Name: 인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 배우세요 피더 없는 조건에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 심근세포로 분화하는 방법을. 배아체 형성과 젤라틴 코팅 배지를 활용한 이 프로토콜은 심장 질환 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

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BS는 밀라노 비 코카 여름 학생 연구 교육 프로그램의 대학에 의해 지원되었다; 연구는 건강와 이탈리아 교육부의 대학 및 GC에 대한 연구 폰다 치오 Humanitas의 이탈리아 정부의 자금 지원, 우리는 비판적를 읽는 마이클 VG Latronico 감사 원고.

1. 인간의 IPS 세포 라인 피더 무료 유지 보수 및과 Passaging <ol><li> 마트 리젤 코팅 접시를 준비합니다. 해동 한 한 시간 얼음에 인간의 ESC 자격을 갖춘 매트릭스의 유리 병 25 ML DMEM-F12 배지에 희석. 얼음에 모든 것을 유지하고 모든 접시와 튜브 사전 냉각되도록 각 35mm 플레이트 (또는 다른 접시를 사용할 경우 면적 당 상응하는 금액)에 1 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li></ol> 참고 : Matrigel의 재고 농도 배치에 따라 다릅니다. 희석 지침은 데이터 시트에 표시됩니다. <ol start="2"><li> 밤새 얼음 접시를 유지하고 다음날 얼음 제거합니다. 플레이트는 사용하기 전에 1 주일 냉장고에 보관하실 수 있습니다. </li><li> mTESR1 완전 배지 (또는 Nutristem 매체의 병을 해동) 아래 표에 따라 H-ESM을 (인간의 ESC 매체)를 준비. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H- ESM </td><td> 최종 CONC </td><td> 500 ML에 대한 </td></tr><tr><td> 녹아웃 혈청 교체 (KSR) </td><td> 20 % </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 개 mm </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> MEM 비 필수 아미노산 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 100 U / ㎖ - 0.1 MG / ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 2 머 캅토 에탄올 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 900 μL </td></tr><tr><td> B27 보충 - VitaminA없이 </td><td> 1 % </td><td> 10 ㎖ </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> 1 % </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 DMEM </td><td> - </td><td> 370 ML </td></tr></tbody></table> 주식 매체는 더 이상 2보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 전체 성장 매체를 준비하려면, 기본 FGF 그냥 befor에 추가됩니다20 NG / ML의 최종 농도에서 전자 먹이. </li></ol> 참고 : 마우스 배아 섬유 아세포 조건으로 H-ESM 전체가 IPS 세포 대신에 mTESR1 또는 Nutristem의 사용할 수 있습니다. <ol start="4"><li> 과 Passaging 전에 30 분 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 코팅 접시를 놓습니다. </li><li> 세포들은 합류에 도달하지 않은 경우에도 약 5 일마다 계대해야합니다. 식민지 감동 할 수 없습니다. </li><li> 디스 파제 (dispase) 1 ㎖ (1 ㎎ / ml의 PBS에서 10 MG / ML 주식에서 분해)와 함께 성장 매체를 교체하십시오. </li><li> 뽑아 유리 파스퇴르 피펫과 지역을 차별화 제거합니다. 제거해야 지역은 식민지의 중앙에 분화구처럼 또는 낭성 구조를 포함하고, 세포가 한 모든 영역 식민지로부터 분리 평평하게 바깥쪽으로 마이그레이션 될 것으로 보인다. </li><li> 식민지 테두리가 밝게되고 (보통 5-7 분 정도) 분리 시작할 때까지 문화 후드 아래 37 ° C에서 알을 품다. DiscarD 디스 파제 (dispase). 