Name: 초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 초기 마우스 배아에 세포와 DNA를 정확하게 전송하는 방법을. 배아 발달 중 유전자 기능과 체외 배양 세포의 생체 내 잠재력을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

원고에 대한 의견을 제시해 주신 Filip Wymeersch와 Anestis Tsakiridis님, 동물 관리에 도움을 주신 SCRM 동물 부서 직원, 면역조직화학 시약을 제공해 주신 Stuart Forbes 교수님께 감사드립니다. 이 작업은 MRC 보조금 Mr/K011200/1과 중국 장학금 위원회의 지원을 받았습니다.

동물 (과학적인 절차)에 규정 된 모든 동물 실험은 프로젝트 라이센스 번호 4천4백35분의 60에서 영국 홈 오피스 규칙에 따라 (1986) 법을 수행 하였다. 특정 발달 단계에서 배아를 수집하려면 시간이 초과 교배는 O / N을 설정했다. 질 플러그를 찾는 일에 정오 배아 일 (E) 0.5를 지정되었다. 1. 전의 VIVO 문화 E7.5 또는 E8.5 Postimplantation 배아를 해부 <ol><li> 자궁 전위에 의해 임신 여성 쥐를 희생. </li><li> 집게로 잡고, 가위를 사용하여 자궁을 분리하고, M2 매체로 가득 30mm 접시에 배치합니다. </li><li> 조심스럽게 미세 집게 두 쌍을 사용하여 근육층을 떨어져 눈물. </li><li> 배외 (extraembryonic) 충치 구멍을 뚫거나 않도록 조심하면서 탈락을 벗겨. </li><li> 집게로 곤란 천천히 배아에서 분리하여 라이 헤르의 막을 제거합니다. </li><li> 해부에서 배아를 확인실체는 난황, 양막과 ectoplacental 콘이 그대로 있는지 확인합니다. </li><li> 얼음에 30mm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 ( &#39;얼음 플랫폼&#39;)에 부분적으로 진정 배아를 피펫과 장소를 사용하여 M2의 깨끗한 접시에 배아를 전송합니다. </li><li> 필요한 경우, 최대 1.5 시간 동안 얼음 플랫폼, 예를 들어., 미디어 준비 또는 작은 배치의 조작시에 M2에 저장 배아 ~ 실온에서 3-4 배아. 참고 : 복구 및 설치류 배아의 해부는 이전에 7,8,16 상세하게 설명하고있다. </li></ol> 2. 배아 문화 미디어를 준비 <ol><li> 갓 시판 쥐의 혈청 중 하나를 해동 (사양 Glanville 존스 등. 13 참조), 또는 쥐의 혈청 열은 56 ℃에서 30 분 동안 불 활성화 및 1 ml의 고정 된 COPP과 Cockroft (16)에 따라 자체 준비 -80 ℃에서 분취 참고 : 시판 래트 혈청이 허용<html> 혈청 사내 준비하지만, 24 ~ 36 시간의 배양 기간을위한 48 시간까지 배양 기간 동안 우수한 우리의 경험에서. </li><li> 갓 과잉 준비 (예., 10 ㎖) 글래스 최소 필수 중간 (GMEM), 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 2 mM L- 글루타민 및 1 mM의 피루브산 나트륨으로 이루어진 정의 보충한다. </li><li> 배양하려는 각 단계의 배아의 개수에 따라 필요한 배양 배지의 부피를 계산한다 (섹션 3 참조). 50 % 배지를 만들기 위해 정의 보충제 래트 혈청을 혼합 (1 : 1 (v / v)의 래트 혈청 : 정의 첨가제) 및 / 또는 75 % 배지 (3 : 1 (v / v)의 래트 혈청 : 정의한 보충). </li><li> 0.45 μm의 필터를 통해 배아 배양 배지를 전달하고 10,000 IU / ml의 페니실린 및 10 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신을 추가합니다. 참고 : 갓 해동 L- 글루타민 나트륨 피루 베이트 솔루션은 체외 배양시 배아의 개발에 매우 중요합니다. </li></ol>전자 &quot;&gt; 3. 다른 배아 단계에 대한 전의 VIVO 문화 조건 <ol><li> 24 시간 동안 37 ℃ 공기 중에서 5 % CO 2와 함께 제공 인큐베이터에서 4 웰 플레이트를 사용하여 정적 문화 : E7.5 배아하십시오. 1 ml의 50 %의 배양 배지에서 잘 당 두 개의 배아까지 문화. </li><li> E8.5 배아의 경우 : 24 시간 (배아 당 1 ml의 50 %의 배양 배지)에 대한 37 ℃ 공기 중에서 5 % CO 2를 연속 가스 처리를 포함 35 회전 속도를 올린다 / min으로 회전하는 롤러 배양 장치 (8)를 사용합니다. </li><li> E9.5 배아의 경우 : 24 시간 (당 1 ml의 75 % 배지 35 속도를 올린다 37 ℃에서 5 % CO 2, 40 % O 2 55 % N 2와 함께 공급 / 분의 혼입 기체를 회전 롤러 배양 장치를 사용 태아). 참고 : 3 시간 이내 문화 배아를 불리하게 개발에 영향을 미칠 M2에 장기간으로 쥐를 안락사 후. 체외 배아 문화의 방법에 대한 COPP과 Cockroft (16)을 참조하십시오. </li></ol> 4. GraftinE7.5 또는 E8.5 마우스 배아에 들어 배양 세포 <ol><li> 물리적 20-200 μL 피펫 팁을 사용하여 6 웰 배양 접시에서 보편적으로 GFP를 발현 EpiSCs을, 긁어 배아를 함유 30mm 접시에 배치 참고 : 배아의 세포 덩어리를 삽입하려면 세포를 물리적으로 폐기보다는 트립신해야합니다. </li><li> 입 피펫을 만들기 위해 흡인기 튜브에 손으로 뽑아 접목 모세관을 연결합니다. </li><li> 조심스럽게 이식 모세관에 크기의 하나 또는 그 이상의 세포 덩어리&gt; 20 세포를 그릴 입 피펫을 빨아. </li><li> 부드럽게 부분적으로 큰 덩어리를 분산, 세포를 날려. </li><li> 모세 혈관의 개통에 그것을 가까이 유지, ~ 10-20 세포를 포함하는 하나의 세포 덩어리를 선택하고 다시 이식 모세관에 빨아. 