Name: 유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 심근세포로의 분화 방법을. Wnt 경로 조절과 유동 세포 계측법을 활용하여 TNNI3 및 IRX4 마커로 세포 특성을 분석하는 효율적인 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NIH 4R00HL094708-03에 의해 지원되었다, MCW 리서치 업무위원회 새로운 교수 상, 위스콘신 의과 대학 (RLG)에서 컨 재단 (시작 자금); 홍콩 테마 기반의 연구 계획 T13-706 / 11 (KRB)의 연구 보조금위원회; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 및 AHA는 탐정 수상 (JCW) 설립; AHA 박사후 원정대 12POST12050254 (PWB). 우리는 데이터 수집 및 원고의주의 깊은 검토에 대한 지원은 위스콘신의 혈액 연구소의 유동 세포 계측법 코어에 희망 캠벨 감사합니다.

저자가 공개하는 게 없다.

분화 프로토콜의 성공에 중요 분화의 개시 전에 적어도 다섯 통로위한 단일 세포 수준에서 계대되었다 hPSCs 고품질 배양의 사용이다. 그들은 세포주 독립적 분화 개시시 100 % 합류, 경우 유사 분화 효율 일상적 다양한 hPSC 라인 중에서 관찰된다. 분화의 개시시 세포의 합류 ≤95 % 또는&gt; 100 % 인 경우 차선 효율이 관찰된다. 따라서, 파종 밀도 및 계대의 타이밍은 분화의 시작에 100 % 컨 플루 언트 단층을 달성하기 위해 각 라인에 대해 신중하게 최적화되어야한다. 이 거시적으로 합류 추정 주관적 특성을 제거하기 때문에이 점에있어서, 세포의 명시 번호 도금 / 웰, 오히려 분할 비를 사용하는 것보다 빠르게 상관없이 사용자의 체험 프로토콜의 성공적인 구현을 용이하게한다. 상업 준비여기에 설명 된 제제는 상당한 비용 절감 효과를 제공하지만 E8 매체들도 사용될 수있다. hESC의 정규화 된 행렬에 대한 대안으로, 성장 인자 감소 LDEV 부담 hESC의 정규화 된 행렬은 성공적으로 사용되어왔다. 일상적인 계대는...

hESC의와 hiPSC 포함 hPSCs,에서 심근의 발생은 기계 론적 연구, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 단계에 대한 통찰력을 제공하고, 초기 인간의 심장 발달 과정의 체외 모델로 작동 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 심장 계통의 의지와 세포 운명 사양을 제어하는​​ 분자 경로를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근, 효율적 hPSCs에서 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 향상되었다 1-15. 그러나, 프로토콜들 세포는 챔버 관련 마커 (예를 들어, 심실과 심방)를 발현하는 세포와 cardiomyogenic 타이밍을 생성하는 효율에 대해 세포주 편차가있다. 이상적으로,이 모델 시스템의 미래 응용 프로그램, 기능적으로 정의 된 세포의보다 균일 한 집단이 요구된다. 이전 방법과 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 CE 필요없는 여기서 설명한LL 집계 또는 견고 티빈 또는 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4)과의 추가는 일에 의해 TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v 및 MLC2a에 대한 문화가 매우 긍정적 인 일에 테스트 한 모든 hESC의와 hiPSC 라인에 걸쳐 10 세포를 생성합니다. 이 전략은 특히 입체 문화, 대중 문화, 또는 배아 체를 기반으로 전략 4-9에 비해 구현하기가 기술적으로 간단하고, 최근 hPSCs에 대한 선택적 독성을 가진 작은 분자를 설명하는 연구 (Boheler 등으로 정의 하였다. ) 65. 이 프로토콜의 특징은 작은 분자를 사용하여 완전하게 정의 미디어 (아무런 구별 1,2,7,13에서 유사) Wnt 신호를 변조 hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 (마트 리겔)의 단일 층을 사용하여 단일 층 문화 hPSCs의 분화를 포함하고, 분화 효율 및 셀 아이덴티티 평가 염색 방법 최적화 유동 세포 계측법. 이전 보고서는 비용 effectiv을 포함에 요약하면,이 프로토콜의 장점을 비교eness, 재현성 및 hiPSC hESC의 라인을 포함하여 여러 hPSC 라인 중 심근를 생성하기위한 고효율. 유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이며, 적절한 실험 설계로, 정량적 측정을 제공 할 수있다. 모든 항체 기반의 전략으로, 실험 결과의 정확한 해석은 하위 최적의 조건이 크게 항체의 효율성에 영향을 미치는로 항체 농도와 고정 및 permeabilization 조건 (세포 내 항원을 표적)을 포함하여 분석 디자인의 요소주의 깊게 각 항체 테스트해야 결과의 해석을 결합하고, 따라서. 정량 분석​​이 필요하다면 폴리 클로 날 항체가 여러 에피토프를 인식하고 뱃치 변화하는 경향이있다 중요한 것으로, 단일 클론 항체는 필수적이다. 현재 항체의 다양한 (포lyclonal 및 모노클로 날) 및 염색 프로토콜 어려운 프로토콜 1,2,9,11 중 cardiomyogenesis의 효율을 비교하기 위하여, 시험 관내 분화의 평가를 위해 설명되었다. 모든 유동 세포 계측법 분석을 위해 사용 가능한 경우 그 이유를 들어, 단일 클론 항체가 사용된다. 