Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

다음 실험의 전반적인 목표는 활성화된 메틸기와 aome이라고 하는 보조 인자 Sile l 메티오닌을 D-N-A-R-N-A로 자연적으로 전달하는 메틸 전이효소를 사용하여 DNA와 단백질을 구체적으로 라벨링하는 것입니다. 단백질 또는 작은 생체 분자. 1단계 라벨링은 생략된 천연 보조인자를 전체 보조인자의 효소 결합으로 이어지는 반응 과정을 변화시키는 합성 아인 보조인자로 대체함으로써 달성되며, 따라서 기질 서열의 공유 라벨링은 DNA의 특정 메틸 전이효소 유도 라벨링이 아딘 특이적 DNA 메틸 전이효소, M-B-S-E-C 1, 비오틴화된 아인 보조인자 6 BAZ를 A-G-C-G-A-T 인식 서열에 결합하는 서열, 특히 비오틴닐화, DNA 메틸 전이효소 활성화 그룹의 지시 전달은 라벨 단백질의 사용이며, C 8 oin에서 히스톤 H 3의 라이신 4로 프로 파고 그룹을 전달하는 MTA 세트 7 9를 사용하여 입증됩니다.

알킬화된 라이신 잔류물은 구리 촉매 클릭 화학을 사용하여 azi 변형 Fluor에 의해 화학적으로 표지되어 특이적으로 표지된 단백질로 이어집니다. 라벨링에 메스메타페타라제를 사용하는 것의 장점은 천연 기질을 직접 표적으로 삼을 수 있는 잠재력이 있다는 것입니다. 이를 플라스미드의 염기서열 특이적 bioTE 의기양양, DNA 메스 전이효소, 보조인자 아날로그 진을 사용한 촉매 단백질 변형을 통해 입증하고 두 단계로 다양한 리포터 그룹을 도입할 수 있습니다.

이를 hisone H 3 단백질의 형광 표지와 H 3 비오틴으로 표지한 결과를 보여줌으로써 입증할 것입니다. 또한, 이중 활성화 보조인자 실행 유사체는 다양한 활성 알코올로 메틸기 전달 후 보조인자 생성물인 S ail, el homocysteine을 로드하여 쉽게 합성할 수 있습니다. 합성 보조인자 유사체는 역상 HPLC에 의해 정제되며, 경우에 따라 황에서 에피 화성을 분리하는 것도 가능합니다.

Smiling DNA는 DNA의 염기서열 특이적 메틸 전이효소 유도 표지입니다. 여기서 개념은 PB 3 22 플라스미드 DNA를 6 개의 BAZ Aine 보조 인자와 아딘 특이적 DNA 메틸 전이 효소로 표지하여 입증됩니다. M-B-S-E-C 하나는 섭씨 20도에서 6개의 BAZ를 깎는 것으로 시작합니다.

일단 생각하면 얼음 위에서 반응 혼합물을 수리하십시오. 여기에는 마이크로그램의 플라스미드, 60마이크로몰의 6BAZ 및 10개의 M-B-S-E-C 1이 포함됩니다. 변형 완충액의 DNA에 대한 HER 인식 서열.

6개의 BAZ와 M-B-S-E-C를 마지막으로 추가해야 합니다. 천연 보조인자(natural cofactor)가 라벨링을 차단하므로 사용 중인 메토폰 전이효소에 AME가 결합되어 있지 않은지 확인하십시오. React For 컨트롤.

MTA를 물로 대체하여 비특이적 보조인자 변형을 시각화하고 보조인자 대신 물을 추가하여 효소 농축액의 자연 보조인자를 테스트합니다. 이제 피펫으로 반응을 부드럽게 혼합하고 섭씨 55도에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양이 끝날 무렵, 80 마이크로 리터의 물에 10 x 재조합 타치, 하나의 완충액을 첨가 한 다음 3.3 마이크로 리터의 재조합 탁 1 제한 엔도뉴클레아제를 첨가하여 얼음 위에서 엔도뉴클레아제 혼합물을 수리합니다.

