유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

이 절차의 전반적인 목표는 만능 줄기 세포에서 고품질의 심근 세포 배양을 생성하고 유세포 분석을 사용하여 최종 산물을 적절하게 특성화하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 미분화 만능 줄기 세포의 고품질 단층 배양이 생성됩니다. 그런 다음 심장 근육 형성은 작은 분자를 사용하여 바람 경로를 조절하여 유도됩니다.

다음으로, 심근세포는 각 항체에 특별히 최적화된 조건을 사용하여 고정, 투과 및 염색됩니다. 마지막으로, 세포는 유세포 분석법으로 분석됩니다. 궁극적으로 심장 마커, TNNI 3 및 IRX 4에 대해 매우 양성인 배양을 보여주고 심실과 유사한 활동 전위를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

직원 및 브레이드 바디와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 구현이 비교적 간단하고 비용 효율적이라는 것입니다. 또한, 이 기술은 심장 트로포닌 I.당 매우 긍정적인 세포의 배양을 생성하며, 다른 프로토콜에 의해 관찰된 내부 기본 변이 및 효율성이 없으면 사전 분화 세포 품질이 분화 효율성에 상당한 영향을 미치기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 또한 항체 염색 전에 부적절한 고정 및 투과성으로 인해 차선의 유세포 분석 결과가 나올 수 있으며, 이는 제 연구실의 대학원생인 Shabo Bachar

다음 절차에서 가장 어려운 점은 분화 전에 고품질의 미분화 만능 줄기세포를 유지하는 것입니다. 최적이 아닌 성장 특성을 가진 세포를 사용하면 분화 효율성에 큰 영향을 미칩니다. 6개의 HESC 인증 매트릭스 코팅 접시에서 성장한 잘 정립된 HPC로 이 절차를 시작하십시오.

현미경으로 세포를 검사하여 균질한 형태를 나타내는지 확인하십시오. 세포가 여기에 표시된 것과 같이 형태와 같은 신경 상피 또는 섬유아세포를 나타내는 경우 사용해서는 안 됩니다. 세포가 웰 계대당 0.75 백만회에 앉았을 때 활발하게 증식하는지 확인하고, 약 3일에 한 번씩 75%에서 세포가 분화 배후로 분화되기 전에 단일 세포 수준으로 해리된 세포를 최소 5회

세포는 먼저 E 8 성장 배지를 흡인하고 실온으로 예열된 4ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 1ml의 실온 세포 분리 용액을 추가하고 세포 경계가 둥글어지기 시작할 때까지 웰을 방해받지 않고 그대로 둡니다. 이 작업은 일반적으로 3분에서 7분 정도 소요되며 거시적으로 관찰하고 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다.

다음으로, 전구가 있는 면 플러그 유리 피펫을 사용하여 세포를 제거하고 1ml의 DM EMF 12 배지를 포함하는 15ml 원추형 튜브로 옮겼습니다. 이렇게 하면 세포 분리 용액이 비활성화됩니다. 10마이크로리터의 세포 용액 분취액을 제거하고 마이크로 원심분리기 튜브에서 10마이크로리터의 트리안 블루와 혼합합니다.

세포를 세고 나서 그것들을 모으기 위해 130 GS에서 5분 동안 15 밀리리터 원추형 튜브를 원심분리기로 만듭니다. 실온에서 원심분리하는 동안 자동 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 앞으로 70%에서 80%의 생존 가능성을 기대하십시오.

모든 셀 수는 실행 가능한 셀 수가 아닌 총 셀 수를 기반으로 합니다. 스핀 후 배지를 흡인하고 D-M-E-M-F 12의 세포 펠릿을 500 마이크로 리터 당 6 개의 세포에 0.75 곱하기 10의 최종 농도로 재현 탁탁 한 후, 각 웰이 2 밀리리터의 E 8 배지를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 암석 억제제를 사용하여 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 부드럽게 흔들어 우물 전체에 세포를 균일하게 분산시킵니다.

세포를 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 인큐베이터로 되돌립니다.포장 후 24시간. 암석 억제제가 없는 E 8 웰당 2밀리리터를 사용하여 매일 배지를 교체하기 시작합니다.

분화가 시작되기 전에 100% 합류를 달성하기 위해 파종 밀도를 최적화합니다. 0일차에는 세포가 100% 융합되어 조밀한 형태와 최소한의 세포 파편이 있습니다. E eight 매체를 2mL의 분화로 교체하여 차별화 프로세스를 시작합니다. 보통.

첫 번째, 각각에 1.2마이크로리터의 CHIR을 추가합니다. 첫째 날과 둘째 날에는 40-50%의 세포가 현저히 죽는 것이 일반적입니다. 그러나 부착된 세포는 조밀한 형태를 유지합니다.

이 시간 동안 매체는 주황색으로 탁해집니다. 과도한 세포 사멸을 나타내는 분홍색 배지가 관찰되면 트라이암 블루로 세포 생존력을 확인하고 세포 사멸이 70%를 초과하면 중단합니다. 그렇지 않으면 첫날에 배지를 2ml의 새로운 분화로 교체하는 과정을 반복합니다. 보통. 첫 번째, 각 웰에 1.2마이크로리터의 CHIR을 추가하고 2-3일째에 새로운 분화 배지로 교체합니다.

