Name: 광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 광 변환 형광 붕괴를 이용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 단백질 안정성을 측정하는 방법을. 세포 내외 단백질 반감기를 정량화하여 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 원고에 대한 의견에 대한 제프리 파렐, 제임스 가뇽, 제니퍼 버그만에게 감사의 말씀을 전합니다. KWR는 FDAP 분석의 개발 기간 동안 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 활동 프로그램에 의해 지원되었다. 이 작품은 AFS에 NIH로부터 보조금과 독일 연구 재단 (에미 뇌터 프로그램), 막스 플랑크 사회, 오후에 인간 프론티어 과학 프로그램 (경력 개발 상)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. Photoconvertible 퓨전 구축 및 삽입하기 Dechorionated Zebrafish의 배아를 생성 <ol><li> 다음 뮐러 등., 2012 (19)에서와 같이 융합 단백질을 코딩하는 캡핑 된 mRNA를 생성하는 시험 관내 전사를 사용하여, 녹색 대 적색 photoconvertible 단백질 (설명 참조)에 융합 된 관심있는 단백질을 함유하는 기능성 구조체를 생성한다. </li><li> 하나의 세포 단계에서 약 30 제브라 피쉬 배아에서 chorions을 제거하는 프로 나제​​를 사용합니다. 또한, 수동 집게 (28)를 사용하여 배아를 dechorionate. 주 : 태아의 후속 이미징 dechorionated해야합니다. 원하는 경우, 배아는 촬상 직전에, 나중에 융모막 통해 주입하고 dechorionated 수있다. <ol><li> 표준 제브라 피쉬 배아 매체 (19)의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 프로 나제의 5 ㎎ / ㎖ 원액을 확인합니다. 10 분은 단백질 분해 효소가 분해 할 수 있도록하기 위해 부드럽게 실온에서 솔루션을 바위. 나누어지는 2m-20 ° C에서의 microcentrifuge 튜브에 L과 동결. </li><li> 배아 ~ 8 ml의 배지를 함유 5cm 직경 유리 또는 코팅 된 플라스틱 아가 페트리 접시로 이동 한 세포 단계 배아. 접시에 해동 프로 나제​​ 원액 2 ㎖를 추가하고 5 ~ 10 분 동안 실온에서 품어. </li><li> dechorionated 배아가 파열 될 것 중 하나와 접촉으로, 공기 또는 플라스틱으로 배아를 노출시키지 마십시오. 배아 매체와 200ml의 유리 비커를 입력합니다. 매체에 침수 동안 배양 접시를 기울여 비커에 배아를 전송합니다. </li><li> 배아는 비커의 바닥에 정착 한 후, 다음 비커에 신선한 배아 매체를 부어, 배아 매체의 대부분을 부어. 비커에 쏟아져 매체의 가벼운 소용돌이는 배아가 약화 chorions을 잃게됩니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.4. </li></ol></li><li> 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 코팅 분사 요리 (29)에 dechorionated 배아를 전송합니다. 불타는피펫 팁은 부상 배아에서 가장자리의 계단 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> (그림 1B, 제안 mRNA와 Alexa488 - 덱스 트란 양의 토론 참조) mRNA와 3 kDa의 Alexa488 - 덱스 트란 결합체 (29, 30)을 공동-주입. 분열이 시작되면도의 mRNA의 분포와 형광 염료를 보장하기 위해 셀 (안 노른자)의 중심에 직접 주입한다. 주 : Alexa488 신호는 세포 내 및 세포 외 형광을 구별하기 위해 구획되지 마스크를 생성하기 위해 데이터 분석에서 사용된다. </li><li> 배아 매체 가득 여섯 아니라 플라스틱 접시의 1 ~ 2 % 아가로 오스 코팅 잘로 전송 주입 배아. 배아 늦게 구 단계 31 (약 5 시간 포스트 수정을)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 어둠 속에서 품어. 