배양 후 빠른 회전으로 반응을 당긴 다음 각각에 대한 DNA 변형을 확인합니다. 10 x tak 2마이크로리터, 완충액 1개, 엔도뉴클레아제 혼합물 28마이크로리터를 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 반응을 혼합합니다.

이제 섭씨 65도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 반응이 완료되면 빠른 회전으로 용액을 당기고 25마이크로리터의 반응을 새 튜브에 모읍니다. 이러한 부분 표본에 스트렙트 아딘의 단량체당 1밀리몰로 완충된 2.4마이크로리터의 연쇄상구균 TTR을 추가합니다.

이제 이 반응을 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 완료된 반응에 6 x 로딩 버퍼의 5 마이크로 리터를 추가하고 약 1 시간 동안 80 볼트에서 1 % 그로스 겔에 10 마이크로 리터를 소모합니다. 그런 다음 밴드를 시각화합니다. mt A는 methyl transferase directed transfer of activated groups의 약자입니다.

이 시연에서 메틸 전이효소는 7, 9 및 이중 활성화 보조인자 C 8을 설정했습니다. Oin은 그의 히스톤 H 3 중 라이신 4를 표시하는 데 사용됩니다. 얼음 수리 20 마이크로 리터 반응 혼합물에서 성분을 해동 한 후, 분석 용액은 히스톤 H 3의 변형 완충액 10 마이크로 몰을 포함하고 메틸 전이 효소의 마지막 10 마이크로 몰과 보조 인자 600 마이크로 몰을 첨가했다.

C eight ON을 탈이온수로 대체하여 효소 제어를 만듭니다. 또한 합성 보조인자와 경쟁하기 위해 60밀리몰의 ADO 충족을 포함하여 비특이적 변형을 시각화하는 보조인자 제어를 만듭니다. 이제 느린 파이프 해충과 반응을 혼합하고 테스트 스트립으로 pH를 확인하십시오. 이중 활성화 보조 인자 아날로그는 C 조건에서 저장됩니다.

따라서 반응 용액의 pH는 pH를 조정하기 위해 필요한 경우 소량의 50 밀리몰 수산화나트륨에서 보조 인자를 추가하여 변경할 수 있습니다. 이제 배양 수리 중에 섭씨 37도에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 외양이 끝나기 직전에 12%SDS 많은 아크릴아미드 젤은, 3 밀리 몰 구리 황산염, 3 밀리 몰 T-H-P-T-A 리간드 250 밀리몰, 나트륨 ACO 미끼 및 6 밀리몰 Tamara 아지드화물을 포함하는 5 x 누르기 혼합물의 20 마이크로리터를 만듭니다.

배양이 끝나면 각 반응에 5마이크로리터의 클릭 믹스를 추가하고 페팅당 천천히 반응을 혼합합니다. 호일을 사용하여 빛으로부터 반응을 보호하고 섭씨 20도에서 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 단백질을 침전시켜 과도한 클로로포름을 제거하십시오.

각 반응에 75마이크로리터의 메탄올, 18.7마이크로리터의 클로로포름 및 50마이크로리터의 물을 첨가하고 각 첨가 후 잠시 와류를 일으킵니다. 각 튜브를 준비한 후 16, 000G에서 5분 동안 회전시킵니다. 단백질을 포함하는 계면층을 방해하지 않고 분리의 상부상을 제거합니다.

이제 56.3 마이크로 리터의 메탄올, 낮은 위상 및 와류를 추가합니다. 다음으로, 이것을 스핀다운하여 단백질을 펠렛화하고 supinate를 버립니다. 그런 다음 56.3 마이크로 리터의 메탄올을 첨가하십시오.

다시 말하지만, 소용돌이. 회전을 반복하고 펠릿을 회수하십시오. 펠릿을 튜브에서 건조시키고 뚜껑을 풀고 보푸라기가 없는 종이로 덮습니다.

