에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송 VIVO에서 Electroporation

Jane은 In Vivo, electroporation Ling Wang, Han Jang, John Burgandy, Oregon Health and Science University의 Oregon Hearing Research Center에 의해 Developing Mouse Inner Ear로 옮겼습니다. 제 이름은 존 버건디입니다. 제 연구실은 오리건 보건 과학 대학(Oregon Health and Science University)의 오리건 청력 연구 센터(Oregon Hearing Research Center)에 있습니다.

제 이름은 Ang입니다. 저는 존스 연구실의 포스터입니다. 저는 존스 연구실에서 연구 조교로 일하고 있는 Ang입니다.

우리의 프레젠테이션은 네 부분으로 나뉩니다. 첫 번째는 복부 개복술입니다. 우리는 나트륨 펜, 바르비탈 기반 마취, 마취의 적절성 테스트 방법, 각막 보호, 수술 부위 준비, 소독 마우스 생존 수술 데이터 시트, 피부와 복벽을 통한 수술실 복부 정중선 절개 및 자궁 뿔의 외부화를 시연합니다.

두 번째는 트랜스 자궁 미세주입술입니다. 배아 11.5일과 배아 12.5일에 배아, 배아, 배아, 재배치, 미세주입, 피펫, 제작 및 오티스로의 미세주입의 트랜스 조명을 시연합니다. 세 번째는 생체 내 전기천공법입니다.

우리는 패들 스타일 전극 배치 및 배아 일 11.5 마우스 O 지원의 전기천공을 보여줍니다. 4부는 대표적인 결과입니다. 우리는 후기 배아 및 출생 후 초기 달팽이관에서 GFP의 발현을 보여줍니다.

이는 배아 일 11.5 파트 1 복부 개복술 절개술에서 플라스미드 발현을 사용한 오티스의 생체 내 전기천공법의 결과입니다. 댐은 목 뒤의 피부, 꼬리 및 왼쪽 뒷다리를 잡고 단단히 고정됩니다. 펜토바르비탈 나트륨 기반 마취제의 복강 내 주사는 70% 에탄올로 복부를 면봉으로 닦은 후 투여됩니다.

마우스는 마취제가 작용할 수 있도록 4-5분 동안 가정용 케이지 안에 넣습니다.발과 꼬리를 꼬집어 마취의 적절성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 댐은 꼬리 꼬집음에 반응하여 셔터를 잠그고 유해한 자극에 반응하지 않기까지 2분이 더 걸립니다.

멸균 안과 연고를 눈에 바르면 각막이 건조되는 것을 방지할 수 있습니다. 우리는 털과 비듬의 확산을 최소화하기 위해 화학 흄 후드로 수술 부위를 준비합니다. 털은 복벽을 덮고 있는 피부를 노출시키기 위해 가는 칼날로 면도합니다.

완전한 털 제거는 수술 후 절개 부위의 치유를 용이하게 합니다. 복부 피부의 소독은 70% 에탄올 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 가며 통과하여 이루어집니다. 항상 목봉에서 코들로 스와이프하고 신선한 수술용 면봉 또는 면봉 어플리케이터를 사용하십시오.

각 패스에 대해 우리는 댐이 반응하지 않는지 확인하기 위해 소독 중 호흡의 깊이와 질을 평가합니다.그 후, 두 번째 70% 에탄올 통과 후, 우리는 즉시 망할 복부 표면을 멸균 드레이프 위에 놓고 2-3분 동안 가열된 패드에 올려 놓고 그녀를 따뜻하게 하기 위해 2-3분 동안 그녀를 따뜻하게 했습니다. 이 시기는 마우스 생존 수술 일지에 수술 전 데이터를 기록하기에 편리한 시간입니다. 추가 정보로 마우스 생존 수술 데이터 시트가 첨부되어 있습니다.

데이터 시트와 동물 관리 프로토콜을 포함하여 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 수술 전 및 수술 후 데이터를 모니터링하는 방법을 확인할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 각 수술 대상자에 대해 하나의 로그 시트를 작성합니다. 우리는 멸균 환경에서 수술을 수행하는 것을 선호하지만 일반적으로 설치류에는 필요하지 않습니다.

