초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

이러한 절차의 전반적인 목표는 착상 후 초기 마우스 배아로 세포 또는 DNA를 정확하게 전달하는 방법을 입증하는 것입니다. 이러한 방법은 체외 배양 세포의 생체 내 잠재력 및 특정 배아 단계에서 특정 유전자의 기능 테스트와 같은 발생 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않고 조기 포즈 플랜테이션 마우스 브리오의 실험적 조작을 가능하게 한다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 E 7.5 또는 E 8.5일에 임신한 여성을 희생한 후 가위와 집게를 사용하여 자궁을 분리하고 두 쌍의 가는 집게가 있는 M 두 개의 매체로 채워진 30mm 접시에 넣습니다.

근막을 조심스럽게 찢은 다음 여분의 배아 구멍에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 데시두아를 벗겨냅니다. 집게를 사용하여 라이커의 막을 잡고 배아에서 천천히 분리하여 제거합니다. 그런 다음 실체 해부 현미경으로 배아를 확인하여 난황낭 양막과 태반이 손상되지 않았는지 확인합니다.피펫을 사용하여 배아를 M 2의 깨끗한 접시에 옮기고 30mm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 얼음 또는 얼음 플랫폼에 올려 배아를 부분적으로 식힙니다.

텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지 및 배양 배아를 준비하여 배양된 세포를 마우스 배아에 이식합니다. 먼저 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 6웰 배양 플레이트에서 GFP를 유비쿼터스하게 발현하는 에블라스트 줄기세포를 물리적으로 긁어냅니다. 배아가 들어 있는 접시에 세포를 옮깁니다.

흡인기 튜브에 손으로 당기는 이식 모세관을 부착하여 구강 피펫이 구강 피펫을 부드럽게 빨아 20개 이상의 세포로 구성된 하나 이상의 세포 덩어리를 이식 모세관으로 끌어들입니다. 그런 다음 세포를 부드럽게 불어내어 큰 덩어리를 분산시킵니다. 약 10-20개의 세포를 포함하는 하나의 덩어리를 선택하여 이식 모세관으로 끌어들입니다.

다시 말하지만, 한 쌍의 집게로 덩어리를 모세관 입구에 가깝게 유지합니다. 배아를 제자리에 느슨하게 잡고 이식 모세혈관을 관심 영역에 삽입합니다. 개구부를 만듭니다.

이식 모세혈관에서 덩어리를 부드럽게 배출하여 10-20개의 세포로 구성된 짧은 끈을 배아에 남겨둡니다. 배아를 M 2 배지의 동일한 접시에 그대로 두고 형광 화합물 해부 현미경과 카메라를 사용하여 이식된 배아를 이미지화합니다. 배아가 과도한 빛과 열에 노출되지 않도록 이미징 시간을 최소한으로 유지하십시오.

페이스트를 사용하여 이미징한 직후, 전기천공법 실험을 수행하기 전에 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 M 2 배지 내지 사전 평형 배양 배지 및 배양의 최소 부피로 배아를 옮기고, 수평 마이크로 피펫 극성을 사용하여 미세한 팁과 10마이크로미터 미만의 개구부로 DNA 주입 피펫을 당겨 조직 손상을 방지합니다. 유리 모세관 전기천공법의 경우, 마이크로 포지를 사용하여 팁이 깨끗하고 모서리가 부러지지 않은 상태에서 DNA 주입 피펫의 입구를 20 또는 30 마이크로미터의 내부 직경으로 절단합니다. 각 백금 전극을 얇은 절연 전선에 부착하고 절연 테이프로 덮인 미세 주입 바늘 홀더에 삽입합니다.

수제 모세관 전극을 준비하려면 직경 20 또는 30마이크로미터의 고정 개구부가 있는 전기천공 유리 모세관에 직경 0.2mm 백금 와이어를 삽입합니다. 전류를 집중시키고 혈장 DNA를 배아의 작은 관심 영역에 전달합니다. L자형 전극을 만들기 위해 0.2mm 직경의 백금 와이어를 구부려 L의 수평 부분이 약 1mm 길이인 L자형을 만듭니다.

바늘 홀더를 표준 마이크로 조작 기구 홀더에 장착합니다. 모세관 전극을 전원 공급 장치의 양극에 연결합니다. L자형 전극을 멀티미터의 양극에 연결합니다.

그런 다음 멀티미터의 음극을 전원 공급 장치의 음극에 연결합니다. 전기천공(electroporation) 유리 모세관을 PBS로 상단에서 1-2mm 이내로 채우고 직선 백금 전극을 모세관 바닥에 도달할 때까지 유리 모세관에 삽입합니다. PBS로 채워진 30mm 페트리 접시 표면에 L자형 전극을 고정합니다.

DNA 주입을 위해 공압 피코 펌프를 사용하십시오. 외측 이블라세포의 주사 바늘을 배아의 양막에 삽입하고 약 5마이크로리터의 DNA 용액을 구멍에 주입하거나 완전히 찰 때까지 주입합니다. 배아가 터지지 않도록 주의한다.

그런 다음 배아를 전극 사이에 조심스럽게 배치하고 모세관 전극을 DNA가 전달될 정확한 위치로 이동합니다. 각각 50밀리초 동안 6개의 펄스로 200볼트를 사용하여 각 펄스 사이에 1초 간격으로 배아를 전기천공했습니다. 다음 배아를 위해 전기천공을 반복하기 전에 배아를 사전 평형 배양 배지로 즉시 옮깁니다.

전기천공(electroporation) 후 2시간 후에 전기천공된 살아있는 세포 또는 죽은 세포를 검출합니다. 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따르면, EGFP를 유비쿼터스로 발현하는 epi PSC를 가진 배아를 E 7.5에 접목하고 24시간 동안 체외에서 배양한 배아입니다. 10 내지 16 fsc가 E 7.5 배아에 접목되었을 때, 이들은 숙주 배아 내에 잘 통합되고 증식했다.

그러나 더 많은 세포를 이식한다고 해서 더 나은 키메라가 생기는 것은 아니며 실제로 여기에서 입증된 바와 같이 통합되지 않은 덩어리가 발생합니다. 플라스미드를 발현하는 GFP의 이 electroporation에서 보이는 바와 같이. GFP 양성 세포는 electroporation 1 2 시간 후에 검출되었습니다.

후기 원시 줄무늬 단계 배아의 원위 에블라스 세포가 전기천공되었을 때, 라벨링된 세포는 배양에서 24시간 후에 신경 진피에 기여했으며, 이는 위기 배아에서 에블라세포 세포의 알려진 운명 지도에 해당합니다. 이 그림은 electroporation를 위해 다른 유형의 전극을 사용하는 것과 유사하게 모세관 전극이 대상 영역에서 어느 정도의 세포 사멸을 일으켰음을 보여줍니다. 이 영역은 인접한 영역에 비해 색이 더 어둡게 보였기 때문에 죽은 세포의 핵을 투과할 수 없는 원적색 형광 다이로 표시했습니다.

모세관 전기천공법(capillary electroporation) 기법으로 인해 전기천공법 부위 근처에 소수의 죽은 세포만 생성된다는 것을 확인했습니다. 이러한 절차를 시도하는 동안 2시간 이내에 배아 배양을 시작하는 것이 중요합니다. 배양이 끝날 때 자궁을 마우스에서 분리한 후 배아를 고정할 수 있습니다.

숙주 배아에 대한 기증자 또는 전기 편조 세포의 기여와 같은 추가 질문에 답하기 위해 절단 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 DNA를 착상 후 초기 마우스 배아로 세포를 정확하게 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.