1 ML H-ESM, 세척 버린다. </li><li> 1 ML H-ESM에서 수확 식민지 세포 기중기 (스크레이퍼 주걱 등)를 사용하고 15 ML 에펜 도르프 튜브에 수집합니다. 1 ML H-ESM 헹군 후 튜브에 추가합니다. 4 분 1,000 RCF에서 회전 및 뜨는을 제거합니다. </li><li> 1 ML 미리 예열 성장 매체 (중 mTESR1 또는 Nutristem)에서 펠렛을 Resuspend. 너무 많은 덩어리를 깨는 방지 - 피펫 아래 적은 6 배속보다. 얼마나 많은 세포가 도금 수 있으며 1:5 2 판에 대한 예를 들어 불필요한 세포를 (보통 1:4 1시 5분 희석) 제거해야 결정, 600 μl를 제거한 다음 1.6 ML 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 접시에서 Matrigel을 제거합니다. 장소 세포는 접시에 고르게 배포, 드롭 들러. 이 세포는 중심을 향해 이동하게되므로, 지나치게 튜브를 흔들어 마십시오. </li><li> 판 사이 1 ML 매체 및 분할에 관을 씻으십시오. 각 판의 최종 부피는 1.5 -2 ML해야합니다. </li><li> 과 Passaging 이후 하루를 제외하고 매일 매체를 변경합니다. 그것은 있지만더 이상 2 ~ 3 일 이상은 능성 또는 분화 가능성에 영향을주지 않고 마지막 구절 경과 한 경우 매체 일상을 변경할 이상이 때때로 한 번씩 이틀 주파수에서 변경 될 수 있습니다. </li><li> 세포주 동결해야하는 경우, 2 ㎖ 피펫과 장소 1 ML / cryovial을 사용하여 1-2 ML mFreSR 동결 매체 대신에 다시 일시 중지합니다. -80 cryobox에서 개최 튜브 ° C ~ 4 일 액체 질소로 전송. </li></ol> 참고 : IPS 세포의 수동 microdissection을이 입체 현미경 하에서 수행되어야합니다. 그들은 가열 면적에 보관하는 동안 입체 현미경과 통합 체외 수정 (IVF) 워크 스테이션 (예 KSystem에서 IVF 워크 스테이션) 무균 상태에서 세포의 조작을 할 수 있습니다. 이 사용할 수없는 경우, 입체 현미경은 정기적 층류 후드 아래로 이동 할 수 있습니다. 2. 배아 체 집계 및 심장 InductioN <ol><li> 아래의 표에 따라 EBM-20 매체를 준비합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> 최종 CONC </td><td> 500 ML에 대한 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (원산지 남미) </td><td> 20 % </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> MEM은 비 필수 아미노산 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 100U/ml - 0.1 MG / ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 2 머 캅토 에탄올 </td><td> 50 ㎛ </td><td> 450 μL </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ML </td></tr></tbody></table> 남미 출신의 FBS의 사용은 분화 효율을 결정하는 중요 : 세라의 다른 유형의 고용에 영향을 미칠 수 있습니다분화 과정. 50 μg / ML의 최종 농도에 완전한 EBM-20, 추가 아스 코르 빈산 (AA)를 준비합니다. 전체 성장 매체는 더 이상보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 수확의 IPS 식민지는 (단계 1.6-1.9) 위 설명했다. </li><li> 2 ML의 피펫 1 ML EBM-20에 부드럽게 resuspend을. 너무 많은 수풀을 파괴 방지 - 입체 현미경 하에서 식민지의 크기를 검사 더 2 배 이상을 피펫하지 않고. 1:1 비율에서 매우 낮은 부착 플레이트에 플레이트 (35mm 요리에 대한 예는 6 잘 플레이트 잘 사용 1). 1 ML EBM-20와 튜브를 세척하고 플레이트에 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 식민지의 크기는 효율성과 심장 유도 타이밍을 조절, 분화 과정에 영향을 미칩니다. 균일 크기 사채의 집계 분화 동안 관찰 변동성을 줄이기 위해 표시되었습니다. <ol start="4"><li> 3 일에 다시 방지하기 위해 현미경을 사용하여 EBM-20 번 변경사채의 제거율. 접시의 가장자리에 가까운 피펫, 그리고 매체를 제거하십시오. </li><li> 하루에 7 스위치 사채에 0.1 % 젤라틴 이전에 30 분 동안 37 ° C에서 배치로 코팅 접시에. 