향후, 그것은 더 나은 차별화 전략 간의 비교를 허용해야, 특히 정량와 관련하여,이 염색 프로토콜의 표준화를 것으로 예상된다. 체외 cardiomyogenesis의 순도를 평가하기 위해 사용 된 마커의 선택 및 해당 항체는, 리포트 중에서 변한다. TNNT2는 cardiomyogenic 운명 커밋 세포의 지표로 간주되었으며 심장 일상적 분화 프로토콜의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 그러나 TNNT2은 초기 병아리와 쥐 개발 (16, 17) 중 골격근에서 발현과 인간의 평활근 (18)에 존재한다 </sup&gt;. 따라서, TNNT2 반드시 ​​체외에서 인간의 cardiomyogenesis의 특정 마커 없습니다. MLC2v 및 MLC2a 일상적으로 각각 심실 및 심방 하위 유형의 대리 지표로 사용된다. 그러나, 체외 분화의 컨텍스트에서 심근 하위 유형을 판별 MLC2v 및 MLC2a에 의존하고있는 도전이 유전자 산물이 성인 통해 중심 튜브에서, 심장 개발 걸쳐 특정 챔버로 제한되지 않을 수 있다는 사실로부터 발생한다. 짐승의 마음을 루프에서 MLC2a의 mRNA는 심방 / 유입 관의 지역에서 우세하고 MLC2v의 mRNA는 심실 / 유출 요로 지역에서 지배적이다. 루프 중심부에 위치한 MLC2a 및 MLC2v의 mRNA의 공동 발현은 유입 경로, 방실 운하 및 유출 관 (19, 20)에서 관찰된다. 출생 후 삼일으로 MLC2v의 mRNA는 심실로 제한되고, 출생 후 십일에 의해, MLC2a는 신생아 쥐의 심장 (19)에 심방으로 제한됩니다. 따라서 해석cardiomyogenesis 효율성과 하위 정체성은 기준 마커 레벨의 존재와 양을 고려하지해야하지만, 분석 분화 timepoints이 해당하는 발달 단계 (들)을 고려해야한다에 관한 데이터. 이 hPSCs의 체외 분화에 의해 생성 cardiomyogenic 세포의 성숙 단계가 가장 밀접하게 배아 / 태아 발달 21-25들과 유사한 점을 고려 특히 중요합니다. 따라서, 출생 후 심장 마커의 공간 표현에 의존하는 것은 적어도 어떤 경우에는 hPSC 유래 세포의 평가를 위하여는 적절하지 않을 수 있습니다. 체외에서 심근 ID를 정의하는보다 구체적인 기준의 개발을 용이하게하기위한 노력으로, TNNI3는 그것이 병아리 및 지브라 피쉬 15,20에서 배아 걸쳐 심근로 제한으로서 체외에서 cardiomyogenesis을 평가하기위한 유용한 마커로 간주인간 태아의 골격 근육 (26)의 존재이다. TNNI1 인간 태아 심장에 존재하지만, TNNI3 정상 성인의 심장 (27, 28)의 유일한 TNNI 이소 존재입니다. 심근 하위 정체성과 관련하여, IRX4 29 ~ 31는 심실 운명 세포의 정보 마커입니다. 단백질 수준에서 IRX4 최근 마우스 (32)에 신생아 단계를 통해 선형 심장 관에서 심실로 제한하는 것으로 나타났다. 따라서, 유동 세포 계측법에 의해 TNNI3의 분석 및 최적화를위한 IRX4 염색 프로토콜을 설명한다. 우리가 알기로는,이 유동 세포 계측법에 의한 효율적인 항체 기반 염색 인간 심근에 IRX4 수준의 분석을위한 방법의 제 설명이다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>BD Matrigel, hESC 인증 매트릭스</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 세포 분리 솔루션</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO, Hybri-Max, 멸균 여과)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드 선택적 p160ROCK 억제제</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산-2-인산 세스키마그네슘 염 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린(옵티페린 &ndash; 정의됨, 동물 무함유, 재조합 인간)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>형질전환 성장 인자 베타 1 (TGF&beta; 1)</td> <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12(L-글루타민 포함) 및 15mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>시그마 Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제에서 인슐린을 뺀</td><td>성분 Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 (인슐린 포함)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow Cytometry Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline (10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+Life Technologies가 없는 Hank의 균형 잡힌 소금 용액</td><td></td> <td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Phosflow perm buffer III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>말렌크로트 화학물질&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>5 