인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 피더가 없는 조건에서 배양된 인간 IPS 세포와 인간 심근세포를 구별하는 것입니다. 이는 먼저 IPS 세포를 초저 부착 플레이트에 도금하여 배아체를 형성함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 형성된 배아체를 젤라틴으로 코팅된 접시로 옮기는 것입니다.

수축 영역이 나타나면 실체 현미경으로 수동으로 해부하고 피브로넥틴 코팅된 접시에 도금합니다. 추가 분화를 위해 마지막 단계는 수축 클러스터의 효소 분해를 통해 단일 심근세포를 얻는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 면역형광 현미경 검사를 통해 전형적인 구조 마커인 IE 심장 트로포닌을 발현하는 세포와 같은 심근세포의 분화를 보여줄 수 있습니다.

이 방법은 심혈관 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 인간 심근세포 수준에서 심장 발달 및 질병 중 심장 분화 및 기능 장애를 유발하는 메커니즘이 무엇인지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 인간 환자와 인간 개인으로부터 체외에서 심근세포를 생성할 수 있기 때문에 매우 흥미로운 기술입니다. 두 번째 경우에는 시험관에서 질병을 재현할 수 있으므로 신약을 생체 내에서 실험하기 전에 시험관에서 실험할 수 있습니다.

실험: 35mm 마트리겔 코팅 플레이트에서 성장한 융합 IPS 세포 배양으로 시작합니다. 성장 배지를 디스 밀리그램을 포함하는 PBS 1밀리리터로 교체합니다. 폴링된 유리 피펫을 사용하여 세포를 검사합니다.

군체 중앙의 분화구와 같은 분화구 또는 낭포 구조와 같은 분화된 세포가 있는 영역을 제거합니다. 또한 세포가 분리되고 평평해지며 바깥쪽으로 이동하는 것처럼 보이는 영역을 제거합니다. 이제 나머지 세포를 섭씨 37도의 배양 후드 아래에서 군체 경계가 밝아지고 분리되기 시작할 때까지 배양합니다.

이 작업은 일반적으로 5분에서 7분 정도 걸립니다. 이 시점에서 디스파 용액을 제거하고 1ml의 HESM으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 세척 용액을 버리십시오.

새로운 밀리리터의 HESM에서 세포 리프터를 사용하여 집락을 수확합니다. 콜로니를 15ml 튜브에 모으십시오. 다음으로, 또 다른 HESM으로 세포를 헹구고 4분 동안 1000배 G로 회전시킵니다.

그런 다음 matrigel에서 세포 도금을 진행하고 배양 중 배지를 매일 교체하십시오. 이전 섹션에서 설명한 대로 미분화된 IPS 콜로니를 수확하는 것으로 시작합니다. 미분화 개체군이 분리되면 EBM 20 1밀리리터에 부드럽게 매달아 놓습니다.

2밀리리터 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 너무 많이 분해하지 마십시오. 피펫팅을 2회 또는 3회로 제한하십시오. 스트로크 사이에 입체경 아래에 있는 콜로니의 크기를 확인합니다.

군체가 모두 거의 같은 크기일 때는, 더 이상 섞을 필요가 없다. 이제 세포를 매우 낮은 부착 플레이트에 플레이트하여 수확된 세포 플레이트당 하나의 6웰 플레이트를 채웁니다. EBM 20 1ml로 튜브를 헹구고 헹굼을 플레이트에 분배하는 것을 잊지 마십시오.

배양 3일째 후에는 배아가 제거되지 않도록 현미경을 사용하여 배지를 교체합니다. 피펫을 플레이트 가장자리 가까이에 두십시오. 7일째 되는 날, 배아체를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 30분 동안 예열합니다.

35-40개의 배아체를 2밀리리터의 배지에 담아 각 35mm 접시에 추가합니다. 배양 중에. 일주일에 두 번 정기적으로 매체를 교체하십시오.

배아체에서 박동 부위가 있는지 확인하고 구슬 부위가 있는 위치를 표시합니다. 접시 덮개 상단에 구슬 수축 영역이 약 10-20일 후에 나타나야 합니다. 자연 수축 영역이 나타나면 매체를 EBM 2로 전환하십시오.수축 영역이 나타난 후 최대 한 달 동안 플레이트의 다른 영역을 계속 배양하고 모니터링하십시오.

전체로. EBM에서 분화 과정의 결핍은 여러 요인에 크게 의존하며, 그 중 가장 중요한 것은 특정 세포주와 심장 분화를 유도하는 데 사용되는 혈청 배치입니다. 최고 효율을 얻으려면 심인성 전위와 다양한 혈청 배치에 대한 여러 라인을 테스트하십시오 12를 코팅하는 것으로 시작하십시오.

PBS 300마이크로리터의 피브로넥틴이 제곱센티미터당 5마이크로그램인 웰 플레이트는 각 웰의 표면을 완전히 덮어야 합니다. 세포 배양 후드에서 뚜껑을 덮지 않은 상태로 플레이트를 건조시킵니다. 세포 배양의 구슬 영역을 제거하려면 당겨진 유리 피펫과 메스를 사용하십시오.