필요한 경우, 젤라틴은 세포 배양 후드를 제거하고 접시 남아있을 수 있습니다 O / N. 35mm 접시 당 35-40 사채를 추가합니다. </li><li> 일주일에 두 번 영역 및 변경 EBM-20을 상회을 위해 사채를 확인합니다. 입체 현미경 하에서 그들이 현지화를 촉진하기 위하여 박동 영역이 접시 덮개의 상단에있는 위치를 표시합니다. 계약 지역은 대략 10-20 일 후에 나타납니다. </li><li> 자연 수축을 가진 지역이 나타납니다 (대신 2 % FBS와 EBM-20과 같이 준비) EBM-2 배지를 전환하고 그들과 같은 제 3의 아래에 설명 격리합니다. 때 </li><li> 치고 치고 지역은 추가 실험을 위해 필요할 때까지 일주일에 두 번 매체 변화에 대한 다른 영역을 확인하기 위해 계속합니다. </li></ol> 참고 : 분화 과정의 효율성에 크게 의존여러 가지 요인, 그 중 가장 중요한이 심장 분화를 유도하는 데 사용되는 특정 세포 라인과 혈청의 배치입니다. 가장 높은 효율을 얻으려면, cardiomyogenic 잠재력과 혈청의 다양한 배치에 대한 테스트 셀 라인. 3. 지역 분리 및 문화를 치고 <ol><li> 코트 12 - 웰 플레이트 (4cm 2 영역) 또는 5 ㎍ / cm 2 피브로넥틴과 관심의 플레이트 (12 잘 접시에 잘 당 300 μL 총) 완전히 전체 표면을 커버하기에 충분한 볼륨을 만들기 위해 PBS에 희석. 세포 배양 후드에서 발견 유지하고 건조 할 수 있습니다. 플레이트는 4시에 싸여 저장할 수 있습니다 ° CO / N. </li><li> 필요에 따라 유리를 사용하여 영역을 치고 제거는 파스퇴르 피펫과 메스를 당겼다. 1 ML의 피펫과 fibronectin의 코팅 플레이트로 전송합니다. </li><li> 1 ML EBM-2를 추가합니다. </li><li> 세포가 제거 된 영​​역을 표시하고 매체를 변경하는 접시를 교차. 다른 지역은 B를 시작할 수 있으므로 플레이트는 1 개월로 유지 될 수나중에 먹는. </li></ol> 참고 : 작은 치는 덩어리가 필요한 경우는 작은 조각으로 분해 될 때까지, 실체 현미경 아래에서 몇 시간을 explanted 영역을 피펫. 이 작업은 몇 박동 세포 (동영상 3 참조)의 클러스터가 발생합니다. <ol start="5"><li> 분석을위한 준비가 될 때까지 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. </li></ol> 참고 :이 프로토콜에서 얻은의 Cardiomyocytes는 태아와 같은 형태 및 기능적 특성을 가지고, 어른 표현형으로 성숙은 더욱 이러한 세포를 차별화하는 문화에 시간을 증가시켜 얻을 수있다. 4. 한 잔 세포 분리 및 분석 <ol><li> 코트 2 챔버 슬라이드 (4cm 2 영역) 또는 전체 문화 표면을 커버하기에 충분한 PBS에 희석 5 ㎍ / cm 2 피브로넥틴과 다른 적절한 지원합니다. 유리 지원을 사용하는 경우, 라미닌 및 피브로넥틴과 코트 (5 ㎍ / cm &lt;&gt; 2에게 각)을 먹다. </li><li> 제 3의 플레이트에서 파스퇴르 피펫 / 메스 지역을 치고 제거합니다. </li><li> 1 ML 피펫, 부화 기간 동안 한 번 튜브를 흔들어 500 μL 콜라 II (MG와 CA와 PBS에서 480 U / ㎖) 37 부화 15 분 ° C를 포함하는 15 ML 튜브로 전송 세포를 사용. </li><li> 200 μL 피펫 아래로 피펫. 어떤 덩어리가 남아있는 경우, 신선한 콜라 II에 전송하고 4.3 단계를 반복합니다. </li><li> 더 큰 덩어리가 남아 없을 때까지 단계 4.4를 반복합니다. </li><li> 3 ML EBM-2 (없음 AA)과 콜라를 비활성화합니다. 다른 튜브는 준비가 될 때까지 튜브는 다음 가열 랙의 후드 아래에 남아있을 수 있습니다. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 을 Resuspend 펠릿 1 ML 0.25 % 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1X PBS에 0.​​5 % 주식에서 희석) 등을 배양한다. 같은 초기 샘플에서 digestions의 분수를 결합합니다. </li><li> 4 ML EBM-2 (없음 AA)와 트립신을 비활성화. 더 t없는 2.5 ML의 주사기에 18G 바늘을 통해 세포를 통과한 7X. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 을 Resuspend 세포 펠렛 당 잘 플레이트 1 ML EBM-2인치 세포는 2-3 일 도금 후 기능적, 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다. </li></ol>