작업 표면은 송풍기 모터 및 플레넘 하우징과 분리되어 있어 진동이 사용자에게 전달되지 않습니다. 미세주입 동안, 우리는 자궁 내 유전자 전달을 용이하게 하기 위해 층류 후드에 가한 수정 사항의 개략도를 추가 정보로 추가했으며, 필수적인 변경 사항은 낮은 와트 챌린지 및 트랙 조명 컷아웃과 기기 전원 코드를 위한 숨겨진 콘센트, 액세서리 전기 회로를 위한 라우팅 경로입니다. 수술실은 전기 젖산 링거 IV 백, 온탕, XY, Z 매니퓰레이터, 실체 형광, 해부 현미경, 광섬유 광원 및 수술 기구로 구성됩니다.

풋 페달은 마이크로 인젝터를 트리거하는 데 사용되며 전기 퍼터가 초점을 맞춥니다. 스코프 수술 기구는 오토클레이브에서 멸균됩니다. 기구는 유리 구슬 살균기를 사용하거나 바늘 드라이버를 다시 고압멸균하여 마우스 간에 재멸균해야 합니다.

발리, 가위, 반지, 집게 및 혈관 집게는 필수 도구입니다. 복부 정중선 절개, 혈관 겸자로 피부를 잡고 공 팁 가위로 외피를 절제하고 절개 부위를 10-14mm 연장합니다. linea alba라고 하는 연결된 조직의 흰색 무혈관 띠를 확인하고 복부의 복부 정중선은 공 끝이 있는 가위로 선형 alba를 절개합니다.

장이나 서혜부 지방 패드를 긁지 않도록 주의합니다. 즉시 멸균 Prewarm 젖산 링거 용액으로 복부를 세척하십시오. 피부와 복벽의 절개 부위에 출혈이 있는지 평가합니다.

뭉툭한 집게로 직접 누르면 경미한 출혈이 있는 경우 이를 멈추고, 끝이 뾰족한 집게로 오른쪽과 왼쪽 자궁 뿔을 외부화합니다. 집게의 고리 모양의 한쪽 끝으로 오른쪽 자궁 뿔을 부드럽게 잡고 자궁을 정중선 절개 쪽으로 당깁니다. 자유로운 손을 사용하여 댐의 측면을 부드럽게 조작하여 자궁을 쉽게 연결할 수 있습니다.

집게는 자궁을 압박하고 빼내는 데 사용되지 않습니다. 자궁 혈관 구조나 배아를 손상시킬 수 있으므로 왼쪽 자궁 뿔에 대해 외재화 절차를 반복합니다. 즉시 새로 외부화된 자궁 뿔에 예열 젖산 링거 용액을 세척하고, 내부 지방 패드 또는 장이 자궁과 함께 외부화되는 경우 장을 부드럽게 다시 삽입합니다.

이것은 자주 발생하지 않습니다. 파트 2 자궁 마이크로 주사. 댐은 긴 작동 거리 대물렌즈 아래에 배치되고 부드러운 케이블 광섬유 조명이 자궁 벽에 설정됩니다.

자궁은 자유로운 손의 손가락으로 부드럽게 눌러집니다. 배아의 방향을 쉽게 식별할 수 있도록 합니다. 광섬유 케이블의 빛은 배아 방향을 정확하게 평가하는 데 필요한 가장 낮은 강도여야 합니다.

강렬한 빛은 자궁에 열을 전달하여 합병증을 유발할 수 있습니다. 우리는 한 손에 광섬유 빛과 자궁을 잡고 자유로운 손에 손가락을 사용하여 부드러운 촉진으로 배아의 위치를 변경합니다. 다음 세 가지 비디오에서 현미경 EC 클립과 자궁에서 관찰되는 일반적인 배아 방향을 보여줍니다.

관찰자는 트랜스 일루미네이션 동안 우리가 보는 미시적 시야를 볼 수 있지만, 자궁의 흑백 트랜스 일루미네이션에서는 생체 내에서 배아의 방향을 감지할 수 있습니다. 이 예에서 배아는 배쪽 표면이 관찰자를 향하는 헤드스탠드 위치에 있습니다. 자궁을 앞뒤로 움직이면 오른쪽과 왼쪽 뒷다리, 꼬리와 왼쪽 눈의 두족을 감지할 수 있습니다.