에 반복적으로 모세 혈관에서 세포 덩어리를 이동하지 않도록주의, 작은 조각으로 해체를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 포셉 한 쌍의 장소에서 느슨하게 배아를 잡고 이식을 삽입관심의 영역으로 모세관 개구부를 만들 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 배아에 박혀 10-20 세포의 짧은 문자열을 떠나, 이식 모세관에서 덩어리를 추방. </li><li> 배아의 원하는 번호를 이식 절차를 반복합니다. 편의를 위해 3-4 배아의 배치 크기를 사용합니다. </li><li> 과도한 빛과 열에 배아 노출을 방지하기 위해 최소로 촬상 시간 유지 M2 매체, 화상 카메라를 해부 현미경 형광 화합물을 사용한 그래프트 배아 같은 접시에 배아를 이탈. 주의 : 이러한 카메라와 현미경뿐만 아니라 형광체의 형광 특성과 강도의 사양에 의존하므로 실험적 촬상 시간을 결정한다. </li><li> M2 매체의 최소한의 볼륨 pastette에서 배아를 이동시켜 배양 배지 (섹션 3 참조) 즉시 이미징 후를-평형 사전. 참고 : 조심스럽게 이식 후 배아의 형태를 검사합니다. intac 만 문화T 배아. </li></ol> 5. 제 일렉트로 재료 및 장치 설치 (Electroporation에 실험에 앞서 다음을 준비) : <ol><li> DNA를 주입 피펫의 경우 : 수평 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 DNA를 주입 피펫을 잡아 당깁니다. 주입 피펫은 배아 캐비티 내로 DNA를 주입 할 때 조직 손상을 방지하기 위해 개구 10 ㎛ 미만으로 미세한 팁을 가져야한다. </li><li> 유리 모세관 전기의 경우 : 20 ~ 30 μm의 하나의 내부 직경에 DNA를 주입 피펫의 개통을 잘라 microforge를 사용합니다. 모세관 전기 대한 배아와 접촉 할 때 세포 손상을 방지하기 위해, 유리 모세관의 선단이 깨끗하게되지 날카로운 깨진 절단 에지를 포함해야한다. </li><li> 수제 모세관 전극 (양극) (그림 1)의 경우 : 차기에 초점을 맞 춥니 다 20 ~ 30 μm의 직경의 고정 구멍에 전기 유리 모세관에 0.2 mm 직경 백금 와이어를 삽입현재 RIC와 배아에 대한 관심의 작은 영역으로 플라스미드 DNA를 제공합니다. </li><li> 수제 L 자형 전극 (음극) (그림 1)의 경우 : &quot;L&quot;길이 약 1mm의 수평 부분과, &quot;L&quot;모양을 만드는 0.2 mm 직경의 백금 와이어를 구부리. </li><li> 얇은 절연 전선에 각각의 백금 전극을 부착하고 절연 테이프로 덮여 미세 주사 바늘 홀더에 삽입합니다. </li><li> 표준 미세 조작기구 홀더에 바늘 홀더를 탑재합니다. </li><li> 도 1에 도시 한 바와 같이 회로를 연결 : 전원 공급 장치의 양극에 모세관 연결 전극; 멀티 미터의 양극에 L 자형 전극을 연결; 전원 공급 장치의 음극에 mulimeter의 음극을 연결한다. </li></ol> 6. Electroporation에 E7.5 또는 E8.5 마우스 배아 <ol><li> 상단의 1-2mm 내 PBS로 전기 유리 모세관을 채우기 및 strai를 삽입유리 모세관으로 GHT 백금 전극 (양극)은 또한 모세관의 바닥에 도달 할 때까지. </li><li> PBS로 채워진 30mm 페트리 접시의 표면에 L 자형 전극 (음극)을 고정. </li><li> PBS 채워진 전기 접시에 M2 매체로부터 배아를 전송합니다. </li><li> 태아의 양수 공동으로 측면 epiblast에서 주사 바늘을 삽입합니다. 완전히 꽉 찰 때까지 공동으로 : 공기 피코 펌프를 사용하여, DNA 용액 (GFP 또는 pCAG-GFP 0.01 % 녹색 식용 색소 염료와 1.5 ㎍ / ㎖의 pCAG-Cre 호텔)을 주입. E7.5-E8.5 배아를 들어, 이하의 5 μL의 DNA 용액을 한 배아 요구된다. 지표로 녹색 염료를 사용하여 배아를 폭발하지 않도록주의. </li><li> 신중 전극 사이 배아를 놓고 DNA가 전달 될 정확한 위치에 캐 필러 리를 이동 전극. 주 : 배아의 방향이 DNA는 전기 천공 될 영역에 따라 달라진다. </li><li> Electropo각 펄스 사이에서 1 초 간격으로, 6에서 50 밀리 초 펄스 지속 시간을 각각 200 볼트 (V)를 이용하여 배아 평가. </li><li> 하기 배아를 전송 일렉트로 직후 배지 미리 평형화. 원하는 경우, 다음 배아 대한 프로세스를 반복한다. 참고 : 멸균 용기에 배지를 추가하고 매체를 미리 평형 문화 인큐베이터에 넣어. </li><li> 문화 후 일렉트로 세포에게 2 시간을 감지 pastette를 사용하여 M2 매체의 깨끗한 30mm 페트리 접시에 배아를 전송합니다. 화상 해부 현미경 형광 화합물을 이용하여 단계 5.9에서와 배아. </li><li> 촬영 직후 pastette을 사용 문화에 다시 배아를 전송합니다. </li><li> 원적외선 세포막 투과성 핵 염료로 배아를 얼룩, 전기에 의한 죽은 세포를 감지 : 전기 후 10 분 2 시간 동안 37 ℃에서 (1 배아 배양 배지 200) (선택 사항) </li><li> 엠브리를 수정, 일렉트릭 세포를 계산하려면4 ℃에서 2-4 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 OS는, 자외선 또는 원적외선 Counterstain과 형광 핵 및 공 촛점 현미경 이미지 (선택)를 이용하여 배아 핵을 염색. 참고 : PBS에 너무 오래 방치하면 배아 성장에 부정적인 영향을받습니다. 따라서, 각각의 배아를 electroporate하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 (배아 당 &lt;5 분)을 보장한다. </li></ol>