ml 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브 (캡 없음)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>준비 유세포 분석용 세포</td></tr><tr><td>5 ml 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(35 &micro; M cell strainer snap cap)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>유세포 분석을 위한 세포 준비용</td></tr><tr><td>2 ml 고무 전구</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>9" 붕규산 언플러그드 유리 파스퇴르 피펫</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0.65 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 눈금, 녹색</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 눈금, 빨간색</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수</td>기 <td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>TC20 용 슬라이드 계산</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>6-well Flat bottom tissue-culture treated plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td>부분 표본</td></tr><tr><td>의 필터 살균용멸균 주사기 필터, 0.2 &micro; m polyethersulfone</td><td>VWR</td><td>28145-501</td> 분취액 250 ml<td>의 필터 살균 필터</td></tr><tr><td>시스템, 0.22 &마이크로; m 폴리에테르설폰, 살균, 낮은 바인딩</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>벌크 매체의 필터 살균용&nbsp;</td></tr><tr><td>500ml 필터 시스템, 0.22 &micro; m polyethersulfone, sterilizing, low binding</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>벌크 매체</td></tr><tr>의 필터 멸균용<td colspan="4">항체 및 동형대조군</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (클론: 284 (19C7))Abcam</td><td></td> <td>ab19615</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Anti-TNNT2 (clone: 1C11)Thermo</td> <td>Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Primary</td></tr><tr><td>antibody Anti-MYL2 (MLC2v, 클론: 330G5)</td><td>시냅스 시스템</td><td>310111</td><td>일차 항체</td></tr><tr><td>Anti-MYL7 (MLC2a, 클론: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-IRX4&nbsp; &nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>기본 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG1&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A21121</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>알렉사 플루오르 647 염소 안티 마우스 IgG2a</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A21241</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>알렉사 플루어 488 염소 안티 마우스 IgG2b</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A21141</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>피코에리트린(PE) 염소 안티 토끼 IgG</td><td>R& D Systems</td><td>F0110</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>마우스 IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>동형 제어</td></tr><tr><td>마우스 IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4724-81</td><td>이소타입 제어</td></tr><tr><td>토끼 IgG-PE</td><td>R& D Systems</td><td>IC105P</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td colspan="4">TaqMan 프로브 세트 