나중에 로딩 염료로 20 마이크로 리터의 SDS 로딩 버퍼에 단백질을 용해시킵니다. 펠릿을 수집하기 위해 버퍼로 튜브 벽을 헹굽니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다.

튜브가 실온으로 호출되면 잠시 동안 사용하여 내용물을 추출하고 SDS 페이지별로 단백질을 시각화합니다. 120볼트에서 약 90분 동안 실행합니다. 미소 반응은 이중 가닥 A-T-C-G-A-T 서열 내에서 두 번째 아데닌 잔기를 수정하고 PBR 3 2 2 플라스미드에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA 메틸 전이효소 M-B-S-E-C 1로 수행되었으며, 이는 플라스미드 라벨링을 테스트하기 위해 빨간색으로 표시되었습니다.

PB 3 2 2는 재조합 제한인 엔도뉴클레아제 T 1에 대한 이의를 제기하였는데, 이는 녹색으로 표시된 PB 3 22의 7개 부위가 있으며, 그 중 하나는 M-B-S-E-C 1 부위에 포함되어 있다. 라벨링이 발생하면 이 부위는 겔의 절단으로부터 보호되어야 합니다. 이것은 확인되었습니다.

683개의 염기쌍을 가진 새로운 단편이 나타나 M-B-S-E-C 한 부위에 라벨링이 있음을 보여주었습니다. 이는 3번째 레인인 분석 레인에서만 볼 수 있습니다. 라벨링 반응의 특이성은 E-모빌리티 이동에 의해 입증되었습니다.

스트렙트 아딘(strept adin)을 첨가하자마자, 비오틴(biotin)으로 표지된 683 염기쌍 단편의 전기이동성(electromobility)이 지연되었다. M-B-S-E-C 1 부위가 없는 단편의 이동도는 변하지 않았거나 이중 활성화 8개의 oh met 유사체가 있는 메틸 전이효소 기질의 2단계 표지는 변하지 않았습니다. 히스톤 H3 라이신 4 메틸 전이 효소 세트 7 9 및 작은 C 8 ON 보조 인자를 사용했다.

Gel 전기영동은 형광 검출에 사용되었으며, 분석 레인에서만 사용되었습니다. 레인 1은 히스톤 H 3에 해당하는 형광 띠를 보여주었는데, 이는 보조인자의 곁사슬이 특이적으로 전달되고 변형된 단백질이 Tamara Flora.Four로 표지되었음을 나타냅니다. ESI 염색은 하중 제어 역할을 합니다.

모든 레인에서 동일한 양의 단백질이 나타났습니다. 메틸 전이효소 기질은 azi 유래 비오틴과의 비오틴 반응으로 표지될 수도 있습니다. Fluor 대신에 양고추냉이 과산화효소를 가진 서쪽 더럽히기에 의하여 분석실험은 이었다.

이 비디오를 시청한 후 Conjugated Aden이 성공적이고 구체적인 라벨링을 볼 수 있었습니다. DNA와 단백질 염기서열을 라벨링하는 방법, 특히 친화력 텍스트, Fluor force 또는 기타 라벨을 사용하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 다른 met 및 해당 아날로그는 온도에 민감하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

항상 얼음 위에서 다루고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 나는 이중 활성화를 합성했다. 리포터 그룹과의 다른 MET 유사체는 이미 곁사슬에 내장되어 한 단계에서 DNA를 특이적으로 라벨링하는 데 사용했습니다.

저는 특히 단일 분자 기술을 사용하여 DNA 매핑을 위해 다양한 효소와 보고서 그룹을 결합할 수 있다는 전망에 매우 기쁩니다. 스마일링과 NEC는 매우 유연하며, 거의 모든 화학기는 DNA와 단백질뿐만 아니라 적절한 필로폰 전달을 사용하여 RNA와 작은 세포로 전달될 수 있습니다.