<ol><li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+med%22%5BJournal%5D)">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063(2012).</li>
<li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li>
<li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li>
<li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li>
<li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li>
<li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22JOP%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107(2007).</li>
<li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li>
<li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate-Mapping+Technique%3A+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols.+2007%22%5BJournal%5D)">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893(2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li>
<li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li>
<li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCopp%2C+AJ+%22Postimplantation+mammalian+embryos+%3A+a+practical+approach%22">Postimplantation mammalian embryos : a practical approach</a>. , IRL Press. (1990).</li>
<li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+the+formation+of+a+mammalian+body+plan%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li>
<li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li>
<li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li>
<li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation%3A+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li>
<li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li>
<li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937(2014).</li>
<li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li>
</ol>

저자는 선언할 재정적 또는 기타 이해 상충이 없습니다.

접목 세포 이식 실험에서 중요한 단계 덩어리의 분열을 방지하기 위해, 이상적으로는 하나의 동작의 셀 간섭 문자열의 삽입이다. 이 기술은 입 피펫을 조절하는 연습이 필요합니다. 공여 세포는 숙주에서 잘 통합하면, 이들의 유도체는 배아에 분산시키는 것이다. 상기 분산 도너 유래 세포는 숙주에서 적절히 분화 여부를 확인하기 위해, 면역 염색은 배아 부에서 수행 될 수있다. 공여 세포는 숙주 환경과 호환되지 않을 경우, 이들은 어느 검출 (이들이 배아로부터 토출되는 바와 같이) 또는 배양 후에 배아 비법 덩어리를 형성 할 수 없다. 분산 된 세포 및 세포 덩어리가 모두 관찰 된 경우, 이는 너무 많은 세포가 그래프트 된 나타낼 수 있고, 주변의 숙주 세포와 상호 작용할 수없는 과도한 공여 세포는 덩어리 형성을 초래. 이 경우, 추가로 함유 그라프셀들의 작은 수를 행할 수있다. 세포 이식 기술의 주요 한계는 48 시간 이상이 달성되어 있지 않은 기간 동안 마우스의 생체 외 배양 세포를 사람의 전체 생체 전위를 결정하는 것이 가능하지 않다는 것이다. 초음파 유도 세포 주입과 결합 된 경우, 이는 자궁 내 태아에 배양 된 세포를 전달하는 것이 가능할 수있다. 세포 이식 실험이 광범위하게 우리 그룹에 사용 된 우리에게 다양한 세포 유형 4,21,22의 생체 가능성에 대한 중요한 단서를 제공 한 요약. 그것은 초기 postimplantation 배아에서 체외 배양 된 세포의 생체 내 잠재력을 평가하는 일반적인 유틸리티의 기술이다. 전기 이 연구에서 우리는 단지 표시했지만 그것은 내가, epiblast을 대상으로 모세관 전기 기술을 사용하는 것이 효율적이다t는 의도적으로 이러한 내배엽 세포와 같은 다른 배엽을 대상으로하는 것도 가능하다. 모세관 전기 천공 법을위한 중요한 단계는 초기 PBS 마우스 배아에 매우 차선 때문에 각각의 태아 (태아 당 &lt;5 분) electroporate하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 것이다. 우리의 데이터는 위의 배아에서 대부분의 지역에서 전기가 배아의 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나, 노드에 전기가 이상 발생시 원인 및 배아의 조기 사망을했다. 이는 중요한 시그널링 센터 (23)를 형성하는 세포의 손상 또는 사망 가능성이 높다. 따라서,이 영역은이 기술 회피되어야 할 것이다. 또주의해야 할 점은 결과 섹션에서 언급 한 바와 같이 epiblast 또는 원시 행진 세포를 대상으로 한 반면, 일부 내배엽 세포는 또한 전기 천공 된 점이다. DNA는 epiblast 상피 아래 간극을 통해 내배엽에 도달 때문일 수있다. 내배엽은 상피 세포의 구성과 일 우리의 경험에ESE 세포는 DNA를 차지하기 위해 더 높은 경향이있다. 운명 매핑에이 기술을 적용 할 때 따라서, 그것은 처음에 DNA를 가지고있는 세포를 평가하는 것이 중요하다. GFP 플라스미드 효율적이 연구에 도시 된 전기 매개 변수를 사용하여 전달 될 수 있고, 다른 DNA 구조체의 효율이 변할 개별 최적화를 필요로 할 수있다 : 또한 pCAG-GFP 및 pCAG-Cre 호텔이 있지만 주목해야한다. 플라스미드 형질 어려운 것으로 발견되면 DNA 농도, 전기 전압 또는 펄스의 수의 변화는 이루어질 수있다. 제한된 세포 사멸과 배아에서 거의 세포에 GFP 플라스미드 : 요약하면, 우리의 최적화 된 모세관 전기 시스템은 효율적이고 재현성 GFP 또는 Cre 호텔을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 고가의 또는 고도의 전문 장비를 필요로하지 않기 때문에, 셀 추적 연구 또는 이소성 발현 또는 조건부 삭제 (O)의 효과를 시험에 아주 유용하게 사용될 수있다초기 배아에서 F 유전자는 경우 전기는 floxed 조건부 돌연변이 대립 유전자를 운반하는 배아에서 수행된다. 따라서,이 기술은 전기 천공 지역화 야생형 배아 환경의 컨텍스트에서 셀별로 셀 고유 인자의 역할을 이해하는데 유용한 기능성 도구를 제공한다.