이 예에서 배아는 다시 헤드스탠드 위치에 있지만 전방 후방 축에 대해 약 90도 회전합니다. 자궁을 앞뒤로 부드럽게 움직이면 왼쪽 뒷다리와 왼쪽 뒷다리를 정의하는 패들 모양을 볼 수 있습니다. 뒷뇌도 분명합니다.

배아는 왼쪽이 관찰자를 향하도록 직립 위치에 있습니다. 초기 제4심실은 뒷뇌의 밝은 부분으로 감지될 수 있습니다. 왼쪽 눈의 두족, 왼쪽 네 다리 및 왼쪽 뒷다리도 분명합니다.

자궁에 대한 부드러운 압력은 배아의 방향을 약간 변경하여 일차 두정맥의 주요 몸통과 각각 흰색과 검은색 별표로 표시된 전방 및 후방 가지를 감지할 수 있도록 합니다. 앞으로 살펴보겠지만, 오티스는 1차 두정맥의 전방과 후방 분지 사이의 중간에 위치합니다. 오티스 자체는 투과조명으로 자궁을 통해 볼 수 없습니다.

두 개의 연속적인 비디오 현미경 클립을 통해 미세 주입을 위해 배아를 Otis 보조 장치로 재배치하는 방법을 보여줍니다. 목표는 측면 머리에서 오티스의 위치를 보간할 수 있는 배아 랜드마크를 식별하는 것입니다. 예를 들어, 우리의 목표는 배아를 등쪽에서 측면 위치로 재배치하여 주요 머리 정맥을 식별할 수 있도록

중뇌파, 제4심실, 좌측은 등쪽 위치에서 분명합니다. 자궁에 대한 부드러운 압력은 배아의 방향을 등쪽에서 뒤쪽으로 이동시킵니다. 좌안, 두뇌, 제4심실은 쉽게 볼 수 있습니다.

1차 두정맥과 별표로 표시된 뒤쪽 분기도 분명합니다. 일차 두정맥의 앞쪽 가지는 명확하게 감지되지 않습니다. 다시 말하지만, 우리의 목표는 배아가 일차 두정맥을 식별할 수 있도록 방향을 잡는 것이지만, 자궁 미세주입에 적합한 더 높은 배율 하에서 확인할 수

자궁 혈관, 탈락 밴드 및 왼쪽 눈은 이 측면 관점에서 볼 수 있습니다. 자궁에 대한 부드러운 압력은 배아의 위치를 이동시켜 네 번째 뇌실 왼쪽 눈을 감지할 수 있습니다. 기본 머리 정맥과 별표로 표시된 뒤쪽 가지, 기본 머리 정맥과 그 가지는 미식 축구 직립 모양을 만듭니다.

이낭은 자궁을 통해 볼 수 없지만 직립의 중앙에 있습니다. Lynn은 한 배아에 대한 주입 시퀀스를 시작했습니다. 그녀는 자궁을 트랜스로 조명하고, 마이크로 주사를 위해 배아의 방향을 바꾸고, 빠른 녹색으로 채워진 마이크로 주사 피펫을 현장으로 가져옵니다.

마이크로 주입 피펫은 X, Y, z 미크론 매니퓰레이터가 고정하는 피펫 홀더에 부착됩니다. 매니퓰레이터 마그네틱 스탠드는 테프론 베이스가 있는 강판에 부착되어 미세주입 피펫의 전체적인 위치를 쉽게 지정할 수 있습니다. 바늘은 매니퓰레이터의 전방 마이크로미터 조절 손잡이를 적절하게 사용하여 전진합니다.

제작된 피펫은 초기 오티스 단계 마우스 배아에 외상성 미세주입을 하는 데 필수적입니다. 우리는 수평 피펫 풀러로 두꺼운 벽의 borosil 유리 모세관 튜브를 당깁니다. A에 표시된 결과 피펫은 B의 화살촉으로 표시된 약 14-16 미크론 외경 위치에서 집게로 수동으로 파손됩니다. C에 표시된 피펫의 거친 파손은 들쭉날쭉하고 깨지기 쉽습니다.

패널 D에서 볼 수 있듯이 피펫 팁을 날카롭게 하기 위해 피펫을 약 20도로 경사지게 하며, 미세주입 피펫을 당기고 베벨링하기 위한 매개변수는 첨부 텍스트에 제공됩니다. 다음 두 개의 비디오 현미경 클립에서 배아 11.5일과 12.5일에 마우스 이이로의 미세 주입이 보조하는 것을 보여줍니다. 우리의 목표는 배아일에 자궁 미세주입, 11.5 마우스 이빨을 시연하는 것입니다.