첫째, 3일에서 4일 동안 세포는 회복되고 4일째에는 밀도가 증가합니다. 각 웰의 배지를 새로운 분화로 교체하십시오. IWR 1의 중간 번호 1 및 1 마이크로 리터.

5일에서 6일 동안에는 최소한의 세포 사멸이 발생하고 5일째에 조밀한 반점이 나타나기 시작할 수 있으며, 배지를 새로운 분화로 대체합니다. 배지 1번, 6일에서 7일째에 각 웰에 1마이크로리터의 IWR 1을 추가하고 배지를 새로운 차별화로 교체합니다. 중간 번호 1.

7일차에서 8일차까지, 조밀한 패치가 산재된 조밀한 형태학으로 합류 단층이 달성됩니다. 8일째가 되면 세포가 자발적으로 수축하기 시작하고 첫 번째 수축은 종종 빽빽한 부분에서 볼 수 있습니다. 8일째에는 배지를 새로운 분화로 교체합니다. 보통.

두 번째, 배양 기간 동안 격일로 분화 매체 두 번으로 계속 교체하십시오. 10일째가 되면 더 강력한 수축이 관찰되고 이후 며칠 동안 배양 전체로 계속 퍼질 것입니다. 이 비디오는 30일째의 세포를 보여주고 여기에서 세포는 55일째에 보여줍니다.

유세포 분석을 위해 세포를 수집하려면 이전에 수행한 것과 같이 세포 해리 수집 및 계수를 수행합니다. 이 시점에서 세포를 멸균 상태로 유지할 필요가 없습니다. 세포 펠릿을 부드럽게 와류로 가열하면서 세포 펠릿에 100마이크로리터의 고정 용액을 적방울로 추가합니다.

그런 다음 얼음 위에서 튜브를 15분 동안 배양합니다. 3 밀리리터의 세포 세척 용액을 첨가하고, 스핀 후 원심 분리로 세포를 수집하고, 와류를 일으키면서 용액을 흡인합니다. 이전과 같이 세포 펠릿에 100마이크로리터의 투과성 용액을 적가합니다.

그런 다음 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 3ml의 세포 세척 용액을 추가합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 용액을 흡인합니다.

침투 후 총 두 번 씻는 동안 반복합니다. 400마이크로리터의 세포 유지 용액에서 P 1000 피펫을 사용하여 세포에 대한 항체 염색을 수행하고 위아래로 피펫팅하여 분해합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 세포 유지 관리 솔루션으로 둥근 바닥 튜브에 세포 여과기 캡을 미리 적십니다.

튜브를 얼음 위에 놓습니다. cell strainer cap은 세포 응집체가 유세포 분석기를 막는 것을 방지합니다. 다음으로, 셀 용액을 셀 스트레이너 캡으로 옮기고 셀 현탁액이 중력에 의해 배출되도록 합니다.

세포가 튜브에 모이도록 벤치 상단의 튜브 바닥을 부드럽게 두드립니다. 가능한 한 빨리 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 세포의 최대 회복을 보장하기 위해 250마이크로리터의 세포 유지 관리 솔루션으로 스트레이너를 헹굽니다.

생성된 심근세포의 품질을 결정하기 위해 유세포 분석법으로 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포를 10일 동안 분화하고 TNNI 3 a, 범심근세포 마커, TNNT 2 A 줄무늬 근육 마커 및 IRX 4 A 심실 심근 마커에 대한 항체로 염색했습니다. 고정 및 투과성 조건은 양성 세포의 최대 비율을 달성하기 위해 각 항체에 대해 최적화되었습니다.

히스토그램은 게이트 세포의 99%가 TNNI 3에 대해 양성이었고 96%가 IRX 4에 대해 양성임을 보여줍니다. 또한, 이 세포는 TNNT 2, MLC 2V 및 MLC 2를 포함한 심장 분화의 다른 마커에 대해 매우 긍정적이었습니다. 심근세포 순도 및 세포 정체성에 관한 주장은 TNNI 3 및 IRX 4를 기반으로 합니다.

염색 MC 2 V 및 MC 2 A는 발달 중에 챔버 제한이 없으며 TNNT 2는 골격근에서도 발견됩니다. 여기에 나타난 활동 전위는 전세포 패치 클램핑을 사용하여 분화 46일째에 자발적으로 수축하는 단일 심근세포에서 기록되었습니다. 활동 전위 프로파일은 심실과 같은 심근 세포가 얻어졌음을 나타냅니다.

마디와 같은 프로파일의 작은 비율도 관찰되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 만능 줄기 세포에서 고품질 심근세포 배양액을 생성하는 방법과 유세포 분석으로 특성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 분화가 시작되기 전에 줄기세포를 고품질 단층으로 유지하는 데 직면하는 일반적인 문제 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

고정제로 작업하는 것은 위험하고 개인적일 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 실험실 가운이나 장갑과 같은 보호 장비를 항상 착용해야 합니다.