세포 배양에 널리 발생 생물학 연구에서 사용되어왔다. 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)와 epiblast 줄기 세포 (EpiSCs)는 체외에서 세 가지 배엽으로 분화 초기 포유 동물의 배아에서 세포 분화에 유용한 모델입니다 수 있습니다. 이러한 세포 라인의 유도는 체외 조작 및 초기 배아 패턴 동안 운영 지역화 신호 이벤트 및 전사 네트워크의 자세한 조사를 위해 기회를 열었습니다. 그러나, 배양에서 수행되는 조작의 생체 적합성을 결정하는 데 중요한 남아있다. 착상 전 배아 유래 마우스는 ESC의 생체 전위는 착상 전 배아 (morulae 또는 배반포) (1)에 다시 도입하여 평가하고있다. 그러나 postimplantation 배아의 epiblast 세포를 나타냅니다 EpiSCs는 착상 전 배아 2,3에 효율적으로 통합 할 수 없습니다. 우리 previo우리의 연구 결과는 postimplantation 배아 4에 이식 할 때 EpiSCs 효율적으로, 키메라를 생성하고 모든 배엽에 기여할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생체 외 배양 된 세포를 평가하는 가장 좋은 방법은 생체 내에서 해당 환경으로 도입하는 것이다. 전기는 생체 내 및 생체 외 실험 모두에서 표적 세포에 외래 분자를 제공하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 전기 에너지는 외인성 디옥시리보 핵산 (DNA) 또는 세포를 입력하는 리보 핵산 (RNA)를 허용 세포막에 다수의 구멍을 생성 할 수있다. 이 기술의 가장 큰 과제 중 하나는 높은 electrotransfection 효율 5,6 최적의 세포 생존 능력을 결합하는 것입니다. 배아 조직에서의 핵산의 전기 천공을 위해, 금 넓은 공간 범위 7-9의 셀 타겟팅 있도록 전극이 가장 일반적으로 사용되어왔다 도금. 더 LOCA를 달성하기 위해유전자 전달하게 안정적는 침상 전극은 전계 10,11 초점을 달성하기 위해 이용되었다. 이 방법을 사용하여, 저자는 일렉트로 후 약 30-60 세포 (11)를 구성하는 DNA를 흡수 한 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 정확 일렉트로 세포의 수를 조정하는 고정 폭 전극과 유지 어려운 것으로 보인다. 모세관 전기 기술은 단일 세포에 플라스미드 12-14를 전달하는데 사용되어왔다. 그러나,이 기술은 생체를 배아 플라스미드 electroporating 적용되지 않았다. 최근 마이크로 디바이스는 초기 postimplantation 마우스 배아 15 로컬 electroporate 몇 말단 내장 내배엽 세포 (이하 4 셀)로보고되었다. 그러나,이 장치가 효율적으로 타겟팅 외배엽과 중배엽 생체 수 있는지 아직 알려져 있지 않다. 이 연구에서 우리는 초기 게시물에 세포 및 유전자 기능을 평가하는 두 가지 새로운 방법을 설명-implantation 배아. 우리는 먼저 자신의 생체 내 잠재력을 평가하기 위해 초기 마우스 배아에서 정의 된 사이트에 체외 배양 된 세포를 이식하는 방법을 보여줍니다. 이식 세포와 그 후손의 통합이 모든 유전 태그 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 표시, 추가로 조직 특이 적 단백질의 면역 염색으로 검사 할 수있다 (4). 둘째, 우리는 정확하게 DNA를 제공하는 개선 된 방법을 설명 오히려 침상 전극을 사용하는 대신 전기를 통한 배아 국부 사이트. 우리는 뾰족한 유리 모세관 안에 세선을 삽입하고, 이러한 변형은 높은 효율과 제한과 셀의 소수의 DNA를 제공 할 수 있음을 입증 세포 죽음. 또한, 우리는 상이한 개구 크기를 갖는 유리 모세관을 이용하여, 우리는 일렉트로 세포의 수를 제어 할 수 있음을 보여준다. 따라서, 우리는 O이 방법은 적은 수를 포함하는 초기 배아 패턴을 연구하기 위해 아주 유용하게 사용될 수 있다고 생각F 세포.

<table><tbody><tr><td>펜치</td><td>Dumostar</td><td>T5390</td><td></td></tr><tr><td>해부 실체현미경&nbsp;</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체현미경 시스템&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라가 있는 반전 현미경</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX61</td><td></td></tr><tr><td>반전 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td>라이카 TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>11397863</td><td></td></tr><tr><td>30mm 페트리 접시&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>4-웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>179820&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2 미디엄&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>생명 기술</td><td>10010015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>피펫&nbsp;</td><td>NICHIRYO</td><td>니치펫</td><td></td></tr><tr><td>팁&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>685280</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터&nbsp;</td><td>SANYO</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>롤러 배양 장치&nbsp;</td><td>BTC 엔지니어링</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.45&micro; M, 멸균&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>글래스고 최소 필수 배지(GMEM)</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30549.01</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신 10.000UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>가스 카트리지 휴대용 메커 버너</td><td>COLEMAN&nbsp;</td><td>COLEMAN 250</td><td></td></tr><tr><td>얇은 벽 보로실리케이트 모세관 유리와 필러먼트, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td><td>하버드 장치</td><td>640798</td><td></td></tr><tr><td>아스스피레이터 튜브 어셈블리는 보정된 마이크로캐필러리 피펫을 위한 것입니다&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5177-5EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>플레밍/브라운 마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로포지&nbsp;</td><td>De Fonbrune</td><td>BS030301</td><td></td></tr><tr><td>공압 피코 펌프&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 구형파 펄스 발생기&nbsp;</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>녹색 식용 색소 염료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C.I. 42053</td><td></td></tr><tr><td>원적색 세포막 불투과성 핵 염료</td><td>Biotium</td><td>40060-T</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-Cre:GFP&nbsp;</td><td>애드진</td><td>#13776&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#16664</td><td></td></tr><tr><td>멀티미터</td><td>엑셀</td><td>XL830L</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터&nbsp;</td><td>라이츠&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mm 직경의 백금 와이어&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>E404-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>염소 항닭 IgY, HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2428</td><td></td></tr><tr><td>액체 DAB+ 기질 크로모겐 시스템&nbsp;</td><td>Dako</td><td>K3467</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>원적외선 형광 핵 카운터스테</td>인 <td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td></td></tr></tbody></table>

