고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

이 차세대 염기서열분석 표적 앰플리콘 분석의 전반적인 목표는 진단, 예후 및 표적 치료에 대한 반응을 포함한 치료 용도로 환자 종양에서 병원성 돌연변이를 검출하는 것입니다. 이 방법은 환자가 표적 또는 대체 요법의 혜택을 받을 수 있는 유전자에 돌연변이가 있는지 여부와 같은 주요 질문에 답합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 분석을 사용하여 모든 종양 조직에서 많은 유전자에 걸쳐 흔하거나 드문 활성 돌연변이를 검출할 수 있다는 것입니다.

기법과 기술이 매우 복잡하고 단계를 배우기가 매우 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이것은 종양학의 발전에 있어 결정적인 순간입니다. 차세대 염기서열분석이 임상에 도입됨에 따라 우리는 환자들을 위한 더 많고 더 나은 암 치료를 갖게 될 것입니다.

CPD 기술자인 Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy 및 Joe Grubb가 이 절차를 시연합니다. 또한 분석의 더 복잡한 부분을 보여주기 위해 이 과정을 도울 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 추출한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 추출된 DNA를 2마이크로리터의 형광계에서 실행하여 샘플의 작업 농도를 얻습니다.

Amplicon 라이브러리를 만들려면 Hyb Plate라고 하는 semi-skirted 96-well plate에 필요한 부피의 낮은 EDTA TE와 패널의 Oligo Tube의 5개의 mircoliter를 추가하고 각 해당 well에 100-250 nanogram의 게놈 DNA를 추가합니다. 이것은 가장 중요한 단일 단계이며, 여기에서 혼동되면 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 염기서열분석 시약 1을 위한 Oligo Hybridization을 추가하고 텍스트 프로토콜에 따라 방사한 후 섭씨 95도의 예열된 혼성화 인큐베이터에서 Hyb Plate를 1분 동안 배양합니다.

인큐베이터를 섭씨 40도까지 서서히 냉각한 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 샘플의 전체 부피를 옮깁니다.ampHyb 플레이트에서 이전에 준비된 해당 사전 세척 필터 플레이트 장치 또는 FPU의 중앙으로 이동합니다. FPU를 덮고 2, 250회 G 및 20°C에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 45마이크로리터의 SW1을 넣고 다시 원심분리합니다.

SW1로 두 번째 세척하고 UB1으로 세척한 후 각 샘플 웰에 45마이크로리터의 Extension Ligation Mix 3을 추가하고 위아래로 세 번 파이프를 연결하여 혼합합니다. 접착 알루미늄 호일을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 전체 FPU 어셈블리를 예열된 섭씨 37도의 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. PCR 증폭을 색인화하려면 인덱스 증폭 플레이트 또는 IAP 고정 장치에 프라이머를 배치하고 플레이트의 해당 웰에 사용되는 인덱스를 분취 한 다음 PCR 마스터 믹스 2E12 22 마이크로 리터를 추가하고 위아래로 3 회 파이프합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 45분 확장 결찰 반응을 회전시킨 후 FPU의 각 샘플 웰에 25마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨을 추가하고 최소 6회 위아래로 파이프를 연결하여 피펫 팁이 멤브레인과 접촉하도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 약간 기울이고 다중 채널 피펫을 20마이크로리터로 설정한 상태에서 FPU 플레이트의 수산화나트륨을 위아래로 최소 6회 피펫팅합니다. FPU에서 IAP의 해당 열로 용리를 전송합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 PCR 프로그램을 실행하기 전에 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 DNA를 PCR Master Mix와 완전히 결합하십시오. 라이브러리 수율을 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 Magnetic Purification Beads로 샘플을 배양한 후 세척된 비드의 각 웰에 30마이크로리터의 EBT를 추가합니다. 비드가 튜브 측면에서 떨어지도록 위아래로 몇 번 피펫팅합니다.

플레이트가 흔들리지 않고 배양되면 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 20마이크로리터의 상층액을 라이브러리 정규화 플레이트(Library Normalization Plate, LNP)라고 하는 완전히 새로운 플레이트로 옮깁니다. 정규화 혼합물을 준비한 후 간헐적 반전 및 용액의 와류와 함께 LNP의 각 샘플에 45마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 투명 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 1, 800RPM으로 30분 동안 흔듭니다.

비드를 세척한 후 마그네틱 스탠드에서 LNP를 제거하고 샘플을 용출하기 위해 각 웰에 30마이크로리터의 새로운 0.1 일반 수산화나트륨을 추가합니다. 그런 다음 LNP를 1, 800 RMP로 5분 동안 흔듭니다. LNP를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 상등액이 제거된 후 용출액 30마이크로리터를 보관 플레이트에 있는 미리 준비된 Library Normalization Storage Buffer 1로 옮깁니다.