먼저, 자궁이 없는 상태에서 이암을 주사하여 올바르게 표적화된 주사가 어떻게 나타나는지 명확하게 보여줍니다. 그런 다음 진정한 트랜스 자궁 마이크로 주사를 시연합니다. 이 첫 번째 주사를 위해 자궁을 절개하여 내장 낭이 돌출될 수 있도록 내장 난황낭 위에 있는 탈피 밴드를 제거했습니다.

태반은 자궁에 붙어 있고 배아는 살아 있습니다. 자궁이 발굴되어 제거되면, 제4심실, 일차 두정맥, 전방 및 후방 가지, 피펫 및 낭종의 대략적인 위치가 흰색으로 표시됩니다. 이 주사 순서가 시작되면 내장 난황낭 혈관 구조에서 혈류가 감지됩니다.

피펫은 내장 난황낭을 통해 진행되고 다이는 오시스 노트, 배측의 엔도 림프관 및 직립 중앙의 이빨 위치에 주입됩니다. 이는 1차 두정맥의 전방과 후방 분기 사이의 중간에 있으며, 자궁 미세는 배아의 날에 주입됩니다. 11.5 생쥐 이단은 이의 위치를 추정하기 위해 기본 두정맥과 그 가지 중 적어도 하나를 감지해야 합니다.

우리의 표적이 도식화된 예에서 1차 두정맥의 전방 및 후방 분지가 모두 흰색으로 표시된 OUC 영역으로 감지됩니다. 배아에 대한 보다 현실적인 표현은 일차 두정맥의 주요 몸통이 그 가지 중 하나와 함께 감지되고 일차 두정맥의 뒤쪽 가지만 보이는 예이지만, 이것만으로도 이의 위치를 해석하기에 충분합니다. PT는 자궁을 통해 진행되고 염료가 이암에 주입됩니다.

양강에서 염료가 제거될 때까지 30초 동안 기다리면 배측의 내막관과 전정을 볼 수 있습니다. 우리는 해부학적 관점을 제공하기 위해 방금 주입한 낭종의 배아에 대한 저배율 보기로 결론을 내렸으며, 이 보기에서 네 번째 뇌실, 왼쪽 눈, 자궁 혈관 조직이 보입니다. 우리는 배아 12일차 마우스 귀 낭종에 트랜스 및 미세 주입과 뒷뇌의 초기 제4뇌실에 미세 주입을 보여줍니다.

Transillumination을 통해 이 왼쪽 측면에서 볼 때 눈뿐만 아니라 기본 머리 정맥을 감지할 수 있습니다. 피펫은 자궁을 통해 이낭으로 전진하고 내강을 채우기 위해 주입됩니다. 제4심실에 주입하기 위해 배아를 90도 회전시켜 뒷뇌의 등쪽 모습을 보여줍니다.

주입된 왼쪽 낭종은 이제 왼쪽에 있습니다. 피펫은 자궁을 통해 진행되며 빠른 녹색이 lor와 혼합됩니다. 공액 덱스트란을 제4심실에 주입합니다.

주입된 염료의 양은 생체 내에서 중뇌로 들어가지 않습니다. 형광은 제4심실에서 덱스트란 국소화를 검증하기 위해 주입 후 평가됩니다. 그런 다음 배아는 등쪽에서 측면 위치로 방향을 변경합니다.

엔도 림프관(endo lymphatic duct)은 이 측면에서 볼 때 네 번째 뇌실의 복부에 있습니다. In vivo 형광은 제4뇌실에서 덱스트란의 국소화를 검증합니다. 태어날 때, 우리는 epi 형광을 사용하여 네 번째 뇌실에서 새끼의 녹색 형광을 선별합니다.

해부: 뒷뇌에 녹색 형광을 가진 현미경 새끼는 배발생 3부, 생체 내 전기천공법 중에 조작된 내이를 가지고 있습니다. 낭종에 발현 플라스미드를 채운 후, 자궁은 예열 젖산 링거 용액으로 신선하게 세척됩니다. 투과조명은 전극 영역에서 ODU 낭종의 중심을 쉽게 잡을 수 있습니다.

