Name: Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 학습하세요 메틸트랜스퍼레이즈를 이용한 DNA와 단백질의 서열 특이적 라벨링 방법을. 합성 보조인자 유사체를 활용한 1단계 및 2단계 라벨링 기술로 생체분자 상호작용 연구를 강화하세요.

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저자는 MTases M.BseCI 및 Set7/9를 준비한 Kerstin Glensk에게 감사를 표하고 독일 연방 및 주 정부의 Excellence Initiative와 RWTH Aachen University의 자금 지원에 감사를 표합니다. 저자는 공동 연구를 위해 6BAz 및 SeAdoYn 또는 기타 보조 인자 유사체를 제공하게 되어 기쁩니다.

1. 일반 지침 <ol><li> 저장 아지리 공동 인자 (DMSO)에 6BAz 단백질 MTase -80 ° C에서 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 및 DNA MTase M.BseCI -20 ° C에서 (50 % 글리세롤)를 포함하여 다른 모든 시약. </li><li> 탈 이온수에 멸종 계수 ε 269nm (6BAz) = 16,000cm -1 M -1 ε 260 나노 미터 (SeAdoYn) = 15,400cm -1 M -1을 사용하여 UV / 마주 분광법을 통해 6BAz과 SeAdoYn의 농도를 결정합니다. 흡광 계수가 가능한 경우 280 nm에서 흡수를 통해 직접, 브래드 포드 분석으로 MTases의 농도를 결정하거나. </li><li> 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 집중적 인 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 기포를 생성하지 않도록하십시오. 대신 부드럽게 피펫 아래로 섞는다. </li><li> DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 분석에서 최종 DMSO 농도가 작다는 것을 확인5 % 이상. 항상 DNA와 비특이적 인 반응을 방지하는 분석 완충액에 10 mM의 마그네슘 이온을 포함한다. </li><li> 산성 원액에서 더블 활성화 공동 인자를 추가 할 때 pH 변화를 방지하고 분석 용액의 pH가 크게 변화하지 않도록 작은 볼륨 (고농축 원액)를 사용합니다. 그들이 필요한 구리 이온의 착물에 의한 클릭 반응을 방해 할 수 있기 때문에 분석 버퍼에 티올, 예를 들면, β-머 캅토 에탄올 또는 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 피하십시오. </li></ol> 아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA 2. 한 단계 라벨링 <ol><li> 순서 특정 메틸화 된-유도 레이블 ING M.BseCI DNA MTase 및 아지리 공동 인자 6BAz와 플라스미드 DNA의 (미소). <ol><li> 20 ° C에서 조효소 용액을 얼음 위에서 해동하고, 반응 혼합물을 준비한다. </li><li> 분석뿐만 아니라 비 특정 수정 및 &amp; #를 시각화, &quot;보조 인자 (cofactor)&quot;제어를 수행8220; 효소 &quot;제어, MTase 준비가 자연 보조 인자 (cofactor)의 AdoMet이 없는지 확인합니다. </li><li> 10 배 변성 버퍼 세이 믹스 2㎕의 옵션 (100 mM 트리스 - 염산을 함유하는 100 mM의의 MgCl 2, 20 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, pH를 7.4) 인 pBR322 (0.5 ㎍ / μL), 10 당량의 2 μL. DNA상의 인식 서열 (나 pBR322 1 인식 서열) 및 20 μL의 총 부피 내 60 μM의 최종 농도 아지리 딘 보조인 6BAz 당 M.BseCI. 보조 인자 및 DNA MTase 마지막에 추가합니다. 참고 : β-메르 캅토 에탄올은 독성, 부식성과 환경 파괴입니다. </li><li> &quot;보조 인자 (cofactor)&quot;제어를 위해 대신 6BAz의 탈 이온수를 추가하는 대신 M.BseCI과 &quot;효소&quot;제어를위한 탈 이온수를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 1 시간 동안 55 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다. </li></ol></li><li> 제한 - 수정 분석은 DNA 변형을 확인합니다. <ol><li> 80 ㎕의 탈 이온수 중 3.3 μL (100 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의의 MgCl 2, 1 M의 NaCl, 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, pH가 8.0을 함유) 10 ㎕를 10 배 R.TaqI 완충액을 혼합하여 용액을 제조 제한 효소 테르 무스 aquaticus에서 (REase) (R.TaqI, 10 U / μL). 