HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

이 접근법을 통해 단백질 분해에 대한 세포 모니터링과 분해제 화합물의 신속한 스크리닝이 가능합니다. 분해의 역학은 매우 민감하고 정량적인 방식으로 세포 맥락에서 모니터링될 수 있으며, 이를 통해 주요 열화 매개변수를 정확하게 결정할 수 있습니다. 이러한 방법을 통해 분해제(degrader) 화합물 활성에 대한 HTS 프로파일링을 수행할 수 있어 초기 치료 발견 단계에서 분류할 수 있습니다.

또한 증가 또는 감소에 관계없이 내인성 목표 수준의 조절을 연구하고자 하는 모든 사람에게 통찰력을 제공합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 과학자인 Celia Bisbach입니다. 포유류 부착 세포 또는 현탁 세포를 준비하고 도금하는 것으로 시작합니다.

세포 밀도를 2.22 곱하기 10에서 밀리리터당 5번째 세포로 조정하고 실험 및 제어 조건당 최소 3개의 웰이 있는 플레이트에 분배합니다. 100% DMSO에서 1000x 농도로 연속 희석된 PROTAC 또는 분해제 테스트 화합물 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 세포 배양 배지에서 최종 농도의 10배로 희석합니다.

배지에 동일한 부피의 DMSO를 추가하여 비화합물 DMSO 대조군을 생성합니다. 플레이트의 세포에 적절한 양의 10x 화합물 또는 대조 용액을 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 종말점 발광 신호를 측정하려면 용해 완충액 1ml당 20마이크로리터의 용해 기질과 10마이크로리터의 LgBiT 단백질을 추가하여 2x 용해 검출 시약을 준비합니다.

파이펫팅 오류를 설명하기 위한 추가 부피를 포함하여 모든 웰을 분석할 수 있도록 충분한 시약을 준비합니다. 준비된 용해 검출 시약을 세포에 첨가하고 350RPM으로 10-20분 동안 마이크로플레이트 와류 믹서에서 플레이트를 혼합합니다. 96 또는 384 웰 플레이트를 읽을 수 있는 광도계에서 발광을 측정합니다.

세포 생존율 다중화를 사용하는 경우 용해성 시약을 첨가하기 전에 수행합니다.원하는 종말점 측정 30-40분 전에 2ml의 분석 버퍼에 10마이크로리터의 기질을 추가하여 6x 세포 생존도 검출 시약 용액을 준비합니다. 준비된 시약을 웰에 넣고 마이크로플레이트 와류 믹서에서 간단히 혼합합니다.

그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 원하는 종말점에서 96 또는 384 웰 형식으로 형광을 판독할 수 있는 기기에서 형광을 측정합니다. 앞서 설명한 대로 2x 용해 시약을 준비합니다.

그런 다음 시약을 웰에 넣고 마이크로플레이트 와류 믹서에서 플레이트를 10-20분 동안 혼합합니다. 혼합 후 발광계를 사용하여 발광을 측정합니다. 단일 농도 종말점 용해 분해 분석을 입증하기 위해 여러 CDK 표적 단백질에 HiBiT를 내인성 태그하고 pan kinase cereblon-based PROTAC TL12-186으로 처리했습니다.

CDK 단백질 수준은 다른 시점에서 측정되었으며 분획 RLU가 측정되었습니다. 단백질 손실 측면에서 CDK 단백질이 서로 어떻게 직접 비교되는지 이해하기 위해 분수 RLU를 총 분해 비율로 계산했습니다. LgBiT 단백질을 안정적으로 발현하는 HiBiT 및 HEK293 세포로 BET 패밀리 구성원 단백질을 내인성으로 라벨링하여 운동 분해 분석을 수행했습니다.

그런 다음 세포를 3가지 다른 농도의 pan-BET PROTAC으로 처리했습니다. Cereblon 기반 dBET6 및 VHL 기반 ARV-771. 4개의 서로 다른 분자 접착제 화합물로 처리된 LgBiT 단백질을 안정적으로 발현하는 Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat 세포의 운동 용량 반응 분해 프로파일이 여기에 나와 있습니다.

화합물 간의 분해 반응과 농도 계열 전반에 걸친 상당한 차이가 관찰됩니다. 화합물의 분해 및 순위 순서를 정량적으로 평가하기 위해 용량 반응 프로파일을 사용하여 분해 속도, 분해 최대값 및 Dmax50 값을 포함한 주요 분해 매개변수를 계산했습니다. 세포 생존율 다중 분석은 테스트된 농도에 대한 세포 생존율의 손실을 보여주지 않았습니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 DMSO 제어에 대한 정규화를 통해 분수 RLU 또는 성능 저하 비율을 결정하는 것입니다. 이 프로토콜에 따라 표현형 분석을 수행하여 특정 단백질의 손실이 세포 건강이나 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있습니다. 또한 이러한 HiBiT 세포주는 NanoBRET 기술을 사용하여 단백질 상호 작용 또는 소분자 결합을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.