실체 현미경을 이용하여 배아마다 한 2 시간을 확인하고 사망 한 배아에 의해 생성 된 이물질을 제거합니다. </li></ol> 2. P에 대한 Zebrafish의 배아를 장착거꾸로 공 초점 현미경에 hotoconversion 및 이미지 <ol><li> 1-5 배아 건강을 식별하고, 접시에서 제거 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 실체 현미경을 사용한다. </li><li> 부드럽게 1X Danieau 배아의 매체에 용해 1 % 저 융점 아가로 오스 ~ 1㎖를 함유 마이크로 원심 분리 튜브로 배아를 토출 (도 2a) (자재 목록 참조). 참고 : 아가로 오스 40, 42 ° C 사이의 온도를 가져야한다; 높은 온도는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 일부 아가와 함께 다시 피펫으로 배아를 그립니다. 조심스럽게 유리 바닥 접시 (그림 2B)의 커버 유리 위에 아가로 오스와 배아를 꺼냅니다. 커버 유리의 두께가 공 초점 현미경의 목표와 호환되는지 확인하십시오. <ol><li> 원하는 경우 유리 피펫을 다시 사용합니다. 피펫에서 잔류 아가로 오스를 청소하고 위아래로 빠르게 막힘, 피펫 배아 매체를 방지합니다.다음이 목적을위한 실체 현미경으로 배아 매체의 ~ 5 ml로 가득 15 ML 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 동물 극 (배반)는 커버 유리를 향하도록 위치를 배아 금속 프로브를 사용한다. 아가로 오스 20 ~ 30 초에서 응고하기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다. 배아 &#39;의 위치를​​ 모니터링하고 아가로 오스 견고 때까지 필요한 재조정 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 배아의 원하는 번호가 장착 될 때까지 반복 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 참고 : 일반적인 실험에서, 네 다섯 배아 각을 포함하는 4 개의 아가로 오스 방울은 커버 유리에 쉽게 맞습니다. 약 16 배아는 하나의 이상적인 실험 (그림 2C) 동안 이미지를 만들 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 응고되면, 1 배 Danieau의 배아 매체와 유리 바닥 접시를 채운다. </li></ol> 3. Photoconverting 및 Photoconverted 신호의 감소를 측정 25X 또는 40X 물 목표 내가크기와 제브라 피쉬 배아의 굴절률에 적합한이야. 물 여섯 시간 실험의 과정 동안 증발하기 때문에 그것은 수중보다는 실제 물과 같은 굴절률 액침 오일을 사용하는 것이 최선이다. 침지 기름이 물 (석유가 아닌) 목적으로 사용할 수 있도록 설계되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 목적과 커버 유리 사이의 오일 필름 이미징 동안 다른 배아 위치로 무대 이동으로 중단되지 않도록하기 위해 목표에 몰입 오일의 큰 하락을 놓습니다. 요리 할 때 단계 이동을 이동하지 않도록 확실하게 무대에 유리 바닥 접시를 놓습니다. 가능하면 28 ° C, 제브라 피쉬의 개발을위한 최적의 온도에서 가열 단계를 사용합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 소프트웨어 패키지의 각 배아의 위치를​​ 정의합니다. 각각의 배아 용 Z-깊이를 조정하고, 각각의 배아 대략 동일 평면을 대상으로 시도한다. 참고 : 약 30 μm의 동물 극에서이 이동입니다배아의 포락 층을​​ 회피 할 수있는이 깊이에서 보낸 외경 깊이 이미징 영역이 극대화되고, 광 산란이 최소이다. ~ 3.3 ㎛의 두께로 슬라이스 한 광은 충분한 데이터를 제공한다; Z-스택 (섹션 5 참조)을 취득 할 필요가 없다. </li><li> 실험 기간 동안 두 개의 신호를 수집 : Alexa488 - 덱스 트란에서 &quot;녹색&quot;신호를 공액-있는이 photoconverted 후 세포 외 및 세포 내 형광 및 융합 단백질에서 &quot;빨간색&quot;신호를 분리하기 위해 데이터 분석시 사용됩니다. <ol><li> 488 nm의 레이저를 사용하여 Alexa488을 자극하고, ~ 500 및 540 nm의 사이에 방출되는 형광을 수집합니다. 참고 : 광 변환 후, 많은 녹색 - 투 - 붉은 photoconvertible 단백질 (예를 들어, Dendra2)는 543 nm의 레이저로 흥분하고 ~ 550 및 650 nm의 사이의 형광을 방출 할 수있다. 