단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 분해 속도의 변화를 액체 배양에서 효모 성장의 동역학과 결합하여 체계적인 방식으로 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 세포를 성장시킴으로써 이루어질 수 있으며, 대사 마커에 결합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질을 하룻밤 사이에 적절한 선택적 배지에서 고정상으로 발현시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포의 광학적 밀도를 측정하여 세포의 성장 역학을 결정한 다음, 로그 단계 동안 세포의 최소 배가 시간을 지정된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 성장 역학으로부터 계산합니다.

궁극적으로 계산된 최소 배가 시간은 단백질 분해 역학의 변형을 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 시클라메이트 또는 펄스 체이스 분해 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 기술이 설정이 간단하다는 점을 추가했습니다. 데이터 수집 및 분석은 간단하며 에세이 디자인은 매우 모듈화되어 있습니다.

이 방법은 유비퀴틴 냄비 시스템에서 잘못 접힌 냄비 인식에 필요한 요소와 같은 냄비 분해 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 유비퀴틴(ubiquitin)이 하위 집합에서 제거되는 단백질을 확인하기 위해 스크리닝을 수행했을 때였습니다. 그래서 분석을 위해 세포를 준비하기 위해 여러 샘플을 비교하는 간단한 방법을 설정했습니다.

먼저 TRY 4 67과 같은 적절한 ox 위축성 효모 세포를 U three Deron 융합체를 포함하는 플라스미드와 플라스미드 선택 및 유지를 위한 추가 대사 마커로 형질전환시킵니다. 플라스미드 선택 및 유지를 위해 아미노산 선택 마커가 없는 적절한 합성 정의 배지 아래에서 한천 플레이트의 세포를 성장시키고, 살아남은 콜로니를 패치로 옮기고, 패치에서 액체 배지로 세포를 옮기고, 고정상에 도달할 때까지 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 15개 이하의 샘플에 대해 야간 배양에서 얻은 세포 50마이크로리터를 웰당 150마이크로리터의 합성 정의 배지로 희석합니다.

투명한 바닥 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 샘플의 OD 600 값을 측정합니다. 그런 다음 0.25의 OD 600에 해당하는 양으로 효모 세포를 얻는 데 필요한 정확한 부피를 계산한 후 12, 000배 G 및 실온에서 1분 동안 세포를 스핀 다운하고 적절한 선택적 배지 1밀리리터에 세포를 재현탁시켜 0.25의 OD 600을 얻고 15보다 클 때 희석된 균주 200마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트의 한 웰로 이동합니다 샘플을 테스트해야 합니다. 하룻밤 사이에 성장한 고정 세포 10마이크로리터를 190마이크로리터의 적절한 선택적 배지를 포함하는 새로운 96웰 플레이트의 한 웰로 옮겨 선택적 조건에서 형질전환된 효모 세포의 성장 역학을 측정합니다.

다음으로, 다중 모드 마이크로플레이트 리더를 섭씨 30도의 배양 온도, OD 600 측정 간격 15분, 궤도 및 선형 진탕 주기(7분마다 1분)로 설정합니다. 그런 다음 섭씨 30도의 마이크로플레이트 리더에서 12-24시간 동안 세포를 배양합니다. 세포가 고정상에 도달했을 때, 원시 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내어 MDT Calc를 사용하여 효모 성장 역학을 측정합니다.

성장 데이터가 포함된 스프레드시트 파일이 저장되고 닫혀 있는지 확인합니다. 그런 다음 파일 경로에서 MDT Calc 응용 프로그램을 엽니다. 사각형을 클릭하여 시트 이름 아래에서 스프레드시트 파일을 찾습니다.

시작 위치 아래에 원시 데이터가 있는 스프레드시트 이름을 입력합니다. 스프레드시트 시간 좌표를 입력하고, 시간 열 아래에 첫 번째 샘플의 0을 입력합니다. 빈 열 아래에 시점 열의 위치를 정의하는 문자를 초 단위로 입력하고 빈 열의 위치를 정의하는 문자를 입력합니다.

예를 들면, 96의 좋은 판의 A 1개의 우물. 다음. OD 값에서 MDT 계산을 시작하는 데 필요한 최소 변환된 OD 600 값을 선택합니다. 일반적으로 0.15에서 0.25 사이로 MDT가 정의된 D 600 값 이상에 도달하는 샘플에 대해서만 계산됩니다.

마지막 값을 입력했으면 계산 버튼을 클릭하고 오른쪽의 진행률 표시줄이 점차 녹색으로 변경되는지 확인합니다. 마지막으로, MDT 계산이 완료될 때 화면에 자동으로 나타나는 두 데이터 집합을 새 스프레드시트로 내보냅니다. 데이터에 최소 OD 값 테스트를 통과한 각 웰의 MDT 값과 이 대표 실험에서 MDT가 계산된 간격의 시작 시간이 포함되어 있는지 확인합니다.

야생형과 다양한 돌연변이 균주 사이의 단백질 분해 동역학의 상대적 차이를 초기에 야생형 U BBC 6, 델타 UBC 7 델타 또는 DOA 10 델타 세포를 비교하고, D 1 VMAU 3 발현 세포를 합성 정의된 완전한 배지에서 성장시켰다. 그런 다음 아가미를 측정하기 위해 세포를 세척하고 합성 정의 배지에서 배양했습니다. 마이너스 우라실(Minus uracil)은 합성 정의된 완전한 배지에서 성장한 모든 균주에 대해 유사한 성장 곡선 및 계산된 MDT가 관찰되었으며, 조사된 유전자 중 하나의 결실이 세포 성장에 영향을 미칠 가능성을 제외했습니다.

대조적으로, 우라실을 뺀 합성 정의 배지에서의 배양은 야생형 세포의 저조한 성장을 초래한 반면, 돌연변이 균주에서는 경미한 성장 결함만 관찰되었습니다. UBC seven은 DEG one VMAU 3 분해에 절대적으로 필요하며, 이를 통해 다양한 E two 돌연변이의 부분적인 효과도 정확하게 평가할 수 있습니다. 이에 따라, 활성 부위 돌연변이가 있는 UBC 7을 발현하는 세포에서 빠른 성장 동역학이 관찰되었으며, C 89 s 및 N 81 A.In, DEG 1, VMA ETH, 3 분해 V20 5G 및 H 90 4K를 간접적으로 방해할 것으로 예측되는 2개의 돌연변이도 야생형 UBC 7에 비해 세포 성장을 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다. 비록 활성 부위 돌연변이보다 정도가 덜하지만.

따라서, 아가미 방법은 리포터 기판의 안정성에 대한 다양한 열화 요인의 상대적 기여도를 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 프로토콜이 단백질 분해 속도의 작은 차이에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것은 장점이지만 이 절차에 따라 사용할 Deron의 설계 및 검증에 주의를 기울여야 함을 의미하기도 합니다.

고처리량 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 리포터 단백질의 응집 성향이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이러한 이유로 리포터에 GFP 태그를 포함하는 것도 좋은 생각입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 MICROPLATE 리더와 당사의 지정 소프트웨어 프로그램을 사용하여 단백질 분해 속도의 변화를 체계적으로 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.