마지막 단계에서 REase를 추가해야합니다. </li><li> 2.1.7 각 튜브에 R. TaqI은 버퍼 10 배의 2 μL 이상 (2.2.1)에서 솔루션의 28 μl를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 30 분 동안 65 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다. </li></ol></li><li> 스트렙 타비 딘과 전기차 변화 분석 (EMSA)의 기능 변경을 확인합니다. <ol><li> 각 튜브 (2.2.5)에서 25 μL를 제거하고 스트렙 트 아비딘 m에 대하여 스트렙 트 아비딘 용액 (1mM이 2.4 μl를 추가100 mM의 onomer 나 2 HPO 4를 함유하는 스트렙 타비 딘 완충액, 100 mM의 염화나트륨, pH가 7.5; 총 비오틴의 4 당량). 나머지 튜브에 스트렙 타비 딘 버퍼의 2.4 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 모든 튜브 부화. </li></ol></li><li> 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 분석. <ol><li> 각각의 튜브에 6 배 로딩 버퍼 (블루 0.25 % 브로 모 페놀, 30 % 글리세롤)의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 솔루션을 섞는다. </li><li> 로드 (10000 스톡 용액으로부터 1X GelRed 함유 0.5X TBE 버퍼를 1 % 아가 로즈) 아가로 스겔의 웰에 각 시료 10 μL. </li><li> 약 80 V와 0.5 배의 TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다. 1 시간. </li><li> 필터 (540 ± 50 ㎚)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서 DNA 밴드를 시각화. 참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다. </li></ol></li></ol> 더블 활성화의 보조 인자 (cofactor)를 통해 3. 2 단계 단백질 라벨링 <ol><li> Methyltransf히스톤 H3 라이신 4 라벨 (수정 단계)에 대한 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 활성화 그룹 (MTAG)의 전송을 삭제-감독. <ol><li> 부품을 녹여 얼음에 반응 혼합물을 준비한다. 참고 : 항상 SeAdoYn이 저하를 방지하기 위해 냉각 유지. </li><li> 분석 이외에 비 특정 변형을 시각화, &quot;보조 인자&quot;제어를 수행하고, &quot;효소&quot;제어는 형광 프로브의 비특이적 반응을 제외 할. </li><li> 분석 용액 (20 μL) 변성 완충액 (50 mM Tris-HCl, 5 % 글리세롤, pH를 8.5), 10 μM 히스톤 H3, μM Set7 / 9 10 600 μM SeAdoYn (셀레늄 모두에서의 에피 머 혼합물)를 함유 준비. 마지막 단계에서는 다음 보조 인자 (cofactor) 및 MTase를 추가합니다. </li><li> &quot;보조 인자 (cofactor)&quot;제어 3.1.3에서와 같이 분석 솔루션을 준비하고 합성 보조 인자 (cofactor)와 경쟁하기 위해 60 mM의 AdoMet를 추가합니다. &quot;효소&quot;제어를 위해 대신 SeAdoYn의 탈 이온수를 추가합니다.</li><li> 서서히 상하로 피펫 팅하여 혼합 용액. 산도 스트립 (- 10의 pH 범위 5)의 상부에 각 필드 액 1 μl를 첨가하여 pH를 확인한다. </li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 한편 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조 (실행 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스의 pH 6.5-6.8, 0.1 % (/ V) APS w, 0.04 % (v / v)의 TEMED 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1 ;로드 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스 6.5-6.8 pH가 0.1 % APS (/ V w), 0.04 % (v / v)의 TEMED 5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1). 참고 : 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드는 유해 독성 및 건강이다. 이 절차를 수행하는 동안 장갑을 착용 할 것. </li></ol></li><li> 구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) (라벨 단계)를 통해 히스톤 H3의 alkinylated 라이신 (4) 화학 라벨. <ol><li> 다만 변성 반응의 종료 이전 3mM의 CuSO 4, 3 mM의 트리스 (3- 히드 록시 프로필 - triazolylmethyl) 아민 (THPTA), 250 mM의 나트륨 아스 코르 베이트 및 6 mM의 TAMRA 지드를 함유 5X 클릭 믹스를 조제20 μL의 총 부피. </li><li> CuAAC를 시작하고 수정 반응을 해소하기 위해 각 튜브에 새로 제조 한 5 배 클릭 믹스의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 피펫 팅 아래로 부드럽게 섞는다. </li><li> 형광의 사진 표백을 방지하기 위해 빛 알루미늄 호일 모든 튜브를 보호합니다. </li><li> 1 시간 동안 20 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 단백질 침전 무료 TAMRA의 형광 초과를 제거합니다. <ol><li> (34) - 무료 TAMRA의 형광의 집중적 인 겔 형광에 의한 형광 표지 된 히스톤 H3의 빛나며을 방지하기 위해, 단백질 (3.3.4 3.3.2)의 침전에 의해 초과 형광을 제거합니다. </li><li> 75 μL 메탄올, 18.8 μL의 클로로포름 간략하게 각 추가 후에 각각의 튜브와 소용돌이에 탈 이온수 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 단백질을 포함하는 계면 층을 방해하지 않고, 상부 상을 제거한다. </li><li> 나머지 단계로 56.3 μL 메탄올을 추가 난n은 5 분 16,000 XG에 각 튜브, 소용돌이와 원심 분리기는 단백질을 펠렛. 