Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

이 절차의 목표는 마우스 배아, 달팽이관 외(exvivo)를 배양하고 전기 조작하는 것입니다. 형태 형성 분화 및 성장 현상을 포함하여 달팽이관 발달의 다양한 측면을 연구하기 위해 먼저 13일 배아 마우스 배아에서 머리를 채취하여 이를 수행합니다. 다음으로, 뇌를 제거하여 내이를 노출시키고 두개골 기저부에서 분리하여 발달 중인 측두골로부터 분리시킵니다.

그런 다음 위에 있는 연골을 제거하고 달팽이관을 열어 달팽이관의 감각 상피를 얻습니다. 마지막 단계는 최대 일주일 동안 전기천공법을 사용하거나 사용하지 않고 절개된 달팽이관을 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 임플란트는 라이브 셀 이미징 또는 고정 면역 염색을 위해 분석될 수 있으며 컨포칼 이미징, 마우스 배아의 배양에 의해 분석될 수 있습니다.

Cochlear explan은 증식, 황산염 사양, 발달 중인 달팽이관의 극성과 같은 기관 형성의 다양한 측면과 이러한 이벤트가 성장 및 분화에 어떻게 기여하는지 연구할 수 있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 따라서 이 기술을 사용하면 약리학적 조작을 수행하고 생체 외 유전자 기능을 모니터링할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전기천공법을 통한 유전자 전달과 결합되어 관심 유전자의 발현을 변경하고 단일 세포 수준에서 그 기능을 모니터링할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 E 13 마우스 배아 머리를 냉간 해부 용액이 들어 있는 멸균 소가 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 눈 부위 주위에 미세한 핀을 배치하여 배아 머리를 고정시킵니다. 그런 다음 두 쌍의 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 피부를 제거하고 정중선을 따라 등쪽의 두개골을 엽니다.

그런 다음 두개강에서 뇌를 제거합니다. 측두골 내에 위치한 내이는 주변 혈관 내벽을 통해 확인할 수 있습니다. 다음으로, 조직 아래에 집게를 놓고 두개골 기저부에서 내이를 분리하여 측두골에서 내이를 해부합니다.

그 후, 절개된 내이를 차가운 해부 용액이 담긴 새 접시에 옮깁니다. 이제 복부 쪽이 위를 향하도록 내이의 방향을 잡습니다. 전정부를 통해 미누친 핀의 날카로운 끝을 부드럽게 삽입하여 내이를 안정시킵니다.

매우 미세한 집게를 사용하여 타원형 창 근처를 절개하여 위에 있는 연골을 잘라냅니다. 위에 있는 연골은 때때로 달팽이관과 융합되므로 겸자가 연골에 너무 깊숙이 삽입되지 않도록 하십시오. 그런 다음 달팽이관에서 연골을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 겸자를 달팽이관의 기저부 또는 정점에 놓고 달팽이관 지붕을 부드럽게 당겨 감각 상피를 노출시킵니다. 마지막 단계로, 노출된 감각 상피에서 기저부의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 달팽이관 돌출부의 기저부가 평평해지도록 합니다. 그런 다음 절개된 달팽이관을 내이의 전정 부분에서 분리하십시오.

여분의 조직을 제거하기 위해 추가 세척이 필요한 경우 1.5mm 멸균 스쿠퍼를 사용하여 절개된 달팽이관 감각 상피를 기저막 매트릭스 코팅된 배양 웰로 옮기고 이 단계에서 이를 수행할 수 있습니다. 그런 다음 상피의 내강 표면이 위를 향하도록 달팽이관 계획의 방향을 지정합니다. 기저막 매트릭스 DMEM 용액을 흡입하여 조직을 조심스럽게 평평하게 만들고 150마이크로리터의 신선한 배양 배지를 접시에 부드럽게 추가합니다.

각 x explan a가 코팅된 유리 커버 슬립에 잘 부착되고 배양 매체에 떠다니지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 마이크로 절개된 달팽이관을 멸균된 150mm 배양 접시에 부드럽게 옮기고 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 3-6DIV.

1D IV 후 해부 현미경으로 배양물을 검사하여 달팽이관 엑스플랜이 배양 접시에 잘 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 전기천공을 위해 설정하기 위한 면역조직화학을 위해 처리하기 전에 원하는 기간 동안 in vivo에서 배양액을 계속 배양합니다. 먼저 100mm 시가 코팅 유리 접시 하나를 고압멸균하거나 70% 에탄올에 약 20분 동안 담가

그런 다음 사용하기 전에 깨끗한 벤치에서 자연 건조하십시오. 이제 적절한 maxi 또는 MIDI 준비 키트를 사용하여 선택한 발현 벡터에서 DNA를 준비합니다. 이 프로토콜에 사용되는 발현 벡터는 H one expression construct 및 neuro D one expression construct입니다.

그리고 DNA의 최종 농도는 멸균 DNA RNA에서 마이크로리터당 최소 1마이크로그램이어야 하며, DNA를 enic 달팽이관 설명문으로 전기 작동시키기 위한 자유수여야 합니다. 100mm 시가 코팅된 신선한 접시에 10마이크로리터의 혈장 DNA 용액을 추가합니다. 그런 다음 완전히 절개된 달팽이관 엑스플랜을 상피의 내강 표면이 위를 향하도록 하여 DNA 용액으로 옮깁니다.

달팽이관을 접시의 평면에 수직이 되도록 약간 기울입니다. 다음으로, 음극 패들을 감각 상피 쪽으로 배치하고 양극 패들을 전기기를 사용하여 달팽이관 바닥 옆에 놓습니다. 24mV, 30밀리초 펄스 지속 시간의 9-10개 펄스를 제공합니다.

그런 다음 100마이크로리터의 따뜻한 배양 배지를 전기 정격 달팽이관에 추가합니다. 모든 달팽이관 계획과 모든 관심 유전자의 DNA에 대해 절차를 반복한 후 전기 등급의 달팽이관을 도금을 위해 기저막 매트릭스 코팅 접시로 옮깁니다. 그런 다음 모든 전기 등급 달팽이관을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 원하는 기간 동안 배양한 다음 면역 세포 화학을 위해 처리합니다.

이 이미지는 TH one, EEG FP 또는 neuro D one EGFP 리포터로 전기천공된 야생형 CD one 마우스 펍의 배아 13일차 인공와우를 보여줍니다. 그들은 유모 세포 특이적 마커, anti myo seven A 또는 뉴런 마커 2 대 1로 빨간색으로 표시된 면역 표지되었습니다. EGFP 발현으로 시각화할 수 있는 전기 등급 세포는 더 큰 상피 융기, 더 작은 상피 융기 및 감각 상피 세포 전체에서 볼 수 있습니다.

5개의 DIV가 수지상 돌기로 신경 표현형을 획득한 후 neuro D one이 형질주입된 달팽이관 상피 세포를 형성했으며, 이들 대부분은 2개의 1 또는 T oh H 1에 대해 양성이었습니다. 형질주입된 세포는 myo seven에 대해 양성이었습니다. 표현 일단 숙달되면이 기술은 8-10 팝의 인텔 리터에 대해 3-4 시간 안에 완료 할 수 있습니다.

이를 통해 해부 배양, 전기천공법 및 엑스플랜 도금을 위한 충분한 시간을 확보할 수 있습니다.