플레이트를 아래로 구부린 다음 각 샘플의 5마이크로리터를 추가하여 라벨이 붙은 풀링 앰플리콘 라이브러리(Pooled Amplicon Library, PAL) 1.5밀리리터 튜브에 염기서열분석을 수행합니다. 사용되는 염기서열분석 화학 물질에 따라 4-10마이크로리터의 PAL을 590-596마이크로리터의 버퍼 HT1에 추가합니다. 플로우 셀(Flow Cell)을 청소하고 로드합니다.

시약을 로드합니다. 그리고 화면의 지시에 따라 시퀀싱 실행을 시작합니다. 염기서열분석 실행이 완료된 후 Bioinfomatics 파이프라인을 실행합니다.

실행 통계를 분석하여 sequenced library가 실험실에서 결정한 품질 관리 메트릭을 통과했는지 확인합니다. 마지막으로, 게놈 데이터 뷰어에서 BAM 파일을 확인하여 각 변형을 수동으로 검토합니다. 이것은 라이브러리 준비 샘플이 통과했는지 여부를 결정하는 데 사용되는 평균 범위를 제외한 가장 중요한 실행 통계의 요약입니다 QC.As 여기에서 볼 수 있습니다. 사례 1, Bioinformatics는 4개의 보고 가능한 AML 관련 돌연변이를 감지했습니다.

FLT3의 미스센스 머스트, IDH2의 미스센스 돌연변이, NPM1의 프레임시프트 돌연변이. FLT3의 돌연변이는 AML이 있는 성인 환자의 약 25%에서 관찰됩니다. 이 AML 환자에서 볼 수 있듯이 FLT3 Kinase Domain Point Mutations의 예후 중요성은 예후에 불분명한 영향을 미칩니다.

Isocitrate Dehydrogenase 2 또는 IDH2는 AML에서 일반적으로 돌연변이되는 후성유전학적 변형자를 암호화합니다. 뉴클레오포스민(NPM1) 유전자의 돌연변이는 AML에서 가장 흔하게 획득되는 돌연변이 중 하나입니다. 이 표에는 사례 2에 대한 모든 엑소닉 변형이 나열되어 있습니다.

두 가지 질병 관련 돌연변이가 발견되었습니다. ERBB2의 Exon 20에 프레임 내 삽입, TP53의 미스센스 돌연변이. HER2/neu 또는 ERBB2는 티로신 키나아제 수용체를 암호화합니다.

HER2/neu 엑손 활성화 폐 선암종의 2-4%에서 20개의 삽입이 관찰되며 폐암에서 관찰되는 대부분의 HER2/neu 돌연변이를 설명합니다. TP53 변화는 암에서도 흔합니다. 추출된 DNA의 질과 양에 세심한 주의를 기울일 필요가 있습니다.

이는 FFPE 샘플에 특히 중요합니다. 우리는 종종 DNA 수율 변수로 매우 저하 시도합니다. 임상 분석의 검증 과정에서 DNA를 라이브러리 준비로 진행하기 전에 각 샘플에 대해 DNA 품질 및 양에 대한 지표를 설정해야 합니다.

라이브러리 준비 외에도 염기서열분석 실행에 대한 컷오프 값, 품질 관리 통계, 라이브러리 준비 통계, Amplicon의 용기 깊이 및 보고 가능한 최소 대립유전자 빈도에 대한 컷오프 값을 결정하여 Bioinfomatic Spy Plan을 검증하는 것이 중요합니다. 일단 마스터하면 도서관 준비는 하루 안에 수행할 수 있습니다. 그러나 전체 분석 워크플로우는 DNA 추출, 염기서열분석, 데이터 처리 및 변이 검토에 더 많은 시간을 필요로 합니다.

이 절차는 특정 주요 핫스팟에서 게놈 DNA 돌연변이만 관찰하도록 설계되었습니다. RNA를 사용하는 다른 종괴는 유전자의 차등 발현, 위험 종양 연관 및 구조적 재배열과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다. 큰 발전이 곧 이루어질 것입니다.

자동화의 채택과 고유한 분자 바코드의 통합으로 실험실은 처리 시간을 단축하고, 샘플 입력을 줄이며, 매우 낮은 대립유전자 빈도에서 변이체를 검출할 수 있습니다. 암 표본에서 질병 관련 돌연변이를 검출하는 것은 수십 년 동안 표준 치료였습니다. NGS는 많은 암과 관련된 여러 유전자를 병렬로 염기서열 분석하는 편향이 적은 접근 방식으로, 여러 돌연변이를 식별하고 환자를 위한 더 나은 치료법을 제공합니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 행운을 빕니다.