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 씻어이 단계를 반복합니다. </li><li> 보풀이없는 티슈로 열린 관을 덮고 15 그들을 말리면 - 30 분. </li></ol></li><li> SDS 페이지를 통해 분석. <ol><li> (20 μL SDS 로딩 완충액 (50 mM Tris-HCl, 2.5 % (w / V) SDS, 10 % (v / v) 글리세롤, 320 밀리미터 β 머 캅토 에탄올 및 0.05 % 3.3.4에서 침전 된 단백질을 녹이고 / w V) 브로 모 페놀 블루, pH를 6.8). 완전히 피펫 튜브의 벽을 세척하여 펠렛을 해산해야합니다. </li><li> 10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품어하고 20 ° C까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다. </li><li> SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (3.1.7)의 우물에 각 시료의 전체 양을 넣습니다. 50mM의 MOPS, 50mM 트리스 - X (트리스 - 염기), 5mM의 EDTA, 0.1 % 사용 (/ w를 V) 전기 영동 완충액으로서 실행 SDS. </li><li>약 120 V를 사용하여 젤을 실행합니다. 90 분. </li><li> 필터 (± 50 nm의 나노 540)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서의 겔 형광을 시각화. 참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 다음과 같은 경쟁 재정적 이해관계를 공개합니다. E.W.는 관련 특허의 발명가입니다.

DNA의 MTases 아지리 딘 및 보조 인자 (미소 DNA)와 DNA의 1 단계 라벨링 강력한 방법이지만 실험을 계획 할 때 일부의 측면이 고려되어야한다. 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) : M.BseCI와 DNA 라벨의 6BAz 농도가 60 μM이었다. 다른 DNA MTases 사용시 보조 인자 농도가 낮은 20 μM이 DNA MTase M.TaqI 19 채용 한 예 농도를 최적화한다. 낮은 농도 6BAz 스트렙 (분석에서 비오틴의 전체 양 중의 결합 부위)의 네 배 과량 직접 EMSA에 의해 분석을 방해하지 않고 REase 함께 인큐베이션 후에 첨가 될 수있는 이점이있다. 그렇지 않으면 과량의 비오틴 DNA 보조 인자를 제거하고, 아가 로스 겔 전기 영동시 DNA의 번짐을 방지하기 위해 정화되어야한다. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 확인하는 일의 최종 DMSO 농도E 분석은 5 % 미만이다...

핵산 1, 2, 3, 4 단백질의 특정 라벨링 기능 특성화, 의료 진단 및 (나노) 생명 공학에 대한 주요 관심의 대상이다. 여기에서 우리는 S의 -adenosyl -1- 메티오닌 (AdoMet 또는 SAM) 의존성 methyltransferases (MTases)를 기반으로 이러한 바이오 폴리머에 대한 효소 라벨링 방법을 제시한다. 효소의이 클래스 (EC 2.1.1.) 핵산 및 단백질의 특정 잔기 내의 개별 핵성 위치 (질소, 산소, 황 및 탄소 원자)를 대상으로 자연스럽게 팩터 AdoMet (도 1a) (5)의 활성화 메틸기를 전송한다. 또한, MTases 선호도 태그, 형광 또는 다른 라벨 (그림 1B) 6 특정 라벨링 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 이용할 수있다. AdoMet 유사체의 두 클래스는 개발되어 있습니다 : S의 equence 별 M의 ethyltransferase-의 I에 대한 아지리 딘 보조 인자를 L의 아벨 보내고 (미소) 7 ctivated G의 roups의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer 더블 활성화 AdoMet 유사체 (MTAG) 8. <img alt="그림 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" width="700"> 그림 1 :.. methyltransferases (MTases) DNA, RNA, 단백질과 작은 생체 분자 등 다양한 기판에 자연 보조 인자 (cofactor) AdoMet (SAM)에서 A. 메틸 그룹 전송 핵산과 단백질의 B. 레이블 / 기능화 (NNNNN = 의해 촉매 반응 단백질 RNA와 아미노산에 대한 기본 DNA에 대한 쌍, 뉴클레오티드, 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체와 녹색에서 대상 잔류 물)와 MTase의 XXXXX = 인식 서열. 