 </td><td> 98.42 % </td><td> 98.29 % </td></tr><tr><td> 의 비율은 대상에 읽어 </td><td> 99.01 % </td><td> 97.29 % </td></tr><tr><td> 의 비율은 필터 후 대상에 읽어 </td><td> 97.60 % </td><td> 95.45 % </td></tr><tr><td> 사용 가능한 비율 읽고 </td><td> 94.87 % </td><td> 91.79 % </td></tr><tr><td> 250x의 범위 상기베이스의 백분율 </td><td> 98.40 % </td><td> 100 % </td></tr><tr><td> 베이스 (a)의 비율보브 1000X 범위 </td><td> 95.90 % </td><td> 99.70 % </td></tr><tr><td> 250x 아래 범위 - 앰플 리콘 번호 </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 표 3. 시퀀싱 실행 QC 메트릭이 라이브러리 준비 QC 샘플이 경과되었는지를 결정하기 위해 데이터를 검토에 사용되는 평균 범위를 포함하는 가장 중요한 실행 통계에 대한 요약이 아니다. 모든 백분율이 90 % 이상일 경우, 전체 프로세스는 성공적이지만, FPU 세정 단계 또는 프라이머 누화에서 SW1의 이월 또는 UB1 80의 범위에서 &#39;대상 비율&#39;하부를 갖도록하여, 수 - 90 %. &#39;비율 매핑&#39;이 너무 낮 으면 모든 샘플은 인간에 정렬해야합니다으로, 즉, 세균이나 다른 DNA의 오염을 나타냅니다. 이러한 사양의 80 % 이하가되면, 샘플 방법 페이지를 결정하는 데 도움이 추가 검토 네요roceed 프로세스를 향상시킬 수 있습니다. <img alt="표 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> 표 4 :.. 사례 1 결과 검출 된 병원성, 관련 질환, 알 수없는 의미의 변형 (VUS), 그리고 나와 5 % 대립 유전자 주파수의보고 기준 이상 가능성 양성 엑손 변형 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> 표 5 :.. 사례 2 결과 검출 관련된 병원성, 질병, 알 수없는 의미의 변형 (VUS), 그리고 나와 5 % 대립 유전자 주파수의보고 기준 이상 가능성 양성 엑손 변형 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오</a>. 보충 그림 1 : 앰플 리콘 기반 SampleSheet.csv의 예. 이 시트는, 어떤 워크 플로우 (예를 들어, GenerateFastq), 어떤 응용 프로그램 및 분석 (예를 들어, FastqOnly), 얼마나 많은 순서 염기 (또는 읽기) (이 경우 186 bp의에서 (이 경우의 증폭에) 실행하는 데 어떤 화학 시퀀서에 전달 X 186 B​​P), 및 샘플)이 경우 이중 색인에 (특정 인덱스와 관련된 마지막으로 무엇. 노란색으로 강조하는 부분은 실험이 원하는대로 변경,하지만 실험실이 매개 변수를 사용하여이 경우에. 할 수 있습니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