초기 postimplantation 마우스 배아로 세포 나 dna를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

초기 마우스 배아의 조작과 문화는 강력하면서도 크게 과소 활용이 모델 시스템의 가치를 향상시키는 기술이다. 반대로, 세포 배양 널리 발생 생물학 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 시험 관내 배양 된 세포는 진정 생체 세포 종류를 대표 여부를 결정하는 것이 중요하다. 개발하는 동안 그들의 기여 평가 하였다 배아에 세포를 이식하는 체외 배양 된 세포의 잠재력을 결정하는 유용한 방법이다. 본 연구는 생체 외 배양 하였다 이른 postimplantation 마우스 배아의 정의 부위에 세포를 이식하는 방법을 설명한다. 또한 높은 형질 전환 효율과 낮은 세포 사멸 모두 외인성 DNA를 수신하는 셀의 수의 정확한 정위 및 조정을 허용 공지 직경 유리 모세관을 사용하여 최적화 된 전기 천공 방법을 소개한다. 모든 SP를 필요로하지 않는 이러한 기술,ecialized 장비, 낭 배기 초기 기관 형성 단계 마우스 배아 수의 실험 조작, 배양 세포의 소집단의 헌신과 세포 분화에 현장에서 유전자 조작의 효과의 수 분석을 렌더링합니다.