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</ol>

공개 할 재정적 이해하지 않습니다.

pluripotent 줄기 세포 라인 사이에 낮은 효율과 높은 변동성이기는하지만, CM을에 자발적으로 분화 할 수있는 잠재력이있다. 새로운 유도 방법의 개발은 따라서 프로세스의 효율성을 개선하고 더 많은 정의 된 프로토콜을 향해 이동에 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 새로운 차별화 방법의 대부분은 정교한 배양 조건, 타이밍 및 시약의 농도의 미세 조정, 고가의 사이토 카인과 성장 인자 치료를 필요로하는, 매우 복잡하다. 또한, 다양한 만능 줄기 세포 라인의 내인성 사이토 카인 신호 레벨의 차이가 어렵 종종 각각의 세포 라인에 대한 적절한 수준으로 조정해야합니다 사이토 카인의 농도를 표준화 렌더링합니다. 얻어진 IPS-파생 CMS를 성숙은 질병 모델링 및 약물 발견 응용 프로그램의 IPS 세포의 심장 차별화를 시도 할 때 고려해야 할 중요한 측면을 나타냅니다. differentiat인간 줄이고 ESCs 및 IPS 세포의 이온은 일반적으로 완전히 성숙 구조없이 태아의 ...

역사적으로, 인간 발달과 질병을 운전 유전 및 분자 메커니즘 연구는 유전자 변형 동물 모델의 생성에 기초하고있다. 그러나 수많은 인간의 표현형이 성공적으로 주로하기 때문에 두 종족 사이에 존재하는 생물학적 차이, 생쥐 복제에 실패합니다. 반면에, 인간의 조직에 대한 액세스를 제한 할 수 있으며, 자주 자료가 심도있는 실험 연구를 취득 할 수 없습니다. 심장 혈관 생물학 분야는 이러한 제한을 모두 앓고 : 인간의 마음의 생리는 마우스의 그것과 크게 다르고, 심장 조직의 상당한 수량은 사후 또는 심장 수술 동안 액세스 할 수 있습니다. 기능 인간의 CMS 분화 최적의 소스를 찾기 때문에 심장 혈관 생물학의 중심 화제가되고 있으며, 많은 노력이 문제를 해결하기 위해 만들어졌다. 다양한 세포 유형은 내가 제안되었다ncluding 골격 근모, 지역 심장 줄기 세포, 골수 단핵 세포, 내피 전구 세포와 중간 엽 줄기 세포. 그러나 데이터는 4 일치되지 않은 이러한 세포를 사용하여 얻었다. 인간 배아 줄기 세포 (ESC)의 유도는 처음 5 야마나카와 톰슨 6,7에 의해 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포의 획기적인 발견은 나중에 솔루션을 제공 할 듯 : 이러한 세포주기 위하여 무한정 성장 능력과 잠재력을 가지고 CMS를 포함한 세 가지 배엽의 세포 파생 상품에 상승. IPS 세포의 사용이 더 장점을 제공합니다 :자가 성인 세포에서 파생 된을, 그들은이 파생되는 개인 또는 환자와 같은 게놈을 가지고 다니십시오. 그러므로 그들은 인간의 유전 질환 및 개발 메커니즘의 조사를 용이하게 체외 모델의 개발을 할 수 있습니다. 이러한 특성 덕분에, IPS 세포는 O를 할 수 있습니다면역 거부 및 윤리적 문제 8에 관한 vercome 문제. 줄이고 ESCs는 여전히 줄기 세포 생물학 분야의 황금 표준을 표현하더라도 이러한 이유로 들어, 연구자들은 전세계는 이제 만능 줄기 세포 기술쪽으로 더 이동하고있다. IPS 세포는 현재 선천성 심장 질환 9,10 등 다양한 조건에 대한 체외에서 인간의 질병을 모델로 채택되고있다. 최근의 IPS 세포 질병 모델링 응용 프로그램은 단일 유전자 심장 질환 (즉, 긴 QT 증후군, 카테콜아민 다형성 심실 빈맥)과 심장 결함이 복잡한 표현형 (예 : 레오파드와 티모시 증후군, 확장 성 심근증)의 일부가되는 병리에 대해 수행되었다. 이 보고서는 CM을로 분화되어 환자 특정 만능 줄기 세포가 생체 내에서 질병으로 유사한 표현형과 기능적 특성을 표시 함을 확인 하였다. 그러나,심장 계통에 만능 줄기 세포를 유도 효능을 개선하기 위해 여전히 많은 도전이 있습니다. 골재 형성을 통해 인간 줄이고 ESCs에서 CMS를 자연 발생은 배아 체는 (사채) 성공 17 입증했다. 이 발견 이후, 많은 다른 방법이 제안되었다. 여러 그룹이 크게 분화 프로토콜의 효율성을 향상하고 (무언극을 참조 C., 외., 기존의 모든 방법 3의 종합적인 검토를위한 순환 연구 (2012) 화학적 및 동물 제품 무료 문화 시약쪽으로 이동 한 ). 그럼에도 불구하고, EB 집계에 따라 고전적인 방법은 여전히​​ 가장 일반적으로 기능 연구를 수행하고 질병의 메커니즘을 조사에 대한 고용을 나타냅니다. 제안 프로토콜은 심장 분화 과정을 개선하기 위해 표시되었습니다 혈청 아스 코르 빈산의 존재 사채에 IPS 세포의 집단 문화와 포에 근거sitively 이러한 세포 18,19의 성숙에 영향을 미칠. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 방법을 통해 이동하고 환자 특정 IPS-파생 CM을 생성을위한 장치가없는 만능 줄기 세포 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and Reagents</td></tr><tr><td>Human ESC 인증 Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>5ml 병을 4°C에서 해동; 얼음 위에 C O/N, 데이터 시트 희석 지침에 따라 얼음 위의 미리 냉각된 극저온 튜브에 부분 표본을 넣고 -20°C에 보관하십시오. 