리포터기를 함유 아지리 보조 인자 (파란색 영역)특히 대상 잔류 물 (왼쪽)와 더블 활성화 AdoMet 유사체와 결합 순서가 아데닌 링의 첨부하면 두 번째 단계에서 bioorthogonal 클릭 반응에 의해 표시 될 수있는 화학 기자 Y (오른쪽)를 운반하는 확장 알킬 체인 전송에지도한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 아지리 딘 보조 인자는 DNA MTases 가장 잘 작동합니다. 그들은 질소 원자 (9) (또는 N은 10, 11를 - 겨자) 대신 술 포늄 센터 반응성 그룹과 세 개의 원 고리가 포함되어 있습니다. 이 질소 원자의 양성자는 DNA와 전체 공동 인자의 결합을 공유 결합에 이르게 대상 염기에 의한 친 핵성 공격에 대한 아지리 딘 링을 활성화합니다. 아데닌 고리에 리포터 그룹을 부착함으로써 아지리 딘는 보조 인자 (하나의 단계로 DNA를 DNA MTases 라벨과 조합하여 사용될 수있다 <stron> g&gt; 왼쪽 그림 1B) 7,12. 15 (아데닌 링의 6 위치에 부착 비오틴과 아지리 공동 인자) 및 바실러스 스테아로써 모필 러스에서 아데닌 특정 DNA MTase (M.BseCI) (16) (그림 2 -이 6BAz 13 DNA의 바이오 틸 상세하게 설명된다 ) DNA의 한 단계 라벨 아지리 보조 인자를 통해 : 프로토콜 부 (2)를 참조하십시오. 헤모필루스 heamolyticus로부터 M.BseCI (ATCG 5'-T-3 '인식 서열), 테르 무스 aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3에서 DNA MTases')에 추가하여 (M.HhaI 5 'C -G GC-3') 및 Spiroplasma (M.SssI에서, G-C 5'-3 ')가 성공적 6BAz 17 DNA를 비 오티하는데 사용되어왔다. 또, 아지리 딘 조인자 한 단계 형광 DNA 라벨링 18,19 위해 사용될 수있다. </stron>ontent "fo를하는 것은 : 유지-together.within 페이지를 ="항상 "&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" width="700"> 그림 2. M.BseCI 및 6BAz와 DNA의 서열 특이 한 단계 바이오 틸은 DNA MTase M.BseCI는 이중 가닥 DNA 서열 5'-ATCG T-3 '을 인식하여 자연 번째의 아데닌 아미노기의 메틸 잔류 물 (녹색) AdoMet를 사용하여. 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz으로 반응 과정이 변경되고 M.BseCI 대상 아데닌과 비오틴 (파란색)를 포함하여 전체 보조 인자 (cofactor)를 결합하여 특정 DNA의 바이오 틸을 시퀀스 리드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 더블 활성화 AdoMet 유사체 불포화 측쇄 대신 술포 센터 메틸기 (도 1b 연장 포함 20. 술 포늄 센터 β-위치에 불포화 이중 또는 삼중 결합은 전자 공역 안정화에 의한 전이 상태 내에서 불리한 입체 효과를 보상한다. 술포 센터와 불포화 결합 모두 효소 전송 측쇄를 활성화하기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 뽑혔다. 통상적으로, 이들은 제 2 단계에서 화학 - 8,21 선택적 레이블링, 아미노, 알킨 아 지드 기 등의 고유의 화학 그룹 (화학 기자)로 측쇄를 전송하는 데 사용된다. RNA와 단백질의 추가 표시를 허용 (28) - 일반적으로 두 번 활성화 AdoMet 유사체는 RNA MTases 22, 23 DNA MTases 8,20,21에 대한뿐만 아니라위한 보조 인자와 단백질 MTases 24뿐만 아니라 작동 할 수 있습니다. 그러나, 확장 된 측쇄는 더 입체적 메틸기보다 까다 롭고 엔지니어링 자주 단백질이다 MTase 의해 활성 부위를 확대 아르EN 효율적인 전송 속도를 얻기 위해 필요한. 구리에 의한 화학적 변형을 다음 용 효소 전송 중에 전이 상태 1. 안정화 2. 반응성 핸들이 문제에 대한 또 다른 해결책은 작은 프로 파길 말단 알킨이 두 가지 기능을 제공 기 (세 탄소)와 AdoMet 유사체를 사용하는 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) 화학을 클릭합니다. 이 결과 프로 파르 길 AdoMet 아날로그 (29)는 중성 또는 약간 염기성 조건 하에서 만 사용이 제한 상당히 불안정 밝혀졌다. 이러한 결점은 셀레늄 황 원자를 대체하여 고정 될 수있다. 얻어진 보조인 5 '- [(SE) [(3- S) -3- 아미노 -3- 카르복시] 프로 프 -2- ynylselenonio] -5'- 데 옥시 아데노신 (SeAdoYn,도 3) 야생형 DNA에 의해 허용되고, RNA 단백질 MTases 30 - 많은 경우에 단백질 공학에 대한 필요성을 폐지 32. 이것은 형광의 예로는 프로 히스톤 H3 리신과 TEIN 라벨링 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: 더블 활성 보조 인자를 통해 2 단계의 단백질 표지도 3은 프로토콜 부 (3) 참조). <img alt="그림 3" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig3highres.jpg" width="700"> 도 3 :. Set7 / 9 히스톤 H3의 서열 - 특이 적 두 단계 형광 라벨링, SeAdoYn 및 TAMRA 아 지드 단백질 MTase Set7 / 9 자연스럽게 AdoMet를 사용하여 히스톤 H3에 리신 (4)의 아미노기 (H3K4, 녹색)의 메틸. 