접목 보편적으로 EGFP (mESCs에서 체외에서 유래 E6.5의 epiblast에서 파생 된 R04-GFP, 및 C2, 4) 표현 EpiSCs 수동으로 배양 접시에서 긁어 E7.5 배아의 다른 사이트 (그림 2A)로 이식되었다. 배아는 체외 배양하고 24 시간 후에 분석 하였다. 공여 세포의 분포는 형광 현미경에 의해 평가 하였다. 공여 세포가 혼입하는 경우, 이들은 증식 및 이들의 유도체는 호스트 배아 (도 2b) 내에 분산. 이는 호스트 배아 (도 2A 및 2B)에 효율적으로 통합 10-16 세포를 포함하는 이식은, 그러나, 더 많은 세포를 이식하는 것이 잘 chimaerism 초래하지 않는 것으로 관찰되었다. 대신, 이식 세포 비법 덩어리 (그림 2C 및 2D)를 생산했다. 전기 로배아의 특정 사이트에 : ssess 우리의 전기 시스템의 효율성, 우리는 GFP를 발현하는 플라스미드 (GFP pCAG-GFP 및 pCAG-Cre 호텔)을 전달했다. 이전의 연구 (11)과 일치, GFP + 세포는 배아에서 전기 (그림 2E와 2G) 후 1 ~ 2 시간을 검출되었다. 후반 원시적 인 행진 단계 배아에서 말초 epiblast 세포를 전기 천공 때, 라벨 세포는 배양 24 시간 (그림 2E와 2 층) 후 신경 외배엽에 기여했다. 이 결과는 낭 배기 단계의 배아 17 epiblast 세포의 알려진 운명의지도에 잘 대응한다. GFP 발현 플라스미드가 E8.5 (2-5 somites)의 원시적 인 행진에 전기 천공 때 마찬가지로, GFP + 세포는 후반 원시적 인 행진 18 알려진 운명의지도와 일치 근축 중배엽 (그림 2G 및 2H),에 기여 . 또한, 우리는, 일렉트로 세포에서 세 가지 배엽 (그림 2I-K)에 기여를 관찰전기 천공 절차가 생체 내에서 세포의 동작을 손상하지 않는다는 것을 시사한다. 그러나, 우리는 또한 epiblast (E7.5) 또는 원시 행진 세포 (E8.5)을 대상으로 한 반면, 일부 내배엽 세포는 (그림 3C 및 표 1) 전기 천공 된 것으로 나타났습니다. 모세관 전극을 사용하는 주요 장점 중 하나는 일렉트로 세포의 수는 단순히 그 개구부의 직경을 변화시킴으로써 제어 될 수 있다는 것이다. 일렉트로 세포의 수를 결정하기 위해, 배아는 전기 후 2 시간 고정 및 공 초점 현미경에 wholemount에 몇 군데 있었다. GFP + 세포 수는 수동 촛점 Z-스택에서 카운트 하였다. 표 1은, 그 이상의 셀에 의해 DNA 흡수를 20 내지 30 μm의 결과로부터 유리 모세관의 개구 크기를 증가 주어진 단계에 대한. 하나의 개구 크기 (E8.5 대 E7.5) 단계를 비교했을 때 더 많은 세포를 전기 천공 후단 것으로 나타났다. 이 효과는 E8.5에서 양수 캐비티에 존재하는 DNA의 높은 농도로 인해 수 있습니다. DNA 용액을 녹색 식품 염료와 혼합 이었으므로 양막 캐비티 내에 DNA 농도를 평가하는 그린 컬러를 사용할 수있다. 현미경에서는 E8.5 배아와 비교하여, DNA 주입 후 녹색 색상 E7.5 배아 캐비티 훨씬 가볍고, 분명하다. DNA 용액의 농도가 동일한 E7.5 및 E8.5 배아 주입되었지만, 더 많은 DNA 용액은 대형화 때문에 완전히 채우기 위해서 E8.5 배아의 공동 양수이었다. 주사 바늘을 철수 한 후 항상 양수 캐비티로부터 DNA 용액의 누출이 어느 정도 존재하고, 천공 구멍 이전 배아 양막 공동의 크기에 비해 크기 때문에, 그것에 비례 더 리크가 있다고 보인다 낮은 DNA 농도에 이르는 E8.5 배아보다 E7.5에서. 형질의 다른 개수세포는 다른 단계에서 세포의 다른 직경 또는 유도 막 횡단 전압 (ITV) 임계 값으로 인해 수 있습니다. 일렉트로 포 레이션의 단점은 관련 세포사이다. 전통적인 금 유사한 도금 또는 침상 전극은 모세관 전극을 사용하여 전기 천공은 또한 세포 사멸을 야기한다. 전기 천공 후, 타겟 영역은 세포 사멸 과정의 일부가이 영역에 발생해야한다는 것을 나타내는, 인접한 영역들 (도 3A 및 3B)에 비해 진한 색으로 보였다. 상기 전기 천공 절차에 의한 죽은 세포의 수를 결정하는, 배아는 형광 세포막 액성 핵 염색으로 염색 하였다. 죽은 세포의 핵은 막 불 투과성 원적외선 형광 염료로 표지 하였다. 염색이 모세관 전기 천공 법은 단지 일렉트로 사이트 근처 사균 (도 3D 및 타행 소수의 결과를 확인BLE 1). 우리는 죽은 세포가 전기 사이트에 표시하지만, GFP + 세포와 죽은 세포는 서로 (그림 3E 및 3 층)에서 가장 배타적 인 것으로 나타났습니다. E8.5에 꼬리가 횡 epiblast pCAG-GFP 및 20 ㎛의 유리 모세관 개구, GFP + 세포의 다수 일렉트로 때 또한, 배양 48 시간 (도 3G 및 3H) 후 검출되었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 대부분의 GFP + 세포가 더 문화 동안 여전히 실행 가능한 있습니다 전기 후 2 시간을 감지 좋습니다. 우리는 24 시간 체외 배양 후 GFP + 세포의 수를 얻었습니다. 여섯 배아는 20 ㎛ 직경의 모세관 개구를 이용하여, E7.5에 pCAG-GFP로 전기 천공 하였다. GFP + 세포 / 배아 검출되었다 107 ± 31 (SD는 평균 ±). 배양 (2 시간)의 시작 이후, 9 세포 당 평균 배아에 전기 천공 하였다 ( <s<html> trong&gt; 표 1), 이는 전기 천공 세포가 2 시간 이내에 3-4 분열을받은 것을 의미한다. E8.5 배아에 E7.5에서 시간을 두 배로 평균 셀이 떨어져 복부 노드 (19, 20)에 그 모든 세포에서 약 6 ~ 7 시간입니다. 이것은 전기 천공 절차는 정상 세포 성장을 방해하지 않는다는 것을 시사한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> 일렉트로 설정을 나타내는도 1 회로도. 그 공동 양수에서 태아 DNA 함유 용액을 두 전극 사이에 위치시켰다. 선택된 파라미터에 전류가 구형파 펄스 발생기 (전력 공급 장치)에 의해 제공되었다. 