이 차세대 염기서열 분석 기반 표적 앰플리콘 분석(Amplicon Assay)의 전반적인 목표는 진단, 예후 및 표적 치료 반응을 포함하여 치료 목적으로 환자 종양 내의 병원성 변이를 검출하는 것입니다. 이 방법은 환자가 표적 치료 또는 대체 치료의 혜택을 받을 수 있는 유전자에 변이를 가지고 있는지와 같은 핵심 질문에 답을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 분석을 통해 모든 종양 조직에서 여러 유전자에 걸친 일반적이고 희귀한 실행 가능한 변이(actionable mutations)를 모두 검출할 수 있다는 점입니다.기술과 공법이 매우 복잡하고 단계별 학습 과정이 어렵기 때문에, 본 방법을 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다. 이는 종양내과학의 발전에 있어 결정적인 순간입니다. 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing)이 임상에 도입됨에 따라, 환자들에게 더 많고 개선된 암 치료법을 제공할 수 있게 될 것입니다.저희 CPD 기술진인 Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy, Joe Grubb가 이 절차를 시연하겠습니다. 또한 분석의 더 복잡한 부분들을 보여드리기 위해 제가 이 과정을 돕겠습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 텍스트 프로토콜대로 게놈 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA 2 µL를 형광 광도계로 측정하여 샘플의 작동 농도를 구하십시오.앰플리콘 라이브러리를 구축하려면, Hyb Plate라고 불리는 세미 스커트형 96-웰 플레이트에 필요한 부피의 low EDTA TE와 해당 패널의 Oligo Tube 5 µL를 넣고, 각 대응하는 웰에 100~250 ng의 genomic DNA를 추가합니다. 여기서 발생하는 어떠한 혼동도 심각한 결과를 초래하므로, 이 과정은 전체 단계 중 가장 중요한 단계입니다. Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1을 추가하고 텍스트 프로토콜에 따라 원심분리한 후, Hyb Plate를 95 °C로 예열된 하이브리다이제이션 인큐베이터에서 1분 동안 배양합니다.인큐베이터를 40 °C까지 천천히 냉각시킨 후, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 Hyb Plate의 각 샘플 전체 부피를 이전에 준비하여 세척해 둔 해당 필터 플레이트 유닛(FPU)의 중앙으로 옮깁니다. FPU의 덮개를 닫고, 2,250 ×g, 20 °C에서 3분간 원심분리합니다. 그 다음, 45 µL의 SW1을 첨가하고 다시 원심분리합니다.SW1로 두 번째 세척을 하고 UB1로 세척한 후, 각 샘플 웰에 Extension Ligation Mix 3를 45 µL씩 첨가하고 피펫팅을 세 번 반복하여 혼합합니다. 접착식 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉하고, 예열된 37 °C 인큐베이터에서 FPU 어셈블리 전체를 45분 동안 배양합니다. PCR 증폭을 인덱싱하려면 Index Amplification Plate(또는 IAP Fixture)에 프라이머를 배치하고, 사용 중인 인덱스를 플레이트의 해당 웰에 분주한 다음, PCR Master Mix 2E12를 22 µL 첨가하고 피펫팅을 세 번 반복합니다.텍스트 프로토콜에 따라 45분간의 연장 결찰 반응(Extension Ligation Reaction) 후 원심분리를 수행한 다음, FPU의 각 샘플 웰에 50 millimolar 수산화나트륨 25 microliters를 첨가하고, 피펫 팁이 멤브레인에 닿도록 최소 6회 이상 파이펫팅합니다. 그런 다음 플레이트를 약간 기울인 상태에서 20 microliters로 설정된 멀티채널 피펫을 사용하여 FPU 플레이트 내의 수산화나트륨을 최소 6회 이상 파이펫팅합니다. FPU의 용출액을 IAP의 해당 컬럼으로 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 설명된 PCR 프로그램을 실행하기 전, DNA와 PCR Master Mix가 충분히 혼합되도록 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다. 라이브러리 수율을 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 Magnetic Purification Beads와 함께 배양한 후, 세척된 비즈가 들어 있는 각 웰에 EBT 30 µL를 첨가합니다. 비즈가 튜브 벽면에서 떨어질 수 있도록 피펫으로 몇 번 섞어줍니다.플레이트를 흔들어 배양한 후 다시 흔들지 않고 배양했다면, 플레이트를 자석 스탠드에 놓고 상층액 20 µL를 라이브러리 정규화 플레이트(Library Normalization Plate, LNP)라고 불리는 완전히 새로운 플레이트로 옮깁니다. 정규화 믹스를 준비한 후, 용액을 간헐적으로 반전시키고 볼텍싱하여 LNP의 각 샘플에 45 µL씩 첨가합니다. 그런 다음 투명 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 1,800 RPM에서 30분 동안 흔들어 섞습니다.비드를 세척한 후, 마그네틱 스탠드에서 LNP를 제거하고 샘플을 용출시키기 위해 각 웰에 0.1 normal 수산화나트륨 30 µL를 첨가합니다. 그런 다음, LNP를 1,800 RPM에서 5분 동안 흔들어 섞습니다. LNP를 다시 마그네틱 스탠드에 놓고, 상층액이 투명해지면 용출액 30 µL를 보관 플레이트에 미리 준비한 Library Normalization Storage Buffer 1로 옮깁니다.플레이트를 기울인 다음, 시퀀싱할 각 샘플 5 µL를 라벨이 부착된 풀드 앰플리콘 라이브러리(Pooled Amplicon Library, PAL) 1.5 mL 튜브에 추가합니다. 사용하는 시퀀싱 화학법에 따라 PAL 4~10 µL를 Buffer HT1 590~596 µL에 추가합니다. 플로우 셀(Flow Cell)을 세척하고 로드합니다.시약을 로드하십시오. 그런 다음 화면의 안내에 따라 시퀀싱 런을 시작하십시오. 시퀀싱 런이 완료되면 생물정보학 파이프라인(Bioinformatics Pipeline)을 실행하십시오.시퀀싱된 라이브러리가 실험실에서 결정한 품질 관리 지표를 통과했는지 확인하기 위해 런 통계를 분석하십시오. 마지막으로, Genomic Data Viewer에서 BAM 파일을 확인하여 각 변이를 수동으로 검토하십시오. 이는 라이브러리 준비 샘플의 QC 통과 여부를 결정하는 데 사용되는 평균 커버리지를 제외한 가장 중요한 런 통계의 요약입니다. Case One의 예시와 같이, Bioinformatics 분석을 통해 보고 가능한 AML 관련 돌연변이 4개가 검출되었습니다.FLT3의 미스센스 돌연변이, IDH2의 미스센스 돌연변이, 그리고 NPM1의 프레임시프트 돌연변이가 확인되었습니다. FLT3 돌연변이는 성인 AML 환자의 약 25%에서 관찰됩니다. 본 AML 환자에게서 나타난 것과 같은 FLT3 키나아제 도메인 점 돌연변이의 예후적 유의성은 예후에 미치는 영향이 불분명합니다.Isocitrate Dehydrogenase 2(IDH2)는 AML에서 흔히 돌연변이가 발생하는 후성유전학적 조절인자를 인코딩합니다. Nucleophosmin(NPM1) 유전자의 돌연변이는 AML에서 가장 흔하게 획득되는 돌연변이 중 하나입니다. 이 표는 사례 2의 모든 엑손 변이체를 나열합니다.두 가지의 질병 관련 돌연변이가 검출되었습니다. ERBB2의 Exon 20에서 인프레임 삽입(in-frame insertion)과 TP53에서의 미스센스 돌연변이(missense mutation)가 확인되었습니다. HER2/neu 또는 ERBB2는 Tyrosine Kinase Receptor를 인코딩합니다.활성화 HER2/neu Exon 20 삽입은 폐선암의 2~4%에서 관찰되며, 폐암에서 발견되는 HER2/neu 변이의 대부분을 차지합니다. TP53 변이 또한 암에서 흔하게 나타납니다. 따라서 추출된 DNA의 품질과 양에 세심한 주의를 기울이는 것이 필수적입니다.이는 FFPE 샘플의 경우 특히 중요합니다. 이러한 샘플은 DNA 수율이 가변적이며 심하게 분해된 경우가 많기 때문입니다. 임상 분석의 검증 과정에서, DNA를 라이브러리 제작 단계로 넘기기 전에 각 샘플에 대한 DNA 품질 및 양의 지표가 설정되어야 합니다.라이브러리 준비 외에도, 시퀀싱 런의 컷오프 값, 품질 관리 통계, 라이브러리 준비 통계, 앰플리콘의 커버리지 깊이 및 최소 보고 가능 대립유전자 빈도를 결정함으로써 생물정보학적 스파이 플랜(Bioinfomatic Spy Plan)을 검증하는 것이 매우 중요합니다. 숙련되면 라이브러리 준비는 하루 만에 완료할 수 있습니다. 하지만 전체 분석 워크플로우에는 DNA 추출, 시퀀싱, 데이터 처리 및 변이 검토를 위한 더 많은 시간이 소요됩니다.본 절차는 특정 주요 핫스팟의 게놈 DNA 변이만을 확인하도록 설계되었습니다. 유전자의 차등 발현, 종양 위험 관련성 및 구조적 재배열과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 RNA를 사용하는 다른 분석법을 수행할 수 있습니다. 주요한 발전이 곧 이루어질 전망입니다.자동화의 도입과 고유한 분자 바코딩의 결합을 통해 실험실은 처리 시간을 단축하고, 샘플 투입량을 줄이며, 매우 낮은 대립유전자 빈도에서도 변이를 검출할 수 있게 될 것입니다. 암 표본에서 질병 관련 돌연변이를 검출하는 것은 수십 년 동안 표준 치료법으로 자리 잡았습니다. NGS는 여러 암과 관련된 다수의 유전자를 병렬로 시퀀싱하는 덜 편향된 접근 방식으로, 이를 통해 다중 돌연변이를 식별하고 환자에게 더 나은 치료법을 제공할 수 있습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