이중 활성화 보조 인자 (cofactor)로 SeAdoYn MTase은 라이신 잔기에 작은 프로 파길 그룹 (빨간색)를 전송합니다. 첨부 된 단말기 삼중 결합은 선택적으로 아 지드 - 유도 TAMRA (테트라 메틸, 파랑) 형광과 bioorthogonal 클릭 반응 (구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리, CuAAC)에서 수정됩니다.로드 / 52014 / 52014fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<table><tbody><tr><td>2012년 3월 6일 발행된 Weinhold et al., 특허 번호 US 8,129,106에 따라 합성된</td> <td>6BAz</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Serva</td><td>28625</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>10304980</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스 솔루션, 37.5:1</td><td>Serva</td><td>10688</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Serva</td><td>13375</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Gerbu</td><td>1304</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Gerbu</td><td>1115</td><td></td></tr>, <tr><td>Bromophenol blue, Na salt</td>, <td>Serva</td><td>15375</td><td></td></tr>, <tr><td>구리 (II) 황산염</td>, <td>Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr>, <tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>10020090</td><td></td></tr>, <tr><td>Coomassie, Brilliant Blue</td><td>Serva</td><td>17525</td><td></td></tr>, <tr><td>EDTA 디 소듐 염</td>, <td>Gerbu</td><td>1034</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td>, <td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>GelRed(물 속 10,000배)</td><td>비오튬</td><td>41003</td><td></td></tr>, <tr><td>글리세롤(99.5%)</td><td>Gerbu</td><td>2006</td><td></td></tr><tr><td>FastRuler 저범위 DNA 사다리</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>SM1103</td><td></td></tr>, <tr><td>히스톤 H3</td><td></td><td></td><td>Philipp Voigt 박사와 Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드; T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311에 따른 발현 및 분리.</td></tr><tr><td>M.BseCI</td><td></td><td></td><td>발현 플라스미드는 Dr. Michael Kokkinidis로부터 수득; Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14에 따른 발현 및 분리.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>10675112</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘&nbsp; 헥사하이드레이트</td><td>J.T. Baker</td><td>4003</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Gerbu</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Gerbu</td><td>1112</td><td></td></tr><tr><td>pH 스트립(중성)</td><td>Merck</td><td>1,095,330,001</td><td></td></tr><tr><td>pBR322</td><td>Thermo Scientific</td><td>SD0041</td><td></td></tr><tr><td>R.TaqI (10 u/&마이크로; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0671</td><td></td></tr><tr><td>SeAdoYn</td><td></td><td></td>은 <td>Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173에 따라 합성되었습니다.</td></tr><tr><td>Set7/9</td><td></td><td></td><td>Danny Reinberg 교수로부터 얻은 발현 플라스미드, D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489에 따른 발현 및 분리.