사용 photoconvertible 단백질에 따라 필요한 조정합니다. </li></ol></li><li> 취득 &quot;전 광&quot;이미지 및 이미지에 적절한 이미징 조건 (단계 3.2) 이전에 정의 된 각각의 위치를​​ 공 초점 현미경의 소프트웨어를 구성하는 다섯 시간 시간 코스마다 10 또는 20 분 (5 장을보고 토론). </li><li> 융합 단백질을 photoconvert하려면, 2 분 동안 100 %의 출력에서​​ ~ 300-400 nm의 여기 필터와 수은 아크 램프로부터 UV 광에 배아기를 10X 대물 렌즈로 전환 노출. . 균일 한 광을 (5 장 참조) 홍보 z 축에있는 z 포커스를 이동 침지 오일 광 동안 10 배 목표에 떨어지지 않도록하십시오. 주 : 광 중 포커스의 이동은 실험자 간의 변동을 방지하기 위해 자동화 될 수있다. </li><li> 바로 광 변환 한 후 다시 25 배 또는 40 배 목표로 전환합니다. 단계 3.2에서 이전에 정의 된 위치가 여전히 정확한지 확인하십시오. 요리 photoconv 동안 이동하는 경우ersion, 태아의 위치를​​ 다시-정의합니다. <ol><li> 3.4 단계에서 만든 프로그램을 시작하고 영상 5 시간 동안 계속 할 수 있습니다. 광 및 각각의 배아에 대한 영상의 시작 사이에 경과 된 시간을합니다. </li></ol></li><li> 때때로 실험에서 확인합니다. Danieau의 매체의 수준을 모니터링하고 필요하면 더 추가 할 수 있습니다. 이 멈춘 경우 소프트웨어를 다시 시작합니다. </li><li> 지수 감소 모델의 점근선을 추정 데이터 분석에서 사용되는 배경 형광 값을 결정하기 위해, 실험 Alexa488 덱스 트란 아니라 mRNA를 주입 한 배아 일부를 포함한다. 후속 데이터 분석에서 사용되는 기기 노이즈를 측정하기 위해, 샘플의 부재하에 화상을 취득. </li></ol> 4. PyFDAP를 사용하여 데이터를 분석 <ol><li> 시각 각 배아 시간 코스 데이터 세트를 검사한다. IMAG 중 사망 한 배아에서 데이터 세트를 폐기photoconverted 신호의 매우 낮은 수준, 또는 그 특이한 모양과 이동 (부상 또는 병 배아의 일반) 분할 중지 세포의 영역을 포함하는 상당히 이동 ING,,. 참고 : 때때로, 침지 오일에 기포 나 다른 유물 그렇지 않으면 사용할 수있는 데이터 세트에 하나 또는 두 개의 이미지에 표시됩니다. 아티팩트를 포함하는 모든 이미지를 참고; 나중에는 폐기 될 것이며, 이러한 데이터 세트로부터 남은 시점 ​​여전히 분석 될 수있다. </li><li> FDAP 데이터를 분석하는 파이썬 기반의 소프트웨어 패키지 PyFDAP을 사용합니다. PyFDAP 각 화상의 평균 세포 내 및 세포 외 적색 형광 강도를 결정하고, 지수 감소 함수 (56) (도 3)로 데이터를 끼워 맞춤으로써 반감기를 계산한다. <ol><li> PyFDAP 다운로드 (참조 재료 목록). </li><li> 사용 PyFDAP 세포 내와 세포 외 photoconverted 신호 (그림 3A를, B)로 구분합니다. 우리세포 내 마스크를 만들기 위해 엄격 세포이다 Alexa488 신호를, 예. 평균 세포 외 농도를 계산할 때 고려되는 세포 내 픽셀을 방지하기 위해 해당 빨강 채널 이미지에이 마스크를 적용합니다. 평균 세포 내 농도를 측정하기 위해, 마스크를 반전. </li><li> PyFDAP, 단계 4.2.2에서 생성 된 마스크 화상을 표시. 시각적으로 이러한 이미지를 검사하고 마스크 정확하게 세포 외 공간에서 세포 내 (이 드문되어야 구별하지 않은 데이터 세트를 폐기, 즉 세포막은 세포 외 공간 마스킹되어있는 이미지에 포함되어 참고하지만 이들은 임계 값을 변경함으로써 제거 될 수 알고리즘 또는 멤브레인 마스크를 도입하여 (예를 들어, 사용하는 막 - CFP)). 또한 단계 4.1에서 확인 된 유물 (예, 침지 기름에 거품)를 포함하는 단일 이미지를 버린다. </li><li> EAC 평균 세포 외 및 세포 내 형광 강도를 계산하는 PyFDAP를 사용하여시간 이미지. PyFDAP 합산은 픽셀들의 총 개수에 의해 마스크 및 분할 벗어나는 픽셀의 휘도를 합산하여 이들의 평균을 계산한다. </li><li> 다음과 같은 지수 함수와 형광 데이터 (그림 3C)를 장착 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> t 시간 후의 광, C (t) t의 주어진 값에서의 강도는이고, C 0 t = 0에서의 강도이고, k는 제거율 상수이며 Y 0 함수가 형광으로 접근 점근선 감소한다 (도 1D). Y는 0 3.8 19 단계에서 측정에 기초하여 제한 될 수있다. </li><li> 다음의 관계를 이용하여 제거율 상수 (K)에서 세포 외 및 세포 내 단백질 반감기 (τ)을 계산하기 위해 사용 PyFDAP : <img fo:contENT 폭 = &quot;1 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot;폭 = &quot;153&quot;/&gt; </li></ol></li></ol> 5. 