씨 .</td></tr><tr><td>피브로넥틴, 인간 혈장에서, 0.1% 용액</td><td>시그마</td><td>F0896-2MG</td><td>작업 농도: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>작업 농도: 5 & g/cm2</td></tr><tr><td>PBS(Mg 및 Ca 없음), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS(mg 및 Ca 포함), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, 중성 프로테아제, 등급 II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>재고: -20°C에서 DMEM-F12에서 10mg/ml; C, 작업 용액 : PBS (Mg / Ca 없음)</td></tr> <tr><td>트립신 / EDTA, 0.5 %</td> <td>시그마</td><td>T3924</td><td></td></tr> 콜라겐 분해 효소 유형 2 Worthington 4176 Mg 및 Ca <tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr> 녹아웃 <tr><td></td><td></td><td></td> 혈청과 <td>함께 PBS에서 480 U / ml (><예 : 1.6 mg / ml)로 희석</td></tr><tr><td> 교체 (KSR)</td> <td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>4 &deg에서 해동; C, 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>F&#8211; tal Bovine Serum (원산지 남미)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>배치는 심인성 가능성을 테스트해야 합니다. 4 &deg에서 해동; C, 56 &deg에서 열 비활성화; C 30분 동안 분취 및 -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>PenStrep, 페니실린-스트렙토마이신, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캡트&#8211; 돼지</td> 피부 시그마 G1890-100G에서 탄 <td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td></td><td></td>, <td>물에 있는 1%에 주식을 만들고, -20°C에 저장하십시오. PBS에서 0.1%에 묽게 하고 4°C에 유지하십시오; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Supplement 5X를 염기성 배지와 결합하고 분취 및 -20°C에서 보관합니다. 완전한 매체를 4°C로 유지하지 마십시오. C 1 주 이상</td></tr><tr><td>영양 줄기 hESC XF</td><td>Stemgent Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>4 &deg에서 해동; C O/N, 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C를 사용할 때까지. 부분 표본은 4 &deg로 유지 될 수 있습니다. C는 일주일 이상 지속되지 않습니다.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>물에 10mg/ml로 재고를 준비합니다. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. 어둠 속에서 C. 최종 농도(500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm 배양 접시</td>에서 EBM에 추가 <td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>유리 2웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트, 초저 부착 표면</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G 니들</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫, 230mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2.5ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</td></tr><tr><td>IVF 워크스테이션</td><td>KSystem, by Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