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Gerbu</td><td>3058</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodium L-ascorbate</td><td>Sigma Life Science</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>SDS Granular</td><td>Gerbu</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogenphosphate</td><td>Merck</td><td>106,586</td><td></td></tr><tr><td>TAMRA azide</td><td></td><td></td><td>참고 문헌 30에 따라 합성: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td></tr><tr><td>TaqI 완충액 (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B28</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>Acros Organics</td><td>42058</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gerbu</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-X (TRIS-base)</td><td>Gerbu</td><td>1018</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr></tbody></table>

methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S -Adenosyl -1- 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet) 의존성 methyltransferases (MTase)는 DNA, RNA, 단백질, 및 작은 생체의 특정 위치들에서 활성화 AdoMet 메틸기의 전달을 촉매. 이것은 천연 메틸화 반응은 보조 인자 합성 유사체를 사용하여 알킬화 반응의 다양한 확장 될 수있다. 아지리 링 AdoMet의 반응 설 포늄 센터의 교체는 다양한 DNA의 MTases에 의해 DNA와 결합 될 수있다 보조 인자로 연결됩니다. 이 아지리 공동 인자는 아데닌 부분의 다른 위치에서 기자 그룹 장착 내가 DNA (미소 DNA)의 L의 아벨 보내고을 nduced ethyltransferase- S의 equence 별 M 사용할 수 있습니다. 전형적인 예로서 우리는 DNA MTase M.BseCI 및 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz에서와 5&#39;-ATCG T-3 &#39;순서에서 나 pBR322 플라스미드 DNA의 바이오 틸위한 프로토콜을 제공한 단계. ctivated G의 roups (MTAG)의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer에 사용되는 AdoMet 유사체의 또 다른 클래스의 불포화 알킬 그룹 결과와 활성화 된 메틸 그룹의 확장. 확장 측쇄가 설 포늄 센터와 불포화 결합에 의해 활성화되기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 불린다. 이러한 유사 아지리 딘 보조 인자 같은 DNA MTases에 대한 보조 인자로서 기능뿐만 아니라, RNA, 단백질과 작은 분자 MTases에 대한뿐만 아닙니다. 그들은 일반적으로 초 화학 공정에서 리포터기로 표지 유니크 작용기 MTase 기판의 효소 적 변형을 위해 사용된다. 이것은 히스톤 H3 단백질의 형광 표지 용 프로토콜에 예시된다. 작은 프로 파질 그룹의 클릭 표시 다음에 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 단백질에 보조 인자 (cofactor) 아날로그 SeAdoYn에서 전송TAMRA 아 지드와 alkynylated 히스톤 H3. 보조 인자 (cofactor) 유사체와 MTase 매개 라벨은 식별 및 기능 연구 MTase 기판뿐만 아니라 DNA 유전자형과 메틸화 검출을 포함하여 많은 흥미로운 응용 프로그램을위한 실현 가능한 기술을 제공한다.

아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA의 한 단계 라벨링 이 예에서는 반응은 이중 가닥 5'-ATCG T-3 '서열 내에 제 아데닌 잔기를 수정하고있는 pBR322 플라스미드 (도 4a)에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA MTase M.BseCI, 수행된다. 플라스미드 라벨을 테스트하려면, 나 pBR322는 제한 효소 (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 ')에 도전한다. R.TaqI는 M.BseCI 사이트에 포함되어있는 하나 나 pBR322에 7 부위를 갖는다. 라벨이 발생하면 M.BseCI 사이트 절단으로부터 보호되며, 다른 두 개의 단편 (315 및 368 BP)를 사라지고 동안 683 염기쌍 (BP)로 새로운 단편을 형성 할 것이다. 물론, 대응하는 인식 서열을 다른 DNA MTases REases와 상이한 DNA 라벨링을 분석 할 때 채용한다. ...