제어 실험 광표백, 부주의 광 및 광 균일 성을 평가하기 위해 <ol><li> 평가 광표백 주 : 광표백 관심 단백질의 간극 이외에 형광 단백질의 표백 특성을 반영 형광 강도에 인공적 저하 될 수있다. <ol><li> 가능한 광표백을 평가 이미징 및 영상 사이에 ​​20 분 간격 (그림 4)와 두 번째 세트 사이에 10 분 간격으로 FDAP 실험 한 세트를 수행합니다. 4 절에 설명 된 실험을 이용 PyFDAP 세트 모두로부터의 데이터를 분석한다. </li><li> 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 긴 반감기가 20 분 간격 실험에서 상당한 광표백을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, PHOTobleaching는 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 또한, 즉시 광 후 ~ 30 일련의 이미지를 획득하여 photobleaching에 평가합니다. 형광 강도의 유의 한 감소는 상당한 광표백을 나타냅니다. </li><li> 광표백가 검출되었을 경우, 낮은 파워의 레이저를 사용하여 촬상 시간을 단축하거나, 더욱 광 안정성 photoconvertible 단백질 (32)을 사용하는 것을 고려. </li></ol></li><li> 실수로 광을 평가. 참고 : Dendra2는 488 nm의 조명 (27)를 사용하여 photoconverted 수 있습니다. 488 nm의 레이저로 Alexa488이 흥미 관심 단백질의 겉보기 반감기의 단계 3.3.1, 부주의 광 따라서 인공적 증가하는 경우에 기재된 바와 같이 가능하다. 그러나, 우리와 다른 사람 (33)는 488 nm의 조명은 제브라 피쉬 배아의 광 변환의 비효율적 인 방법이다 것을 발견했다. <ol><li> 부주의 한 광을 검출하는 단계 5.1.1에서 설명 대조 실험을 사용하여. 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 20 분 간격 실험에서 짧은 반감기는 중요한 실수로 광을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, 부주의 한 광은 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 부주의 한 광이 검출되면, Dendra2 photoconverting 실수를 방지하기 위해 낮은 488 nm의 레이저 출력과 짧은 촬상 시간을 사용한다. </li></ol></li><li> 광 균일 성을 평가. 주 : 광이 동물의 배아 극 치우쳐있는 경우, 형광의 감소가 깊은 평면 (도 5a)로 단백질 또는 세포의 확산 이동에 의해 영향을 받는다. <ol><li> 광이 균​​일 여부를 확인하려면, (세포 융합 단백질과 실험) 분비 photoconvertible 단백질 또는 (세포 융합 단백질과 실험) 세포질 photoconvertible 단백질을 발현. 평소와 같이 Photoconvert, t암탉은 80 분마다 20 분 배반 엽의 대부분을 포괄 Z-스택을 획득. </li><li> 광은 동물 극 치우쳐 있으면 깊이 평면에서 형광 강도 때문에 확산 또는 세포 이동 (도 5b)에 시간에 따라 증가 할 것이다. 불균일 한 광이 검출되면, 광 동안 배아을 깊은 초점. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 충돌이 전혀 없습니다.

FDAP 실험의 성공은 기능 photoconvertible 융합 단백질의 생성에 의존한다. 단백질에 태그를 자사의 생물학적 활성 및 / 또는 현지화, 용해도, 안정성 36-41을 포함한 생물 물리학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 활성 하나를 찾기 위해 여러 가지 융합 구조의 활동을 테스트 할 준비를하십시오. 발명자들은 관심 단백질 photoconvertible 단백질의 위치를 변경하거나 긴 링커를 사용하여 (예를 들어, 아미노산 서열 LGDPPVAT 사용 19) 융합 단백질의 활성을 향상시킬 수있다. 신호 전달 단백질의 경우에, 융합 단백질의 활성은 타겟 (19)의 유전자 발현을 유도하는 능력을 시험함으로써 결정할 수있다. QRT-PCR 또는 현장 하이브리드에 대상 유전자 발현 (19)의 좋은 판독을 제공합니다. 여기에 설명 된 설계는 프로토콜 단백질의 안정성을 결정하는 데 유의제브라 피쉬 초기 배아 및 다른 ...

