인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 피더 프리(feeder free) 조건에서 배양된 인간 IPS 세포로부터 인간 심근세포를 분화시키는 것입니다. 이는 먼저 IPS 세포를 초저부착 플레이트에 플레이팅하여 배아체(embryo bodies)를 형성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 형성된 배아체를 젤라틴 코팅 디쉬로 옮기는 것입니다.

수축 부위가 나타나면, 입체 현미경 하에서 이를 수동으로 박리하여 피브로넥틴이 코팅된 디쉬에 도말합니다. 추가 분화를 위해, 마지막 단계로 효소 소화를 통해 수축 클러스터로부터 단일 심근세포를 얻습니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 심장 트로포닌과 같은 전형적인 구조적 마커를 발현하는 심근세포 유사 세포의 분화 결과를 확인할 수 있습니다.

이 방법은 인간 심근세포 수준에서 심장 발달 및 질환 중 심장 분화와 기능 장애를 유발하는 메커니즘은 무엇인지와 같은 심혈관 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 인간 환자 및 일반인으로부터 체외에서 심근세포를 생성할 수 있게 해주므로 매우 흥미로운 기법입니다. 또한, 시험관 내에서 질병을 재현함으로써 생체 내 실험에 들어가기 전 체외에서 새로운 약물을 실험할 수 있게 해줍니다.

실험은 35 millimeter matrigel 코팅 플레이트에서 배양한 합류 상태의 IPS 세포 배양물로 시작합니다. 성장 배지를 1 mg의 diss가 포함된 1 mL의 PBS로 교체합니다. 연마된 유리 피펫을 사용하여 세포를 관찰합니다.

콜로니 중심부의 분화된 세포 영역(분화구 모양 또는 낭성 구조 등)을 제거하십시오. 또한 세포가 분리되어 편평해지고 외부로 이동하는 것처럼 보이는 모든 영역도 제거하십시오. 이제 남은 세포를 배양 후드 내 37 °C에서 콜로니 경계가 더 밝아지고 떨어지기 시작할 때까지 배양하십시오.

이 과정은 보통 5분에서 7분 정도 소요됩니다. 이 단계에서 dispa 용액을 제거하고 1 mL의 HESM로 세포를 세척합니다. 그 다음 세척액을 버립니다.

새로운 HESM 1 mL를 사용하여 셀 리프터로 콜로니를 수확합니다. 수확한 콜로니를 15 mL 튜브에 모읍니다. 다음으로, HESM 1 mL로 세포를 헹구고 1000 ×g에서 4분 동안 원심 분리하여 침전시킵니다.

그 다음 매트리젤(matrigel) 위에 세포를 도말하고 배양 기간 동안 매일 배지를 교체합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 미분화 IPS 콜로니를 수확하는 것부터 시작하십시오. 미분화 집단이 분리되면, 이들을 1 mL의 EBM 20에 부드럽게 재현탁합니다.

2 mL 피펫을 사용하여 세포 덩어리가 너무 많이 깨지지 않도록 주의하십시오. 피펫팅은 2~3회 정도로 제한하십시오. 피펫팅 단계 사이에 실체현미경으로 콜로니의 크기를 확인하십시오.

콜로니들의 크기가 모두 비슷해지면 더 이상의 혼합은 필요하지 않습니다. 이제 회수된 세포 플레이트당 하나씩, 6-웰 초저부착 플레이트(ultra low attachment plate)에 세포를 분주하십시오. 튜브를 1 mL의 EBM 20으로 헹궈낸 후, 그 세척액까지 플레이트에 나누어 담는 것을 잊지 마십시오.

배양 3일 차에, 배아 본체가 제거되지 않도록 현미경을 사용하여 배지를 교체하십시오. 피펫을 플레이트 가장자리에 가깝게 유지하십시오. 7일 차에, 배아 본체를 37 °C에서 30분 동안 가온한 0.1% Gelatin 코팅 플레이트로 옮기십시오.

2 mL의 배지가 담긴 각 35 mm 디쉬에 배아 본체 35~40개를 넣습니다. 배양 과정 동안 일주일에 두 번 정기적으로 배지를 교체합니다.

배아 본체에서 박동 부위를 확인하고 박동 부위가 위치한 곳을 표시합니다. 배양 접시 덮개 상단에 약 10~20일 후에 박동 수축 부위가 나타나야 합니다. 자발적 수축 부위가 나타나면 배지를 EBM two로 교체하십시오. 수축 부위가 나타난 후, 최대 한 달 동안 플레이트의 다른 부위를 계속 배양하며 모니터링하십시오.

총계. EBM에서 분화 과정의 결핍은 여러 요인에 크게 의존하며, 그 중 가장 중요한 것은 심근 분화를 유도하는 데 사용되는 특정 세포주와 혈청 배치입니다. 최고 효율을 얻으려면 심근 형성 잠재력을 확인하기 위해 여러 세포주와 다양한 혈청 배치를 테스트하십시오. 12웰 플레이트 코팅부터 시작하십시오.

well당 300 µL의 PBS에 녹인 5 µg/cm² 농도의 fibronectin을 분주하여 well 플레이트의 표면을 완전히 코팅합니다. 세포 배양 후드 내에서 플레이트를 덮개 없이 건조시킵니다. 세포 배양의 비딩 영역을 제거하려면, pulled glass pipette과 메스를 사용하십시오.