qRT-PCR</td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01060665</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury T</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00610080</td><td></td></tr><tr><td>CASQ2</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00154286</td><td></td></tr><tr><td>IRX4</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01100809</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>Hs00158126</td><td></td></tr><tr><td>MESP1</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>Hs01001283</td><td></td></tr><tr><td>MYH11 (SMMHC)</td><td>라이프 테크놀로지스</td><td>Hs00224610</td><td></td></tr><tr><td>MYH6</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>Hs01101425</td><td></td></tr><tr><td>MYL2 (MLC2v)</td><td>라이프 테크놀로지스</td><td>Hs00166405</td><td></td></tr><tr><td>MYL7 (MLC2a)</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>스Hs01085598</td><td></td></tr><tr><td>MYOG</td><td>생명 기술</td><td>Hs01072232</td><td></td></tr><tr><td>NKX2.5</td><td>생명 기술</td><td>Hs00231763</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>생명 기술</td><td>Hs01081097</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1</td><td>생명 기술</td><td>Hs04260367</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>생명 기술</td><td>HS00751752</td><td></td></tr><tr><td>TNNI1</td><td>생명 기술</td><td>Hs00913333</td><td></td></tr><tr><td>TNNI2</td><td>생명 기술</td><td>Hs00268536</td><td></td></tr><tr><td>TNNI3</td><td>생명 기술</td><td>HS00165957</td><td></td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>생명 기술</td><td>Hs00165960</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

, 심장 손상을 복구하는 심장 독성이없는 새로운 치료제를 발견하고 정확하게 심장 질환을 모델링하기위한 전략을 향상시키기위한 방법을 개발하기위한 시급한 필요성이있다. 이러한 응용 프로그램은 &quot;접시에&quot;심장 근육을 생성하는 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술을 악용 가능성이 높은 열정을 생성하고 있습니다. 최근, 효율적으로 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 발 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 다르게 접근 할 수없는 인간 심장의 초기 개발 단계를 모델링 우리에게 새로운 기회를 제공하는, 개선했다. 많은 이전의 방법과는 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 세포 응집 또는 티빈 또는 BMP4의 추가를 요구하지 않는 여기서 설명하고 견고 심장 트로포 닌 고도로 양성 세포의 배양을 생성하여 I 및 T (TNNI3, TNNT2) iroquois- 클래스 homeodomain을 단백질IRX-4 (IRX4), 마이 오신 규제 경쇄 2, 심실 / 심장 근육의 이소 형 (MLC2v)과 미오신 규제 경쇄이 모든 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)와 hiPSC 라인에서 일 10에 의해 심방 이소 형 (MLC2a는) 테스트 날짜입니다. 세포는 계대와 문화에 90 일 이상 유지 될 수있다. 전략은 기술적으로 구현하기에 간단하고 비용 효과적이다. 다 능성 세포로부터 유도 된 심근 세포의 특성은 종종의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서, 기준 마커의 분석을 포함한다. 단백질 분석을 위해, 유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이다. 그러나, 샘플 제조에서 기술 변화는 크게 유동 세포 계측법 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 염색 프로토콜의 표준화는 다양한 차별화 전략 간의 비교를 용이하게한다. 따라서, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 및 TNN의 분석을 위해 염색 프로토콜을 최적화흐름에 의해 T2 세포 계측법에 설명되어 있습니다.