세포와 생물의 단백질의 수준은 생산 및 통관 자신의 속도에 의해 결정됩니다. 단백질의 반감기는 분에서 일 1-4까지를 범위로 할 수 있습니다. 많은 생물학적 시스템에서 키 단백질의 안정화 또는 통관 세포 활성에 중요한 영향을 미친다. 세포 내 단백질 안정성의 조절은 세포주기 진행 5,6- 발달 시그널링 7-9, 아폽토시스 (10), 정상 기능의 유지 뉴런 11,12 요구된다. 세포 외 단백질의 안정성은 조직 내 분포 및 morphogens 13, 14 등의 분비 단백질의 가용성에 영향을 미친다. 지난 몇 년 동안, 단백질의 안정성은 주로 방사성 펄스 라벨 또는 사이클로 헥 체이스 실험 (15)를 사용하여 세포 배양에서 평가되고있다. 이러한 펄스 추적 실험에서, 세포 중 방사능 일시적 아미노 &quot;펄스&quot;에 노출 될산 전구체 새롭게 합성 된 단백질에 통합하거나 단백질 합성을 저해 사이클로 헥시에 노출되어있다. 배양 된 세포를 상이한 시점에서 수집하고, 어느 (방사성 펄스 추적 실험에서) 오토 라디오이어서 면역 또는 (사이클로 헥 실험에서) 웨스턴 블로 팅은 시간이 지남에 따라 단백질의 클리어런스를 정량화하는데 사용된다. 기존의 단백질 안정성 분석은 몇 가지 단점을 가지고있다. 우선, 단백질의 분석 방법은 종종 그의 내인성 환경에서 발현되지 않고, 다른 종으로부터의 세포 조직 배양에서 때로는. 그 안정성 문맥 의존적 인 단백질이 방법은 문제가있다. 둘째, 시간이 지남에 따라 각각의 세포 또는 생물체 단백질 클리어런스를 수행하는 것이 불가능하고, 상기 분석으로부터의 데이터는 상이한 시점에서 상이한 세포의 집단의 평균을 반영한다. 각각의 세포는 시작 할 수 있기 때문에단백질의 다른 양, 서로 다른 시간에 방사성 라벨 또는 사이클로 헥를 촬영했거나 다른 통관 반응 속도 등의 데이터를 집계 오해의 소지가있을 수있을 수 있습니다. 마지막으로, 사이클로 헥 체이스 실험의 경우, 단백질 합성 억제제의 첨가는 인위적으로 단백질의 안정성을 바꿀 수 16-18 의도하지 않은 생리 학적 효과를 가질 수있다. 이러한 단점은, 광 (FDAP) 후 photoconvertible 단백질이 생물에게 19-25 생활에 동적으로 단백질의 간격을 측정하기 위해 활용하는 기술을 형광 붕괴를 사용하여 방지 할 수 있습니다 (FDAP 기술의 한계에 대한 토론 참조). Photoconvertible 단백질은 그 여기 및 방출 특성 빛 (26)의 특정 파장에 노출 된 후 변경 형광 단백질이다. 하나는 일반적으로 사용되는 변형 Dendra2, 처음에 전을 가진 &quot;녹색 - 투 - 빨간색&quot;photoconvertible 단백질이다표창장 및 배출 녹색 형광 단백질 유사한 특성,하지만 UV 라이트 - &quot;광&quot;에 노출 된 후 여기를 왔나은 / 방출 특성은 적색 형광 단백질 (23,27)와 유사하게된다. 중요한 것은, 광 변환 후 생성 된 새로운 단백질은 photoconverted 단백질 만 풀의 광에 따라 생산 및 통관의 디커플링과 관찰을 허용, photoconverted 단백질과 동일한 여기 / 방출 특성이 없습니다. photoconvertible 단백질과 관심의 단백질에 태그를 지정하는 것은 따라서 펄스 ​​레이블하는 그대로, 광학적으로 접근 생물체의 단백질을 수있는 편리한 방법을 제공합니다. FDAP 분석법 (도 1a)에있어서, 목적 단백질은 단백질 photoconvertible 태그로되어 생체 (도 1b)로 표현. 융합 단백질 photoconverted되며, 시간이 지남에 photoconverted 신호의 감소는 fluorescen에 의해 모니터링CE 현미경 (그림 1C). 데이터는 융합 단백질 (도 1D)의 반감기를 측정하기 위하여 적절한 모델이 장착된다. 여기에 설명 FDAP 분석은 19 초 동안 배아 제브라 피쉬 배아 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 반감기를 결정하도록 고안되었다. 그러나, 이러한 접근 방식은 라이브 영상을 견뎌, 어떤 taggable 세포 내 또는 세포 외 단백질의 간격을 모니터링하는 데 이용 될 수있는 투명한 모델 생물에 적용 할 수있다. 여기에 설명 된 기술의 변화는 배양 세포 20,23 초파리 (22)와 마우스 (21) 배아에서 수행되었다.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP(다음 웹 사이트에서 다운로드: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>PyFDAP 웹 사이트에 제공된 지침에 따라 설치 및 작동하십시오. PyFDAP은 Linux, Mac 및 Windows 운영 체제와 호환됩니다.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 전사 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>배아에 주입하기 위한 캡이 있는 mRNA를 생성하기 위해</td></tr><tr><td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>mRNA와 동시 주입하여 세포 내 및 세포 외 마스크 생성</td></tr><tr><td>6-well plastic dish</td><td>BD Falcon</td><td></td> 배아 배지를 <td>장착할 준비가 될 때까지 아가로스로 코팅된 웰에서 배아를 배양합니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td>250 mg/L 인스턴트 오션 솔트, 1&nbsp; </td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td>의 NaHCO3Protease로 pH 7로 조정된 역삼투압 물에 methylene blue <td>5 mg/ml 스톡을 만들고 1&nbsp; mg/ml 단세포 단계에서 배아를 탈척시키기 위해</td></tr><tr><td>직경 5cm 유리 페트리 