next-generation-sequencing-for-detection-actionable-mutations-solid

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

순환 혈액에서 ribonucleic 산 (cRNA)의 임상 진단에 unmet 필요 이다. 여기 우리가 과민 하 고 특정 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 비 작은 세포 폐 암 환자에서 cRNA를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 테스트 72 시간 이내 퓨전 변종 감지 하 디자인 요구 사항을 충족.

혈액 기반 ROS1의 검출을 위한 테스트 및 RET Ribonucleic 산 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 순환에서 퓨전 성적표

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 치료 관리를 위해 검사해야 하는 분자 바이오마커가 증가함에 따라 빠르고 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법의 개발이 촉진되었습니다. 초고속 차세대 염기서열분석(NGS) 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자에 대한 게놈 변형 평가를 위한 워크플로우를 설명합니다.

비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

이 프로토콜은 비소세포폐암(NSCLC) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 표적 가능한 게놈 변경을 검출하기 위한 자동화된 ISO15189 인증 차세대 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

차세대 시퀀싱을 사용한 비소세포폐암의 표적 변화 검출

학습하세요 차세대 시퀀싱을 활용한 고체 및 액체 종양의 실행 가능한 돌연변이 검출 방법을. 이 기술은 FLT3, IDH2, NPM1 등의 유전자 변이를 식별하여 정밀 의료를 위한 진단 및 예후 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

더 많은 동영상 탐색