멀티 미터는 배아를 통과하는 전류를 검출하는 직렬로 연결되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 항상 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;jove_content <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> 그림 2. 호스트 배아에 이식 또는 일렉트로 세포의 분포. wholemount 배아 (그레이 스케일) (A)의 명 시야 이미지에 (AH) GFP의 형광 오버레이 (녹색) 10-16 GFP + EpiSCs는 후반의 말단 부위에 이식되었다 -streak 단계 배아. (C) GFP + EpiSCs의 큰 덩어리는 중간 킬 단계 배아의 원위 영역에 그래프트 하였다. (B 및 D)에 도시 된 호스트 배아 EpiSCs 유래 세포 (녹색)의 분포 ( 및 배양 24 시간 후에 C). 공여 세포의 정확한 적분을 제안 호스트 배아 분산 (B) GFP + 세포. (D) 그라프 트화 큰 세포 덩어리는 호스트 배아 비법 덩어리 형성을 초래. (EK) pCAG-Cre 호텔 : GFP 플라스미드 ELE<html> 야생형 배아의 특정 영역에 ctroporated. 초기 꽃 봉오리 단계 배아 (E) 또는 2-5 체절 단계 배아 (G)의 원시적 인 행진의 말단 영역을 Electroporating은 2 시간 시술 후이 지역에서 GFP + 세포의 결과. (F와 H) 문화의 24 시간 후 호스트 배아에서 GFP + 세포의 분포, 일렉트로 세포가 neuroectoderm (검은 색 화살표)에 기여하는 것을 보여주는 (F) 및 근축 중배엽 (흰색 화살표) (H). (IK) 일렉트릭 세포가 neuroectoderm (I)을 야기 할 수 있음을 보여주는 GFP + 세포에 대한 DAB의 면역 염색, 중배엽 (J)와 문화 24 시간 후 내배엽 (J 및 K). 스케일 바 (AH) = 250 μm의; 스케일 바 (IK)는 100 ㎛를 =. 참고 : 그림 1A와 1B가 이전 출판물 (4)에서 다시 인쇄됩니다.= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> GFP + 세포와 전기 후 배아에서 죽은 세포의 그림 3. 유통 (AC) pCAG-Cre 호텔 :. GFP 플라스미드 E8.5의 꼬리 측면 epiblast 세포에 전기 천공 (2-5 체절 단계) 배아 (모세관 구멍 크기 :. 20 μm의) (A) 2 시간 후 절차, 대상 영역은 태아의 다른 부분에 비해 진한 색 (백색 화살표)을 보여준다. 삽입 된 일렉트릭 영역의 확대를 보여줍니다. (B) 브라이트 이미지 (그레이 스케일) 일렉트릭 세포 (녹색)을 나타내는 녹색 형광 채널을 입혔다. (C) 공 초점 Z 슬라이스가 보여주는꼬리 횡 epiblast 세포를 표적으로 하였을 때 두 내배엽 세포 (녹색)과 같은 플라스미드를했다. . 세포핵은 (DF) pCAG-Cre 호텔 빨간색으로 표시된다 : GFP 플라스미드 E8.5 배아 노드의 꼬리 양태에서 전기 천공 하였다 (모세관 눈 크기 : 30 μm의). 배아가 2 시간 동안 배양 하였다. 일렉트로 세포는 빨간색, 녹색, 죽은 세포에 표시됩니다. (D)는 일렉트로 지역은 GFP + 세포뿐만 아니라 죽은 세포 모두 포함되어 있습니다. 흰색 상자에이 지역은 또한 공 초점 현미경으로 분석 하였다. Z-스택의 수동 계수는 33 GFP + 세포와이 지역에서 23 죽은 세포가 것으로 나타났다. 만 개의 세포는 모두 형광 양성 모두 있었다. (E와 F) GFP + 세포가 죽은 세포에서 분리되어 보여 D의 흰색 박스 지역에서 공 초점 Z 슬라이스의 XYZ보기. 핵은 파란색으로 표시됩니다 (G와 H) pCAG-Cre 호텔 :. GFP 플라스미드는 몇 CEL에 전기 천공 된E8.5 배아의 꼬리 측면 epiblast에서 LS (모세관 구멍 크기 : 20 μm의) 두 (G) 및 48 (H) 시간 체외 배양 주 후 이미징 (H) 배아 배양 후 2 년 단절되었다. 머리와 가슴 지역은 제거되었다. 스케일 바 (A, B, D, G 및 H) = 250 μm의; 스케일 바 (C, E와 F) = 100 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 모세관의 개구의 직경 </td><td> 배아 단계 </td><td> 전기 효율 : 없음. 2H / 총 아니오 후 GFP + 세포를 포함하는 배아. 의 전기 천공 배아 (NO. 24 또는 48 시간 배양 한 후 일반적으로 개발 + 배아 GFP) </td><td> SD ± 배아 당 GFP의 평균 수는 + 세포 (N = 아니오. 조사 배아) </td><td> 의 제SD ± 각 배아 당 GFP + 내배엽 세포 (N = 아니오. 조사 배아) </td></tr><tr><td> 20 ㎛ </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 9분의 7 (7) </td><td> 9 ± 3 (N = 4) </td><td> 4 ± 2 (N = 4) </td></tr><tr><td> 30 ㎛ </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> / 15 (12) 13 </td><td> 17 ± 2 (N = 4) </td><td> 6 ± 1 (N = 4) </td></tr><tr><td> 20 ㎛ </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> / 13 (10) (12) </td><td> 21 ± 4 (N = 4) </td><td> 11 ± 4 (N = 4) </td></tr><tr><td> 30 ㎛ </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> 이분의이 (2) </td><td> 33, 26 (N = 2) </td><td> 14, 16 (N = 2) </td></tr></tbody></table> pCAG-Cre 호텔의 표 1 Electroporation에 효율 : 마우스 배아에서 GFP 플라스미드. 약기 : LS, 늦게 원시적 인 행진 단계; LB : 늦게 꽃 봉오리 단계. 배아에 따라 준비됩니다다운스와 데이비스 (12)