접시</td><td></td><td></td><td>배아 탈이온화용</td></tr><tr><td>200ml 유리 비커</td><td></td><td></td><td>배아 탈이온화용</td></tr><tr><td>미세주입 장치</td><td></td><td></td><td>단세포 단계에서 배아에 mRNA 및 염료를 주입하기 위해</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td></td><td></td><td>배아</td></tr> <tr><td>주입 및 장착용1x Danieau의 매체</td><td></td><td></td>는 <td>저 융점 아가로스를 희석하고 이 매체에서 이미징을 수행합니다; 레시피: 0.2 mm 여과 용액의 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5&nbsp; mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure 저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>배아 장착용; Danieau의 매체에서 1%의 농도로 사용: 200 mg을 20 ml Danieau의 매체에 추가하고, 전자레인지에서 용해된 후, 분취 1&nbsp; ml를 마이크로 원심 분리기 튜브로; 부분 표본은 4°C; C, 70&nbsp에서 재용융; &데그; C, 40&#8211로 냉각; 42 &도; C 사용할 준비가 되었을 때</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>배아 장착용; 들쭉날쭉한 가장자리가 배아를 손상시키지 않도록 팁을 불태웁니다.</td></tr><tr><td>금속 프로브</td><td></td><td></td><td>장착 중 배아 배치를 위해</td></tr><tr><td>MatTek</td><td></td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>목표에 적합한 커버 유리 두께를 사용하십시오; 여기에 나열된 부품 번호는 커버 유리 번호 1.5입니다.</td></tr><tr><td>15 ml 튜브에는 ~5 ml 배아 매체</td><td>BD Falcon</td><td></td>이 채워져 <td>있습니다. 파스퇴르 피펫에서 잔여 아가로스를 헹구기 위한</td></tr> 것입니다. <tr><td>반전 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>A 수은 아크 램프, 488&nbsp; nm 레이저, 543nm 레이저 및 적절한 필터 세트가 필요합니다</td></tr><tr><td>가열된 단계</td><td></td><td></td><td>배아를 28°C의 최적 온도로 유지하기 위해; C 실험 중</td></tr><tr><td>타임랩스 이미징</td><td></td><td></td>이 가능한 컨포칼 소프트웨어는 <td>여러 위치를 정의하고 정의된 간격으로 자동으로 이미지화할 수 있어야 합니다.</td></tr><tr><td>이미징을 위한</td> <td>25X 또는 40X 물 대물렌즈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광변환을 위한</td><td>10X 공기 대물렌즈</td><td></td><td></td></tr><tr>물과 <td>동일한 굴절률을 가진 침</td><td>수 오일</td><td></td><td></td> 이멀젼 오일</tr></tbody></table>

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (fdap)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

단백질 안정성은 생물학의 여러 측면에 영향을 미친다, 단백질의 클리어런스 동역학을 측정하는 중요한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. FDAP 실험에서 생체 내에서 단백질의 클리어런스를 측정 할 수있다. 관심있는 단백질은 형광 단백질 photoconvertible 태그로 생체 내에서 발현시키고 photoconverted하고 시간의 photoconverted 신호의 감소를 모니터한다. 데이터는 단백질의 반감기를 결정하는 적절한 클리어런스 모델 붙인다. 중요하게는, 다른 생물체의 구획 단백질 집단의 동력학 클리어런스는 구획되지 마스크를 적용함으로써 별도로 검사 할 수있다. 이 접근법은 제브라 개발 중에 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 및 세포 내 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 FDAP 실험을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 간극의 역학을 결정할 FDAP을 사용하는 것이 가능해야광학적으로 접근 유기체의 모든 taggable 단백질.

FDAP 지브라 피쉬 19 배아 세포 외 신호 전달 단백질의 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 이들 단백질 중 하나 퀸트가 배아 발생 동안 34 mesendodermal 유전자의 발현을 유도한다. 곁눈질-Dendra2가 QRT-PCR에 의해 현장 하이브리드 분석 (19)에서 입증 된 바와 같이, 태그가 곁눈질 비슷한 수준에서 mesendodermal 유전자의 발현을 활성화합니다. 배아 Alexa488 덱스 트란 및 mRNA를 퀸트-Dendra2를 인코딩하고 FDAP 분석 실시와 공동 주사 하였다. 시간이 지남에 따라 세포 외 photoconverted 신호 강도의 감소는 분명 (도 4A)이다. 23 배아에서 세포 외 강도 프로파일은 PyFDAP을 사용하여 생성되었다. 결과 데이터는 일차 간극 동역학 모델 PyFDAP에 설치하고, 116 분의 평균 반감기 τ에 대응 1.00 X 10-4 /...