심장 개발을 운전 사건을 조사하고, 인간의 심근 질환에 이르는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 기능적 인간의 심근 (CMS)를 생성하는 첫 번째 필수입니다. 약물 발견 및 독성학 연구에서 이러한 세포의 사용은 또한 인간의 기원 세포 사전 임상 적 유효성을 검사 할 심장 질환의 치료를위한 새로운 약물 분자를 허용, 매우 도움이 될 것입니다. CMS를 수있는 소스, 유도 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포들이 쉽게 접근 환자의 조직에서 직접 파생 될 수있는, 가장 유망한 사이이며, 본체 (1)의 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 고유의 능력을 가지고있다. 여러 가지 방법이 화학적으로 정의 된 프로토콜 2,3에 고전 배아 체에서 (사채) 집계 방식에 이르기까지, CM을에 IPS 세포 차별화를 위해 제안되었다. 이 문서에서 우리는 사채 기반 프로토콜을 제안하고 보여주는 방법이 METHOD를 효율적으로 장치가없는 IPS 세포의 기능 CM과 같은 세포를 생성하기 위해 사용 할 수 있습니다.

우리의 연구에서 우리는 몇 가지 만능 줄기 세포 라인에서 CM을 생성. 이 라인은 처음 MEF 피더 레이어에서 생성되었지만 바로 정의 매체 (mTESR1 또는 Nutristem 중 하나)을 사용하여 리겔에 배치했다. 다양한 분석은 형태 학적 특성, 만능 세포의 일반적인 마커의 발현 (10 월 4 SSEA4 및 TRA1-60)과 유전체의 안정성 (그림 1)의 유지를 확인하는 데 사용되었다. 심장 계통에 유도는 사채 및 혈청 AA (그림 2A와 2B)의 특정 유형의 면전에서 문화로 유도 만능 줄기 세포의 응집에 의해 실행되었다. 계약 영역 (그림 2C와 영화 1) 사용되는 세포주에 따라 총 20~35%을 나타낸다. 계약 소화 효소 (동영상 2)에 의해이 지역에서 분리 된 CMS는 일반적으로 심근 구조 단백질 (심장 트로포 닌 &amp; ALPH 표현, - sa...

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

이 절차의 전반적인 목표는 피더 프리(feeder free) 조건에서 배양된 인간 IPS 세포로부터 인간 심근세포를 분화시키는 것입니다. 이는 먼저 IPS 세포를 초저부착 플레이트에 플레이팅하여 배아체(embryo bodies)를 형성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 형성된 배아체를 젤라틴 코팅 디쉬로 옮기는 것입니다.수축 부위가 나타나면, 입체 현미경 하에서 이를 수동으로 박리하여 피브로넥틴이 코팅된 디쉬에 도말합니다. 추가 분화를 위해, 마지막 단계로 효소 소화를 통해 수축 클러스터로부터 단일 심근세포를 얻습니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 심장 트로포닌과 같은 전형적인 구조적 마커를 발현하는 심근세포 유사 세포의 분화 결과를 확인할 수 있습니다.이 방법은 인간 심근세포 수준에서 심장 발달 및 질환 중 심장 분화와 기능 장애를 유발하는 메커니즘은 무엇인지와 같은 심혈관 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 인간 환자 및 일반인으로부터 체외에서 심근세포를 생성할 수 있게 해주므로 매우 흥미로운 기법입니다. 또한, 시험관 내에서 질병을 재현함으로써 생체 내 실험에 들어가기 전 체외에서 새로운 약물을 실험할 수 있게 해줍니다.실험은 35 millimeter matrigel 코팅 플레이트에서 배양한 합류 상태의 IPS 세포 배양물로 시작합니다. 성장 배지를 1 mg의 diss가 포함된 1 mL의 PBS로 교체합니다. 연마된 유리 피펫을 사용하여 세포를 관찰합니다.콜로니 중심부의 분화된 세포 영역(분화구 모양 또는 낭성 구조 등)을 제거하십시오. 또한 세포가 분리되어 편평해지고 외부로 이동하는 것처럼 보이는 모든 영역도 제거하십시오. 이제 남은 세포를 배양 후드 내 37 °C에서 콜로니 경계가 더 밝아지고 떨어지기 시작할 때까지 배양하십시오.이 과정은 보통 5분에서 7분 정도 소요됩니다. 이 단계에서 dispa 용액을 제거하고 1 mL의 HESM로 세포를 세척합니다. 그 다음 세척액을 버립니다.새로운 HESM 1 mL를 사용하여 셀 리프터로 콜로니를 수확합니다. 수확한 콜로니를 15 mL 튜브에 모읍니다. 다음으로, HESM 1 mL로 세포를 헹구고 1000 ×g에서 4분 동안 원심 분리하여 침전시킵니다.그 다음 매트리젤(matrigel) 위에 세포를 도말하고 배양 기간 동안 매일 배지를 교체합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 미분화 IPS 콜로니를 수확하는

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

in vitro에서 만능 줄기 세포에서 심근 세포를 생성하면 기초 과학 및 임상 응용을 위해 많은 양의 in vitro 심장 조직에 접근할 수 있습니다.  이 프로토콜은 심방화 인자 Grem2를 사용하여 얻은 심근세포의 수를 증가시키고 심방 표현형을 가진 심근세포를 생성합니다.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

배우세요 피더 없는 조건에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 심근세포로 분화하는 방법을. 배아체 형성과 젤라틴 코팅 배지를 활용한 이 프로토콜은 심장 질환 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

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