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

다음 실험의 전반적인 목표는 활성화된 메틸기와 aome이라고 하는 보조 인자 Sile l 메티오닌을 D-N-A-R-N-A로 자연적으로 전달하는 메틸 전이효소를 사용하여 DNA와 단백질을 구체적으로 라벨링하는 것입니다. 단백질 또는 작은 생체 분자. 1단계 라벨링은 생략된 천연 보조인자를 전체 보조인자의 효소 결합으로 이어지는 반응 과정을 변화시키는 합성 아인 보조인자로 대체함으로써 달성되며, 따라서 기질 서열의 공유 라벨링은 DNA의 특정 메틸 전이효소 유도 라벨링이 아딘 특이적 DNA 메틸 전이효소, M-B-S-E-C 1, 비오틴화된 아인 보조인자 6 BAZ를 A-G-C-G-A-T 인식 서열에 결합하는 서열, 특히 비오틴닐화, DNA 메틸 전이효소 활성화 그룹의 지시 전달은 라벨 단백질의 사용이며, C 8 oin에서 히스톤 H 3의 라이신 4로 프로 파고 그룹을 전달하는 MTA 세트 7 9를 사용하여 입증됩니다.알킬화된 라이신 잔류물은 구리 촉매 클릭 화학을 사용하여 azi 변형 Fluor에 의해 화학적으로 표지되어 특이적으로 표지된 단백질로 이어집니다. 라벨링에 메스메타페타라제를 사용하는 것의 장점은 천연 기질을 직접 표적으로 삼을 수 있는 잠재력이 있다는 것입니다. 이를 플라스미드의 염기서열 특이적 bioTE 의기양양, DNA 메스 전이효소, 보조인자 아날로그 진을 사용한 촉매 단백질 변형을 통해 입증하고 두 단계로 다양한 리포터 그룹을 도입할 수 있습니다.이를 hisone H 3 단백질의 형광 표지와 H 3 비오틴으로 표지한 결과를 보여줌으로써 입증할 것입니다. 또한, 이중 활성화 보조인자 실행 유사체는 다양한 활성 알코올로 메틸기 전달 후 보조인자 생성물인 S ail, el homocysteine을 로드하여 쉽게 합성할 수 있습니다. 합성 보조인자 유사체는 역상 HPLC에 의해 정제되며, 경우에 따라 황에서 에피 화성을 분리하는 것도 가능합니다.Smiling DNA는 DNA의 염기서열 특이적 메틸 전이효소 유도 표지입니다. 여기서 개념은 PB 3 22 플라스미드 DNA를 6 개의 BAZ Aine 보조 인자와 아딘 특이적 DNA 메틸 전이 효소로 표지하여 입증됩니다. M-B-S-E-C 하나는 섭씨 20도에서 6개의 BAZ를 깎는 것으로 시작합니다.일단 생각하면 얼음 위에서 반응 혼합물을 수리하십시오. 여기에는 마이크로그램의 플라스미드, 60마이크로몰의 6BAZ 및 10개의 M-B-S-E-C 1이 포함됩니다. 변형 완충액의 DNA에 대한 HER 인식 서열.6개의 BAZ와 M-B-S-E-C를 마지막으로 추가해야 합니다. 천연 보조인자(natural cofactor)가 라벨링을 차단하므로 사용 중인 메토폰 전이효소에 AME가 결합되어 있지 않은지 확인하십시오. React For 컨트롤.MTA를 물로 대체하여 비특이적 보조인자 변형을 시각화하고 보조인자 대신 물을 추가하여 효소 농축액의 자연 보조인자를 테스트합니다. 이제 피펫으로 반응을 부드럽게 혼합하고 섭씨 55도에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양이 끝날 무렵, 80 마이크로 리터의 물에 10 x 재조합 타치, 하나의 완충액을 첨가 한 다음 3.3 마이크로 리터의 재조합 탁 1 제한 엔도뉴클레아제를 첨가하여 얼음 위에서 엔도뉴클레아제 혼합물을 수리합니다.배양 후 빠른 회전으로 반응을 당긴 다음 각각에 대한 DNA 변형을 확인합니다. 10 x tak 2마이크로리터, 완충액 1개, 엔도뉴클레아제 혼합물 28마이크로리터를 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 반응을 혼합합니다.이제 섭씨 65도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 반응이 완료되면 빠른 회전으로 용액을 당기고 25마이크로리터의 반응을 새 튜브에 모읍니다. 이러한 부분 표본에 스트렙트 아딘의 단량체당 1밀리몰로 완충된 2.4마이크로리터의 연쇄상구균 TTR을 추가합니다.이제 이 반응을 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 완료된 반응에 6 x 로딩 버퍼의 5 마이크로 리터를 추가하고 약 1 시간 동안 80 볼트에서 1 % 그로스 겔에 10 마이크로 리터를 소모합니다. 그런 다음 밴드를 시각화합니다. mt A는 methyl transferase directed transfer of activated groups의 약자입니다.이 시연에서 메틸 전이효소는 7, 9 및 이중 활성화 보조인자 C 8을 설정했습니다. Oin은 그의 히스톤 H 3 중 라이신 4를 표시하는 데 사용됩니다. 얼음 수리 20 마이크로 리터 반응 혼합물에서 성분을 해동 한 후, 분석 용액은 히스톤 H 3의 변형 완충액 10 마이크로 몰을 포함하고 메틸 전이 효소의 마지막 10 마이크로 몰과 보조 인자 600 마이크로 몰을 첨가했다.C eight ON을 탈이온수로 대체하여 효소 제어를 만듭니다. 또한 합성 보조인자와 경쟁하기 위해 60밀리몰의 ADO 충족을 포함하여 비특이적 변형을 시각화하는 보조인자 제어를 만듭니다. 이제 느린 파이프 해충과 반응을 혼합하고 테스트 스트립으로 pH를 확인하십시오. 이중 활성화 보조 인자 아날로그는 C 조건에서 저장됩니다.따라서 반응 용액의 pH는 pH를 조정하기 위해 필요한 경우 소량의 50 밀리몰 수산화나트륨에서 보조 인자를 추가하여 변경할 수 있습니다. 