0 일에, 세포는 콤팩트 형태 및 세포 파편 최소 100 % 융합 성이다. 1-2 일에, 그것은 중요한 세포 죽음 (40~50%)을 관찰하는 것이 일반적이지만, 부착 세포는 콤팩트 형태 (도 1a)을 유지한다. 이 시간 동안 미디어는 오렌지와 혼탁입니다. 핑크 미디어 과도한 세포 사멸을 나타내며,이 경우, 트리 판 블루로 확인하고 세포 사멸이 70 %를 초과하는 경우 중단. 세포는 3 ~ 4 일 동안 복구하고 밀도가 증가 할 것이다. 일 5-6시, 최소한의 세포 사멸이 발생하고 조밀 한 패치가 나타나기 시작합니다. 일 7-8으로 합류 단층은 조밀 한 패치 산재 컴팩트 한 형태로 얻을 수있다. 세포는 자발적으로 일 (8)에 의해 계약을 시작하고 첫번째 수축은 종종 밀도 패치에서 볼 수 있습니다. 일 10함으로써,보다 강력한 수축이 관찰되고 이후의 일에 문화에 퍼져 나갈 것입니다. α-티닌 및 TNNT2 쇼 근절 구조에 대한 면역 세포 화학 염색법(그림 1A). 양적 실...

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

이 절차의 전반적인 목표는 만능 줄기 세포에서 고품질의 심근 세포 배양을 생성하고 유세포 분석을 사용하여 최종 산물을 적절하게 특성화하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 미분화 만능 줄기 세포의 고품질 단층 배양이 생성됩니다. 그런 다음 심장 근육 형성은 작은 분자를 사용하여 바람 경로를 조절하여 유도됩니다.다음으로, 심근세포는 각 항체에 특별히 최적화된 조건을 사용하여 고정, 투과 및 염색됩니다. 마지막으로, 세포는 유세포 분석법으로 분석됩니다. 궁극적으로 심장 마커, TNNI 3 및 IRX 4에 대해 매우 양성인 배양을 보여주고 심실과 유사한 활동 전위를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.직원 및 브레이드 바디와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 구현이 비교적 간단하고 비용 효율적이라는 것입니다. 또한, 이 기술은 심장 트로포닌 I.당 매우 긍정적인 세포의 배양을 생성하며, 다른 프로토콜에 의해 관찰된 내부 기본 변이 및 효율성이 없으면 사전 분화 세포 품질이 분화 효율성에 상당한 영향을 미치기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 또한 항체 염색 전에 부적절한 고정 및 투과성으로 인해 차선의 유세포 분석 결과가 나올 수 있으며, 이는 제 연구실의 대학원생인 Shabo Bachar가 시술할 것임을 보여줍니다.다음 절차에서 가장 어려운 점은 분화 전에 고품질의 미분화 만능 줄기세포를 유지하는 것입니다. 최적이 아닌 성장 특성을 가진 세포를 사용하면 분화 효율성에 큰 영향을 미칩니다. 6개의 HESC 인증 매트릭스 코팅 접시에서 성장한 잘 정립된 HPC로 이 절차를 시작하십시오.현미경으로 세포를 검사하여 균질한 형태를 나타내는지 확인하십시오. 세포가 여기에 표시된 것과 같이 형태와 같은 신경 상피 또는 섬유아세포를 나타내는 경우 사용해서는 안 됩니다. 세포가 웰 계대당 0.75 백만회에 앉았을 때 활발하게 증식하는지 확인하고, 약 3일에 한 번씩 75%에서 세포가 분화 배후로 분화되기 전에 단일 세포 수준으로 해리된 세포를 최소 5회 계승시킵니다.세포는 먼저 E 8 성장 배지를 흡인하고 실온으로 예열된 4ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 1ml의 실온 세포 분리 용액을 추가하고 세포 경계가 둥글어지기 시작할 때까지 웰을 방해받지 않고 그대로 둡니다. 이 작업은 일반적으로 3분에서 7분 정도 소요되며 거시적으로 관찰하고 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다.