그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 4-5 개의 클램프를 피브로넥틴 코팅 플레이트의 각 웰에 옮깁니다. 모든 채취가 완료되면 1ml의 EBM 2를 채취 플레이트의 장전된 웰에 추가하고 세포가 제거된 영역을 표시합니다. 그런 다음 매체를 변경하고 플레이트를 배양 후드에 다시 넣습니다.

실체 현미경에서 더 작은 박동 덩어리가 필요한 경우 이식된 영역을 피펫에 통과시킵니다. 이것은 몇 개의 박동 세포를 포함하는 작은 클러스터를 생성합니다. 문화에서.

분석할 준비가 될 때까지 매주 두 번씩 매체를 변경합니다. 먼저, 표면을 덮을 수 있을 만큼 충분한 PBS로 희석된 20마이크로그램의 피브로넥틴으로 코팅하여 4cm 정사각형의 2개의 챔버 슬라이드를 준비합니다. 유리 지지대를 사용하는 경우 20마이크로그램의 라미닌을 추가로 첨가하십시오.

앞서 설명한 바와 같이 비드 배양 영역을 분리합니다. 1ml 피펫을 사용하여 500마이크로리터의 콜라겐분해효소 튜브가 들어 있는 15ml 튜브로 세포를 옮깁니다. 세포를 15분 동안 배양하고 배양 중에 튜브를 한 번 흔듭니다.

15분 후 200마이크로리터 피펫을 통해 세포를 이동하여 덩어리가 남아 있으면 덩어리를 제거합니다. 세포를 새로운 콜라겐 분해 효소 2로 옮기고 큰 덩어리가 남지 않을 때 배양을 반복합니다. 각각 준비된 것처럼 소산이 없는 EBM 2 3밀리리터를 추가하여 소화를 끝냅니다.

튜브를 후드 아래의 가열된 랙에 보관한 다음 실온에서 4분 동안 1000배 G로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 PBS에서 0.25%트립신 EDTA 밀리리터로 동일한 초기 샘플의 세포 분획을 현탁액합니다. 다음 격렬한 구획에 있는 5 분 동안 현탁액을 배양하고, soic 산으로 없이 E BM 2의 4 밀리리터를 가진 트립신을 비활성화하십시오.

다음으로, 2.5ml 주사기에 18 게이지 바늘을 통해 현미경으로 큰 덩어리가 보이지 않을 때까지 최대 7회 통과시킵니다. 그런 다음 1000배 G로 4분 동안 세포를 원심분리합니다. 이제 셀 펠릿을 E BM 2에 재현탁하고 두 개의 웰 챔버 슬라이드에 플레이트합니다.

세포는 배양 2-3일 후에 분석할 준비가 됩니다. CMS는 여러 IPS 세포주에서 생성되었습니다. 이 라인은 초기에 필로폰 공급층에서 생성되었으며 정의된 배지를 사용하여 즉시 마트리겔에 배치되었습니다.

세포는 위상이 밝은 가장자리와 두드러진 핵을 가진 형태와 같은 인간 ESC를 보여주었습니다. 면역형광 분석은 IPS 세포가 전사 인자 T 4를 올바르게 발현하고 TRA one 60 표면 항원을 발현하는 것을 보여주었습니다. Cyto fluoro metric analysis는 전형적인 표면 다능성 항원, SS EEA 4 및 TRA one 60의 발현을 확인했습니다.

게이팅 전략은 왼쪽 분산형에 표시되어 있습니다. 매트릭스 겔 상에서 성장한 IP FS 세포의 핵형 분석도 수행했습니다. 심장 계통으로의 유도는 IPS 세포가 ebs로 응집되는 것과 함께 특정 유형의 혈청이 있는 곳에서 배양함으로써 촉발되었습니다.

그리고 소르빈산의 수축 면적은 사용된 세포주에 따라 전체 배양액의 20-35%를 차지했습니다. 수축 CMS는 효소 분해에 의해 이러한 영역에서 분리되고 단백질 발현에 대해 분석되었습니다. R-T-P-C-R은 IPS 유래 박동 세포에서 발현되는 심장 특이적 이온 채널의 발현을 발견했지만 비박동 세포에서는 발현되지 않았습니다.

이러한 채널에는 알파 1, 전압 의존성 칼슘 채널의 서브 유닛, 유형 5 전압 게이트 나트륨 채널의 알파 서브 유닛, 서브 패밀리와 같은 KQT의 칼륨 전압 게이트 채널 및 두 가지 형태의 미오신 (myosin)이 포함되었습니다. 중쇄 면역형광 분석은 단일 IPS 유래 심근세포가 구조 단백질, 알파 육종, 액틴, 심장 트로포닌 I 및 심장 특이적 접합부인 conexion 43을 발현하는 것을 밝혔습니다. 결국, 이 기술은 심근 질환의 체외 모델링을 위한 길을 열었으며 인체에 약물을 주입하지 않고도 인간 환경에서 약물 실험을 가능하게 했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 IPS 세포를 free free 상태로 유지하고 배아체 응집체를 기반으로 하는 방법을 통해 심근세포로 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.