우리는 배양된 세포를 초기 마우스 배아의 정의된 부위에 이식하여 생체 내 잠재력을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한 알려진 직경의 유리 모세혈관을 사용하는 최적화된 전기천공법(electroporation method)을 도입하여 배아의 몇 개의 세포에 외인성 DNA를 정확하게 전달할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

이 절차들의 전반적인 목표는 초기 착상 후 생쥐 배아로 세포 또는 DNA를 정밀하게 전이하는 방법을 보여주는 것입니다. 이러한 방법들은 시험관 내에서 배양된 세포의 체내 잠재력을 테스트하거나 특정 배아 단계에서 특정 유전자의 기능을 확인하는 것과 같이, 발생 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않으며, 초기 착상 후 생쥐 배아의 실험적 조작을 가능하게 한다는 점입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 E 7.5 또는 E 8.5일의 임신한 암컷을 희생시킨 후, 가위와 핀셋을 사용하여 자궁을 분리하고 두 쌍의 미세 핀셋을 이용하여 M2 배지가 채워진 30mm 디시에 넣습니다.자궁근층을 조심스럽게 찢어낸 후, 배아 외 공동을 찌르지 않도록 주의하며 탈락막을 벗겨냅니다. 포셉으로 엽막(riker's membrane)을 집어 배아로부터 천천히 분리하여 제거합니다. 그 다음 실체 현미경 하에서 난황낭, 양막 및 태반 원추(placental cone)가 온전한지 확인합니다. 피펫을 사용하여 배아를 M2 배지가 담긴 깨끗한 접시로 옮기고, 배아를 부분적으로 냉각시키기 위해 얼음 위나 아이스 플랫폼 위에 놓인 30mm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑 위에 둡니다.배양된 세포를 마우스 배아에 이식하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 배양액을 준비하고 배아를 배양하십시오. 먼저 200 µL 피펫 팁을 사용하여 6-웰 배양 플레이트에서 GFP를 유비쿼터스하게 발현하는 eblast 줄기세포를 물리적으로 긁어내십시오. 이 세포들을 배아가 들어 있는 디시로 옮기십시오.흡입관에 수작업으로 당겨 만든 이식용 모세관을 부착하여 마우스 피펫을 제작한 후, 입으로 가볍게 빨아들여 20개 이상의 세포로 구성된 세포 덩어리를 하나 이상 이식용 모세관 안으로 흡입합니다. 그다음 세포를 가볍게 불어내어 큰 덩어리들을 분산시킵니다. 약 10~20개의 세포를 포함하는 덩어리 하나를 선택하여 이식용 모세관 안으로 흡입합니다.다시 한번 핀셋을 사용하여 덩어리를 모세관 입구 가까이에 유지합니다. 배아를 느슨하게 고정한 상태에서 이식용 모세관을 관심 영역에 삽입하여 개구부를 만듭니다.이식 캡필러리 밖으로 세포 덩어리를 부드럽게 밀어내어, 10~20개의 세포로 이루어진 짧은 가닥이 배아 내에 남도록 합니다. 배아를 동일한 M two 배지가 담긴 접시에 그대로 두고, 형광 화합물 해부 현미경과 카메라를 사용하여 이식된 배아의 이미지를 촬영합니다. 배아가 과도한 빛과 열에 노출되는 것을 방지하기 위해 촬영 시간을 최소한으로 유지하십시오.페이스트를 이용한 이미징 직후, 최소량의 M2 배지를 사용하여 배아를 미리 평형화된 배양 배지로 옮기고, 전기천공 실험을 수행하기 전 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 배양하십시오. 조직 손상을 방지하기 위해 수평형 마이크로피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 팁이 가늘고 입구 크기가 10 µm 미만인 DNA 주입용 피펫을 제작하십시오. 유리 모세관 전기천공의 경우, 마이크로 포지(micro forge)를 사용하여 DNA 주입용 피펫의 입구를 깨진 모서리 없이 깨끗한 팁 상태로 내경 20 µm 또는 30 µm가 되도록 절단하십시오. 각 백금 전극을 얇은 절연 전선에 연결하고, 절연 테이프로 감싼 마이크로인젝션 니들 홀더에 삽입하십시오.수제 모세관 전극을 준비하려면, 직경 20 또는 30 µm의 고정된 개구부를 가진 전기천공용 유리 모세관에 직경 0.2 mm의 백금선을 삽입하십시오. 이는 전류를 집중시켜 배아의 작은 관심 영역에 플라스마 DNA를 전달하기 위함입니다. L자형 전극을 만들려면 직경 0.2 mm의 백금선을 구부려 L자 모양을 만들되, L자의 수평 부분 길이를 약 1 mm가 되게 하십시오.니들 홀더를 표준 마이크로 조작 기구 홀더에 장착합니다. 모세관 전극을 전원 공급 장치의 양극에 연결합니다. L자형 전극을 멀티미터의 양극에 연결합니다.그 다음 멀티미터의 음극을 전원 공급 장치의 음극에 연결합니다. 전기천공용 유리 모세관의 상단에서 1~2mm 지점까지 PBS를 채우고, 직선형 백금 전극을 유리 모세관 바닥에 닿을 때까지 삽입합니다. L자형 전극을 PBS가 채워진 30mm 페트리 접시 표면에 고정합니다.DNA 주입을 위해 공압식 피코 펌프(pneumatic pico pump)를 사용합니다. 배아의 외배엽(eblast) 측면을 통해 주입 바늘을 양막강으로 삽입하고, 약 5 µL의 DNA 용액을 양막강 내에 주입하거나 강이 완전히 찰 때까지 주입합니다. 이때 배아가 터지지 않도록 주의하십시오.그런 다음 배아를 전극 사이에 조심스럽게 배치하고, DNA가 전달될 정확한 위치로 모세관 전극을 이동시킵니다. 200 V의 전압으로 각각 50 ms 동안 6회 펄스를 가하며, 각 펄스 사이에는 1초의 간격을 두어 배아에 전기천공술을 시행합니다. 다음 배아의 전기천공술을 반복하기 전에 배아를 즉시 미리 평형화된 배양액으로 옮깁니다.전기천공 2시간 후에 전기천공된 생존 세포 또는 사멸 세포를 검출합니다. 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따르면, EGFP를 편재적으로 발현하는 epi PSCs가 포함된 배아를 E 7.5 단계에 이식하여 24시간 동안 ex vivo로 배양했습니다. 10~16개의 fscs를 E 7.5 배아에 이식했을 때, 이들은 숙주 배아 내에서 잘 통합되고 증식했습니다.하지만 더 많은 세포를 이식한다고 해서 키메리즘이 더 개선되는 것은 아니며, 실제로 여기서 보여주는 것처럼 통합되지 않은 세포 덩어리가 형성되는 결과로 이어집니다. GFP 발현 플라스미드의 전기천공법 과정에서 나타난 것과 같이, 전기천공법 수행 1~2시간 후에 GFP 양성 세포가 검출되었습니다.원시선 후기 단계 배아의 원위부 배아세포(eblast cells)를 전기천공했을 때, 표지된 세포들은 배양 24시간 후 신경 외배엽(neural derm)을 형성하였으며, 이는 위장 단계 배아 배아세포의 알려진 운명 지도와 일치합니다. 이 그림은 전기천공을 위해 다른 종류의 전극을 사용했을 때와 마찬가지로, 모세관 전극 또한 표적 부위에서 어느 정도의 세포 사멸을 유발했음을 보여줍니다. 막 투과성이 없는 원적외선 형광 염료로 사멸한 세포의 핵을 표지했을 때, 이 부위가 주변 영역에 비해 더 어두운 색으로 나타났습니다.모세관 전기천공법(capillary electroporation) 기술을 통해 전기천공 부위 주변에 소수의 사멸 세포만 발생함을 확인하였습니다. 이 절차를 수행할 때는 2시간 이내에 배아 배양을 시작하는 것이 중요합니다. 배양 종료 후 생쥐로부터 자궁을 적출한 뒤 배아를 고정할 수 있습니다.공여 세포나 전기적으로 융합된 세포가 숙주 배아에 기여하는 정도와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 절편 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청함으로써, 우리는 초기 착상 후 생쥐 배아로 세포와 DNA를 정밀하게 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 영화와 프로토콜은 핵 이전을 학습 수 있도록 도와 드리기위한 것입니다.

마우스 Oocytes에 핵 전송

좋은 팁을 사용하면 우리가 닭 somites이나 신경 튜브의 하위 도메인에 플라스미드 DNA를 주입 micropipettes. 플라스미드의 농도는 단일 transfected 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 우리는 다음 세포가 clonal 인구로 발전 수 있습니다.

칙 태아의 단일 세포 Transfection

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

기본 및 응용 연구에 널리 사용되는 전형적인 미세 소관 억제제는 세포에 광범위한 영향을 미칩니다. 최근에, 포토스타틴은 미세소관의 순간적, 가역적, 공간적으로 정밀하게 조작할 수 있는 광전환 가능한 미세소관 억제제의 부류로 부상하였다. 이 단계별 프로토콜은 3D 라이브 이식 전 마우스 배아에서 포토스타틴의 적용을 자세히 설명합니다.

포토스타틴을 이용한 살아있는 이식 전 마우스 배아에서 미세소관 세포골격의 시공간적 세포골격 조작

배우세요 초기 마우스 배아에 세포와 DNA를 정확하게 전송하는 방법을. 배아 발달 중 유전자 기능과 체외 배양 세포의 생체 내 잠재력을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

더 많은 동영상 탐색