다음으로, 전구가 있는 면 플러그 유리 피펫을 사용하여 세포를 제거하고 1ml의 DM EMF 12 배지를 포함하는 15ml 원추형 튜브로 옮겼습니다. 이렇게 하면 세포 분리 용액이 비활성화됩니다. 10마이크로리터의 세포 용액 분취액을 제거하고 마이크로 원심분리기 튜브에서 10마이크로리터의 트리안 블루와 혼합합니다.세포를 세고 나서 그것들을 모으기 위해 130 GS에서 5분 동안 15 밀리리터 원추형 튜브를 원심분리기로 만듭니다. 실온에서 원심분리하는 동안 자동 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 앞으로 70%에서 80%의 생존 가능성을 기대하십시오.모든 셀 수는 실행 가능한 셀 수가 아닌 총 셀 수를 기반으로 합니다. 스핀 후 배지를 흡인하고 D-M-E-M-F 12의 세포 펠릿을 500 마이크로 리터 당 6 개의 세포에 0.75 곱하기 10의 최종 농도로 재현 탁탁 한 후, 각 웰이 2 밀리리터의 E 8 배지를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 암석 억제제를 사용하여 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 부드럽게 흔들어 우물 전체에 세포를 균일하게 분산시킵니다.세포를 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 인큐베이터로 되돌립니다.포장 후 24시간. 암석 억제제가 없는 E 8 웰당 2밀리리터를 사용하여 매일 배지를 교체하기 시작합니다.분화가 시작되기 전에 100% 합류를 달성하기 위해 파종 밀도를 최적화합니다. 0일차에는 세포가 100% 융합되어 조밀한 형태와 최소한의 세포 파편이 있습니다. E eight 매체를 2mL의 분화로 교체하여 차별화 프로세스를 시작합니다. 보통.첫 번째, 각각에 1.2마이크로리터의 CHIR을 추가합니다. 첫째 날과 둘째 날에는 40-50%의 세포가 현저히 죽는 것이 일반적입니다. 그러나 부착된 세포는 조밀한 형태를 유지합니다.이 시간 동안 매체는 주황색으로 탁해집니다. 과도한 세포 사멸을 나타내는 분홍색 배지가 관찰되면 트라이암 블루로 세포 생존력을 확인하고 세포 사멸이 70%를 초과하면 중단합니다. 그렇지 않으면 첫날에 배지를 2ml의 새로운 분화로 교체하는 과정을 반복합니다. 보통. 첫 번째, 각 웰에 1.2마이크로리터의 CHIR을 추가하고 2-3일째에 새로운 분화 배지로 교체합니다.첫째, 3일에서 4일 동안 세포는 회복되고 4일째에는 밀도가 증가합니다. 각 웰의 배지를 새로운 분화로 교체하십시오. IWR 1의 중간 번호 1 및 1 마이크로 리터.5일에서 6일 동안에는 최소한의 세포 사멸이 발생하고 5일째에 조밀한 반점이 나타나기 시작할 수 있으며, 배지를 새로운 분화로 대체합니다. 배지 1번, 6일에서 7일째에 각 웰에 1마이크로리터의 IWR 1을 추가하고 배지를 새로운 차별화로 교체합니다. 중간 번호 1.7일차에서 8일차까지, 조밀한 패치가 산재된 조밀한 형태학으로 합류 단층이 달성됩니다. 8일째가 되면 세포가 자발적으로 수축하기 시작하고 첫 번째 수축은 종종 빽빽한 부분에서 볼 수 있습니다. 8일째에는 배지를 새로운 분화로 교체합니다. 보통.두 번째, 배양 기간 동안 격일로 분화 매체 두 번으로 계속 교체하십시오. 10일째가 되면 더 강력한 수축이 관찰되고 이후 며칠 동안 배양 전체로 계속 퍼질 것입니다. 이 비디오는 30일째의 세포를 보여주고 여기에서 세포는 55일째에 보여줍니다.유세포 분석을 위해 세포를 수집하려면 이전에 수행한 것과 같이 세포 해리 수집 및 계수를 수행합니다. 이 시점에서 세포를 멸균 상태로 유지할 필요가 없습니다. 세포 펠릿을 부드럽게 와류로 가열하면서 세포 펠릿에 100마이크로리터의 고정 용액을 적방울로 추가합니다.