이제 배양 수리 중에 섭씨 37도에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 외양이 끝나기 직전에 12%SDS 많은 아크릴아미드 젤은, 3 밀리 몰 구리 황산염, 3 밀리 몰 T-H-P-T-A 리간드 250 밀리몰, 나트륨 ACO 미끼 및 6 밀리몰 Tamara 아지드화물을 포함하는 5 x 누르기 혼합물의 20 마이크로리터를 만듭니다.배양이 끝나면 각 반응에 5마이크로리터의 클릭 믹스를 추가하고 페팅당 천천히 반응을 혼합합니다. 호일을 사용하여 빛으로부터 반응을 보호하고 섭씨 20도에서 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 단백질을 침전시켜 과도한 클로로포름을 제거하십시오.각 반응에 75마이크로리터의 메탄올, 18.7마이크로리터의 클로로포름 및 50마이크로리터의 물을 첨가하고 각 첨가 후 잠시 와류를 일으킵니다. 각 튜브를 준비한 후 16, 000G에서 5분 동안 회전시킵니다. 단백질을 포함하는 계면층을 방해하지 않고 분리의 상부상을 제거합니다.이제 56.3 마이크로 리터의 메탄올, 낮은 위상 및 와류를 추가합니다. 다음으로, 이것을 스핀다운하여 단백질을 펠렛화하고 supinate를 버립니다. 그런 다음 56.3 마이크로 리터의 메탄올을 첨가하십시오.다시 말하지만, 소용돌이. 회전을 반복하고 펠릿을 회수하십시오. 펠릿을 튜브에서 건조시키고 뚜껑을 풀고 보푸라기가 없는 종이로 덮습니다.나중에 로딩 염료로 20 마이크로 리터의 SDS 로딩 버퍼에 단백질을 용해시킵니다. 펠릿을 수집하기 위해 버퍼로 튜브 벽을 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다.튜브가 실온으로 호출되면 잠시 동안 사용하여 내용물을 추출하고 SDS 페이지별로 단백질을 시각화합니다. 120볼트에서 약 90분 동안 실행합니다. 미소 반응은 이중 가닥 A-T-C-G-A-T 서열 내에서 두 번째 아데닌 잔기를 수정하고 PBR 3 2 2 플라스미드에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA 메틸 전이효소 M-B-S-E-C 1로 수행되었으며, 이는 플라스미드 라벨링을 테스트하기 위해 빨간색으로 표시되었습니다.PB 3 2 2는 재조합 제한인 엔도뉴클레아제 T 1에 대한 이의를 제기하였는데, 이는 녹색으로 표시된 PB 3 22의 7개 부위가 있으며, 그 중 하나는 M-B-S-E-C 1 부위에 포함되어 있다. 라벨링이 발생하면 이 부위는 겔의 절단으로부터 보호되어야 합니다. 이것은 확인되었습니다.683개의 염기쌍을 가진 새로운 단편이 나타나 M-B-S-E-C 한 부위에 라벨링이 있음을 보여주었습니다. 이는 3번째 레인인 분석 레인에서만 볼 수 있습니다. 라벨링 반응의 특이성은 E-모빌리티 이동에 의해 입증되었습니다.스트렙트 아딘(strept adin)을 첨가하자마자, 비오틴(biotin)으로 표지된 683 염기쌍 단편의 전기이동성(electromobility)이 지연되었다. M-B-S-E-C 1 부위가 없는 단편의 이동도는 변하지 않았거나 이중 활성화 8개의 oh met 유사체가 있는 메틸 전이효소 기질의 2단계 표지는 변하지 않았습니다. 히스톤 H3 라이신 4 메틸 전이 효소 세트 7 9 및 작은 C 8 ON 보조 인자를 사용했다.Gel 전기영동은 형광 검출에 사용되었으며, 분석 레인에서만 사용되었습니다. 레인 1은 히스톤 H 3에 해당하는 형광 띠를 보여주었는데, 이는 보조인자의 곁사슬이 특이적으로 전달되고 변형된 단백질이 Tamara Flora.Four로 표지되었음을 나타냅니다. ESI 염색은 하중 제어 역할을 합니다.모든 레인에서 동일한 양의 단백질이 나타났습니다. 메틸 전이효소 기질은 azi 유래 비오틴과의 비오틴 반응으로 표지될 수도 있습니다. Fluor 대신에 양고추냉이 과산화효소를 가진 서쪽 더럽히기에 의하여 분석실험은 이었다.이 비디오를 시청한 후 Conjugated Aden이 성공적이고 구체적인 라벨링을 볼 수 있었습니다. DNA와 단백질 염기서열을 라벨링하는 방법, 특히 친화력 텍스트, Fluor force 또는 기타 라벨을 사용하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 다른 met 및 해당 아날로그는 온도에 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.항상 얼음 위에서 다루고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 나는 이중 활성화를 합성했다. 리포터 그룹과의 다른 MET 유사체는 이미 곁사슬에 내장되어 한 단계에서 DNA를 특이적으로 라벨링하는 데 사용했습니다.저는 특히 단일 분자 기술을 사용하여 DNA 매핑을 위해 다양한 효소와 보고서 그룹을 결합할 수 있다는 전망에 매우 기쁩니다. 스마일링과 NEC는 매우 유연하며, 거의 모든 화학기는 DNA와 단백질뿐만 아니라 적절한 필로폰 전달을 사용하여 RNA와 작은 세포로 전달될 수 있습니다.

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연구

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생물학

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학습하세요 메틸트랜스퍼레이즈를 이용한 DNA와 단백질의 서열 특이적 라벨링 방법을. 합성 보조인자 유사체를 활용한 1단계 및 2단계 라벨링 기술로 생체분자 상호작용 연구를 강화하세요.

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