광섬유 빛의 금속 머리는 자궁 표면에서 후퇴합니다. 구형파 펄스 트레인을 시작하기 전에 다음 비디오 현미경 클립에서 생체 내에서 완전한 전기천공법 주기를 보여줍니다. 배아일의 전기천공술, 11.5 마우스 귀 낭종은 자궁에 패들 스타일 전극을 부드럽게 배치해야 합니다.

이 예시에서, 좌측 귀 낭종은 발현 플라스미드로 채워졌고, 자궁은 젖산 링거로 새로 세척되었습니다. 음극은 채워진 이낭종에 대해 측면으로 위치하고, 및 ode는 ation 서열의 시작 부분에서 내측으로 위치하며, 이낭종은 패들 필드의 중앙에 위치합니다. 자궁은 부드럽게 압박되고 구형파 펄스 트레인은 풋 페달 스위치로 시작됩니다.

이상적으로는 펄스당 60-100밀리암페어의 전류가 전달됩니다. 그런 다음 자궁을 풀어 즉시 세척합니다. 갓 세척된 자궁은 고리 겸자로 부드러운 압력으로 복강으로 되돌아갑니다.

자궁이 내체화되면 복강은 약 4mil의 젖산 링거로 플러시되고 복강에 약 1mil의 젖 링거가 남아 복부의 수분 유지를 돕기 위해 복부 수술 직후 평소보다 물을 덜 마시게 됩니다. 복벽과 피부는 바늘 드라이버를 사용하여 재흡수성 봉합사로 봉합합니다. 바늘 드라이버에는 닫기를 단순화하는 가위가 내장되어 있습니다.

우리는 복벽과 피부 모두에 러닝 스티치를 선호합니다. 절개 부위에서 추가 지지를 제공하기 위해 다른 모든 스티치를 잠급니다. 우리는 댐을 회수 케이지에 넣기 전에 비스테로이드성 항염증제를 피하로 투여합니다.

기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 선호하는 예방적 진통제에 대해 수의사와 상의하십시오. 댐은 멸균 드레이프에 자리 잡고 가열된 회수 케이지의 바닥에 놓입니다. 회수 케이지에는 둥지 재료, 덮개용 빨간색 튜브, 실험실 차우, 물병이 들어 있습니다.

케이지는 수술 후 아침에 상단에 필터 보닛을 씌워 재조립합니다. 댐은 아름답게 손질되어 있고, 보행이 가능하며, 뒷다리로 균형을 잡고 열린 케이지 꼭대기에 대해 물어볼 수 있습니다. 복부의 봉합선은 깨끗하고 건조하며 분리, 발적 또는 부기의 흔적이 없습니다.

우리는 자궁 내 유전자 전달을 위한 동물 관리 프로토콜 개발에 대해 논의하는 문서를 첨부했습니다. 이 문서에는 동물 관리 및 사용 위원회와 협의하여 기관별 프로토콜을 설계할 때 유용할 수 있는 언어가 포함되어 있습니다. 4부, 대표적인 결과.

대표적인 결과 패널 A와 B는 출생 후 6일째 되는 새끼의 대표적인 달팽이관을 보여주며, 이 새끼는 배아 11.5일에 강화된 녹색 형광 단백질 발현 플라스미드를 오티스에 주입한 다음 전기를 주입했습니다. 달팽이관 측벽은 중간기와 정점에서 제거되었습니다. 달팽이관의 기저부에서 중간기까지 GFP 발현만이 존재하며 패널 B에 표시된 유모 세포 마커 미오신 7 A의 분포를 따릅니다. 패널 C는 배아 일의 저배율 컨포칼 투영을 보여줍니다.

18.5 미오신 7 A 항체로 염색된 코르데 면역의 마우스 기관은 코르데 기관 전체에 분포되어 있습니다. 패널 D는 배아 날의 고배율 컨포칼 투영을 보여줍니다. 18.5 cin으로 염색 된 corde의 마우스 기관. 7.

GFP 발현은 내부 및 외부 유모 세포, 지절간 세포, 기둥 세포 및 TER 세포에서 감지됩니다. Electroporation은 배아 일째에 Otis로 유전자 전달을 매개했습니다 11.5 코드 기관 내의 모든 구성 세포 유형을 발생시키는 Transfect 전구