그런 다음 얼음 위에서 튜브를 15분 동안 배양합니다. 3 밀리리터의 세포 세척 용액을 첨가하고, 스핀 후 원심 분리로 세포를 수집하고, 와류를 일으키면서 용액을 흡인합니다. 이전과 같이 세포 펠릿에 100마이크로리터의 투과성 용액을 적가합니다.그런 다음 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 3ml의 세포 세척 용액을 추가합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 용액을 흡인합니다.침투 후 총 두 번 씻는 동안 반복합니다. 400마이크로리터의 세포 유지 용액에서 P 1000 피펫을 사용하여 세포에 대한 항체 염색을 수행하고 위아래로 피펫팅하여 분해합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 세포 유지 관리 솔루션으로 둥근 바닥 튜브에 세포 여과기 캡을 미리 적십니다.튜브를 얼음 위에 놓습니다. cell strainer cap은 세포 응집체가 유세포 분석기를 막는 것을 방지합니다. 다음으로, 셀 용액을 셀 스트레이너 캡으로 옮기고 셀 현탁액이 중력에 의해 배출되도록 합니다.세포가 튜브에 모이도록 벤치 상단의 튜브 바닥을 부드럽게 두드립니다. 가능한 한 빨리 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 세포의 최대 회복을 보장하기 위해 250마이크로리터의 세포 유지 관리 솔루션으로 스트레이너를 헹굽니다.생성된 심근세포의 품질을 결정하기 위해 유세포 분석법으로 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포를 10일 동안 분화하고 TNNI 3 a, 범심근세포 마커, TNNT 2 A 줄무늬 근육 마커 및 IRX 4 A 심실 심근 마커에 대한 항체로 염색했습니다. 고정 및 투과성 조건은 양성 세포의 최대 비율을 달성하기 위해 각 항체에 대해 최적화되었습니다.히스토그램은 게이트 세포의 99%가 TNNI 3에 대해 양성이었고 96%가 IRX 4에 대해 양성임을 보여줍니다. 또한, 이 세포는 TNNT 2, MLC 2V 및 MLC 2를 포함한 심장 분화의 다른 마커에 대해 매우 긍정적이었습니다. 심근세포 순도 및 세포 정체성에 관한 주장은 TNNI 3 및 IRX 4를 기반으로 합니다.염색 MC 2 V 및 MC 2 A는 발달 중에 챔버 제한이 없으며 TNNT 2는 골격근에서도 발견됩니다. 여기에 나타난 활동 전위는 전세포 패치 클램핑을 사용하여 분화 46일째에 자발적으로 수축하는 단일 심근세포에서 기록되었습니다. 활동 전위 프로파일은 심실과 같은 심근 세포가 얻어졌음을 나타냅니다.마디와 같은 프로파일의 작은 비율도 관찰되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 만능 줄기 세포에서 고품질 심근세포 배양액을 생성하는 방법과 유세포 분석으로 특성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 분화가 시작되기 전에 줄기세포를 고품질 단층으로 유지하는 데 직면하는 일반적인 문제 때문에 어려움을 겪을 것입니다.고정제로 작업하는 것은 위험하고 개인적일 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 실험실 가운이나 장갑과 같은 보호 장비를 항상 착용해야 합니다.

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 심근세포로의 분화 방법을. Wnt 경로 조절과 유동 세포 계측법을 활용하여 TNNI3 및 IRX4 마커로 세포 특성을 분석하는 효율적인 기술입니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

더 많은 동영상 탐색