그 다음 1 mL 피펫을 사용하여 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅된 플레이트의 각 웰에 4~5개의 클럼프(clamp)를 옮깁니다. 모든 수집이 완료되면, 수집 플레이트의 로딩된 웰에 EBM 2 1 mL를 추가하고 세포가 제거된 영역을 표시합니다. 그런 다음 배지를 교체하고 플레이트를 배양 후드로 되돌립니다.

실체 현미경 하에서 더 작은 박동성 세포 덩어리가 필요한 경우, 적출된 부위를 피펫으로 통과시킵니다. 이렇게 하면 소수의 박동 세포를 포함하는 작은 클러스터가 생성됩니다. 배양 시.

분석 준비가 될 때까지 일주일에 두 번 배지를 교체합니다. 먼저, 표면을 덮기에 충분한 양의 PBS에 희석한 20 µg의 fibronectin으로 코팅하여 4 cm 사각형의 2-챔버 슬라이드 4개를 준비합니다. 유리 지지대를 사용하는 경우, laminin 20 µg을 추가로 첨가합니다.

이전에 설명한 대로 비드 배양 영역을 분리합니다. 1mL 피펫을 사용하여 세포를 500µL의 콜라게나제가 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 15분 동안 배양하며, 배양 중에 튜브를 한 번 흔들어 줍니다.

15분 후, 200 µL 피펫을 이용해 세포를 옮기며 덩어리가 남아 있을 경우 이를 제거합니다. 큰 덩어리가 더 이상 남지 않았을 때 세포를 신선한 collagenase two로 옮기고 배양 과정을 반복합니다. 각각 준비된 ascorbic acid가 없는 EBM two 3 mL를 첨가하여 소화를 종료합니다.

튜브를 후드 내의 가열 랙에 보관한 다음, 상온에서 1000 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면, 동일한 초기 샘플에서 얻은 세포 분획물을 1 mL의 0.25% trypsin EDTA in PBS에 넣어 현탁액을 만듭니다. 그다음 현탁액을 가열 블록에서 5분 동안 배양하고, ascorbic acid가 없는 4 mL의 EBM-2를 첨가하여 trypsin을 불활성화합니다.

다음으로, 현미경으로 관찰했을 때 큰 덩어리가 보이지 않을 때까지 2.5 milliliter 주사기에 18 gauge 바늘을 장착하여 세포를 최대 7회 통과시킵니다. 그런 다음 세포를 1000 times G에서 4분 동안 원심분리합니다. 이제 세포 펠렛을 E BM two에 재부유시키고 2-웰 챔버 슬라이드에 분주합니다.

세포는 2~3일간 배양 후 분석 준비가 완료됩니다. CMS는 여러 IPS 세포주로부터 생성되었습니다. 이 세포주들은 처음에 meth feeder 층에서 생성되었으며, 규정된 배지를 사용하여 즉시 matrigel 위에 배치되었습니다.

세포들은 위상차 현미경 상에서 밝은 가장자리와 뚜렷한 핵을 가진 인간 ESC 유사 형태를 보였습니다. 면역형광 분석 결과, IPS 세포들이 전사 인자인 T four를 올바르게 발현하고 TRA one 60 표면 항원을 발현하는 것으로 나타났습니다. 유세포 분석을 통해 전형적인 표면 다능성 항원인 SS EEA four와 TRA one 60의 발현을 확인하였습니다.

게이팅 전략은 왼쪽 산점도에 표시되어 있습니다. 매트릭스 젤에서 배양된 IP FS 세포의 핵형 분석 또한 수행되었습니다. 심장 계통으로의 유도는 IPS 세포를 eb로 응집시키고 특정 유형의 혈청이 포함된 배지에서 배양함으로써 유도되었습니다.

또한, 사용된 세포주에 따라 소르빈산 수축 부위가 전체 배양 영역의 20~35%를 차지했습니다. 효소 소화를 통해 이러한 영역에서 수축하는 CMS를 분리하여 단백질 발현을 분석하였습니다. R-T-P-C-R 결과, IPS 유래 박동 세포에서는 심장 특이적 이온 채널의 발현이 확인되었으나, 비박동 세포에서는 확인되지 않았습니다.

이들 채널에는 전압 의존성 칼슘 채널의 하위 단위인 alpha one, 5형 전압 개폐 나트륨 채널의 alpha subunit, KQT 유사 하위 가족의 칼륨 전압 개폐 채널, 그리고 두 가지 형태의 myosin이 포함되었습니다. 중쇄 면역형광 분석 결과, 단일 IPS 유래 심근세포가 구조 단백질인 alpha sarcomeric, actin, cardiac troponin I 및 심장 특이적 결합 단백질인 conexion 43을 발현하는 것으로 나타났습니다. 결국, 이 기술은 인비트로(in vitro)에서의 심근 질환 모델링을 위한 길을 열었으며, 약물을 인체에 직접 주입하지 않고도 인체 환경에서 약물 실험을 가능하게 합니다.

이 영상을 시청한 후에는 무혈청 조건에서 IPS 세포를 유지 관리하는 방법과 배아체 응집 기반의 방법을 통해 이를 심근세포로 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.