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라 피쉬 배아에서 세포 내 및 세포 외 단백질 안정성을 측정하는 것입니다. 이는 관심 단백질에 광 컨버터블 형광 단백질을 태그하고 mRNA를 주입하여 융합체와 형광 염료를 제브라피시 배아에 인코딩함으로써 달성됩니다. 다음으로, 광 변환 핵융합 단백질은 광으로 변환되어 펄스가 단백질을 라벨링합니다.이 예에서는 융합 단백질이 분비된 다음 시간이 지남에 따라 세포 내 및 세포 외 광변환 형광 강도의 붕괴를 모니터링하고 융합 단백질의 세포 내 및 세포 외 반감기를 결정하기 위해 기하급수적으로 감소하는 기능을 장착합니다. 결과는 시간 경과에 따른 형광 신호의 붕괴를 기반으로 광 컨버터블 융합 단백질의 생체 내 안정성을 보여줍니다. 이 방법은 세포 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 안정성이 단백질 분포 및 가용성에 미치는 영향. FD DP 데이터 분석을 위해 소프트웨어 EP를 사용하고 있습니다. EP는 당사 웹페이지에서 무료로 사용할 수 있습니다: 녹색에서 적색으로 변환하는 융합 단백질을 인코딩하여 캡핑된 mRNA를 생성한 후, 약 31개의 세포기 제브라피시 배아를 약 8밀리리터의 배아 배지가 들어 있는 5cm 직경의 유리 또는 한천 장미 코팅 플라스틱 페트리 접시로 전달합니다.미리 준비하고 해동한 프로 네이 스톡 용액 2ml를 접시에 넣고 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 유리 스피커에 배아 배지를 채우고 배아가 공기나 플라스틱에 노출되지 않도록 하면서 배지에 담그면서 페트리 접시를 기울여 배아를 비커로 옮깁니다. 배아가 비커 바닥에 가라앉은 후 배지의 대부분을 붓고 새 배지를 사용하여 조심스럽게 교체합니다.신선한 배지의 가벼운 소용돌이는 배아가 약해진 코리온을 잃게 만듭니다. 세척을 반복한 후 화염 팁이 있는 유리 PE 피펫을 사용하여 코팅된 배아를 아가로스 코팅된 주입 접시로 옮깁니다. 그런 다음 mRNA와 3킬로달톤 Alexa 4 88 DExT Strand 접합체를 세포 중앙에 직접 주입하여 mRNA와 염료의 균일한 분포를 보장합니다.일단 분열이 시작되면, 주입된 배아를 배아, 배지로 채워진 6웰 플라스틱 접시의 1-2% 아가로스 코팅된 웰로 옮기고, 실체 현미경으로 배아가 후기 구체 단계에 도달할 때까지 섭씨 28도의 어둠 속에서 배양하고, 1-5개의 건강한 배아를 식별하고, 불꽃 팁이 있는 유리 PE 피펫을 사용하여 접시에서 배아를 제거합니다. 하나의 x danios 배아 배지에 약 1ml의 용융된 1% 낮은 융점 aros가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 배아를 부드럽게 배출합니다. 다음으로, 몇 가지 아로와 함께 배아를 피펫으로 다시 끌어들입니다.그런 다음 aros와 배아를 덮개로 부드럽게 배출합니다. 유리 바닥 접시 유리. 유리 피펫을 재사용하려면 배아 배지를 위아래로 빠르게 피펫팅하여 막힘을 방지하기 위해 잔류 아로스를 청소하고 아로스가 응고되기 전에 빠르게 작업하십시오.금속 프로브를 사용하여 동물 기둥이 실체 현미경 아래의 커버 유리를 향하도록 배아를 배치합니다. 배아 위치를 모니터링하고 아가로가 굳어질 때까지 필요에 따라 재조정합니다. 수풀이 굳어지면 하나의 x danios 배아 배지를 사용하여 유리 바닥 접시를 채웁니다.사진 변환을 준비하려면 인큐베이터를 섭씨 28도로 설정하고 대물렌즈에 침지 오일을 크게 떨어뜨려 대물렌즈와 커버 유리 사이의 유막이 stage가 다른 배아 위치로 이동할 때 깨지지 않도록 합니다. 이미징하는 동안 안전하게 유리 바닥 접시를 무대에 놓습니다.tage 무대가 움직일 때 접시가 움직이지 않도록 합니다. 다음으로 컨포칼 현미경의 소프트웨어 패키지에서 각 배아의 위치를 정의합니다.각 배아의 Z 깊이를 조정하고 4, 88 및 5, 43 나노미터 레이저를 모두 사용하여 각 배아에서 거의 동일한 평면을 목표로 삼습니다. 사전 사진 변환 이미지를 획득합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경 소프트웨어를 구성하여 적절한 이미징 조건으로 이전에 정의된 각 위치를 이미지화합니다.10분 또는 20분 또는 5시간마다 사진을 변환하고, 융합 단백질을 10 x 대물렌즈로 전환하고, 약 300-400 나노미터 필터로 수은 램프의 자외선에 배아 그룹을 노출시켜 100% 출력으로 2분 동안 노출시킵니다. Z축을 따라 초점을 이동하여 사진 변환 후 균일한 사진 변환을 촉진합니다. 즉시 25 x 또는 40 x 대물렌즈로 다시 전환하고 이전에 정의된 위치가 여전히 정확한지 확인합니다.사진 변환 중에 접시가 이동하면 배아의 위치를 재정의하십시오. 이미징 시간 코스를 시작하고 5시간 동안 실행하도록 합니다. 각 배아에 대한 사진 변환과 이미징 시작 사이에 경과된 시간을 기록하십시오.때때로 실험을 확인하고 Danielle의 매체 수준을 모니터링하고 필요한 경우 더 추가합니다. 먼저 각 배아의 시간 경과 데이터 세트를 육안으로 검사합니다. 이미징 중에 사망한 배아에서 크게 이동했거나, 사진 변환 신호 수준이 매우 낮거나, 이상하게 보이고 이동 및 분열을 멈춘 세포 영역이 포함된 배아에서 데이터 세트를 폐기합니다.PI F DAP는 Python 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 엄격하게 세포 내인 Alexa 4 88 신호를 사용하여 마스크를 생성합니다. 세포 내 및 세포 외 광 변환 신호를 분리하려면 해당 적색 채널 이미지에 마스크를 적용하여 세포 내 픽셀이 고려되지 않도록 합니다. 평균 세포 내 강도를 측정하기 위해 평균 세포 외 강도를 계산할 때, 마스크를 반전시키고, 생성된 마스킹된 이미지를 표시하고, 이를 육안으로 검사하고, 마스크가 세포 내 공간과 세포 외 공간을 정확하게 구분하지 못하는 데이터 세트를 폐기합니다.PI F DAP을 사용하여 각 이미지에 대한 평균 세포 외 및 세포 내 형광 강도를 계산합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 여기에 표시된 대로 형광 데이터를 맞추고 세포외 및 세포 내 단백질을 계산합니다. 반감기는 클리어런스 비율에서 타우됩니다.콘스탄스 K 사근(Constance K squint)은 제브라피시 배발생(embryogenesis) 과정에서 미배엽 유전자의 발현을 유도하는 분비 단백질입니다. 이 실험에서 배아는 Alexa 4 88 dextran 및 mRNA 인코딩 사근 DENDRA 2를 공동 주입하고 F DAP 분석을 실시했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 세포 외 광 변환 신호 강도는 시간이 지남에 따라 감소합니다.PI F dap를 사용하여 23개 배아의 세포 외 강도 프로파일을 생성하고 데이터에 1차 정리 모델을 장착했습니다. 결과는 평균 반감기 타우가 116분임을 나타냅니다. 유사한 강도 프로파일과 단백질.반감기는 이미징 사이의 간격이 10분 또는 20분일 때 얻어졌습니다. 사진 표백 또는 부주의한 사진 변환이 강도 변화에 크게 기여하지 않았음을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 사진 변환 후 형광 감쇠를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.in vivo 측정. 살아있는 제브라피시 배아에서 광 컨버터블 융합 단백질의 반감기.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Multiphoton 현미경은 광학 깊이 침투 및 감소 phototoxicity 낮은 에너지 광자를 제어할 수 있습니다. 우리는 zebrafish 배아에 살고 세포 라벨이 기술의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 다양한 가벼운 반응 분자의 사진 유도를 위해 적용할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

본 연구에서는 살아있는 제브라피시 배아 내에서 광전환형 형광 단백질(PCFPs)의 광활성화 스위칭 방법과, 발달 과정 중 특정 시점에서 광전환된 단백질을 추적하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 통해 살아있는 척추동물 유기체 내에서 다양한 발달 과정의 근간이 되는 세포 생물학적 사건들을 모니터링할 수 있습니다.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

제브라 피쉬는 만성 신장 질환 (CKD)을 모델로 인기있는 도구입니다. 그러나, 작은 크기 것이 불가능 전통적인 방법을 이용하여 신장 기능을 평가한다. 우리는 CKD에 제브라 피쉬의 신장 기능의 정량 분석을 할 수있는 형광 염료 신장 클리어런스 분석 한 설명합니다.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

세포의 해출 및 이식과 같은 배아 조작은 초기 발달을 연구하기 위한 중요한 도구입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 이러한 조작을 수행하기 위해 간단하고 효과적인 이식 장치를 설명합니다.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

배우세요 광 변환 형광 붕괴를 이용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 단백질 안정성을 측정하는 방법을. 세포 내외 단백질 반감기를 정량화하여 발달생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

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