광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 제브라 피쉬 배아에서 세포 내 및 세포 외 단백질 안정성을 측정하는 것입니다. 이는 관심 단백질에 광 컨버터블 형광 단백질을 태그하고 mRNA를 주입하여 융합체와 형광 염료를 제브라피시 배아에 인코딩함으로써 달성됩니다. 다음으로, 광 변환 핵융합 단백질은 광으로 변환되어 펄스가 단백질을 라벨링합니다.

이 예에서는 융합 단백질이 분비된 다음 시간이 지남에 따라 세포 내 및 세포 외 광변환 형광 강도의 붕괴를 모니터링하고 융합 단백질의 세포 내 및 세포 외 반감기를 결정하기 위해 기하급수적으로 감소하는 기능을 장착합니다. 결과는 시간 경과에 따른 형광 신호의 붕괴를 기반으로 광 컨버터블 융합 단백질의 생체 내 안정성을 보여줍니다. 이 방법은 세포 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 안정성이 단백질 분포 및 가용성에 미치는 영향. FD DP 데이터 분석을 위해 소프트웨어 EP를 사용하고 있습니다. EP는 당사 웹페이지에서 무료로 사용할 수 있습니다: 녹색에서 적색으로 변환하는 융합 단백질을 인코딩하여 캡핑된 mRNA를 생성한 후, 약 31개의 세포기 제브라피시 배아를 약 8밀리리터의 배아 배지가 들어 있는 5cm 직경의 유리 또는 한천 장미 코팅 플라스틱 페트리 접시로 전달합니다.

미리 준비하고 해동한 프로 네이 스톡 용액 2ml를 접시에 넣고 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 유리 스피커에 배아 배지를 채우고 배아가 공기나 플라스틱에 노출되지 않도록 하면서 배지에 담그면서 페트리 접시를 기울여 배아를 비커로 옮깁니다. 배아가 비커 바닥에 가라앉은 후 배지의 대부분을 붓고 새 배지를 사용하여 조심스럽게 교체합니다.

신선한 배지의 가벼운 소용돌이는 배아가 약해진 코리온을 잃게 만듭니다. 세척을 반복한 후 화염 팁이 있는 유리 PE 피펫을 사용하여 코팅된 배아를 아가로스 코팅된 주입 접시로 옮깁니다. 그런 다음 mRNA와 3킬로달톤 Alexa 4 88 DExT Strand 접합체를 세포 중앙에 직접 주입하여 mRNA와 염료의 균일한 분포를 보장합니다.

일단 분열이 시작되면, 주입된 배아를 배아, 배지로 채워진 6웰 플라스틱 접시의 1-2% 아가로스 코팅된 웰로 옮기고, 실체 현미경으로 배아가 후기 구체 단계에 도달할 때까지 섭씨 28도의 어둠 속에서 배양하고, 1-5개의 건강한 배아를 식별하고, 불꽃 팁이 있는 유리 PE 피펫을 사용하여 접시에서 배아를 제거합니다. 하나의 x danios 배아 배지에 약 1ml의 용융된 1% 낮은 융점 aros가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 배아를 부드럽게 배출합니다. 다음으로, 몇 가지 아로와 함께 배아를 피펫으로 다시 끌어들입니다.

그런 다음 aros와 배아를 덮개로 부드럽게 배출합니다. 유리 바닥 접시 유리. 유리 피펫을 재사용하려면 배아 배지를 위아래로 빠르게 피펫팅하여 막힘을 방지하기 위해 잔류 아로스를 청소하고 아로스가 응고되기 전에 빠르게 작업하십시오.

금속 프로브를 사용하여 동물 기둥이 실체 현미경 아래의 커버 유리를 향하도록 배아를 배치합니다. 배아 위치를 모니터링하고 아가로가 굳어질 때까지 필요에 따라 재조정합니다. 수풀이 굳어지면 하나의 x danios 배아 배지를 사용하여 유리 바닥 접시를 채웁니다.

사진 변환을 준비하려면 인큐베이터를 섭씨 28도로 설정하고 대물렌즈에 침지 오일을 크게 떨어뜨려 대물렌즈와 커버 유리 사이의 유막이 stage가 다른 배아 위치로 이동할 때 깨지지 않도록 합니다. 이미징하는 동안 안전하게 유리 바닥 접시를 무대에 놓습니다.tage 무대가 움직일 때 접시가 움직이지 않도록 합니다. 다음으로 컨포칼 현미경의 소프트웨어 패키지에서 각 배아의 위치를 정의합니다.

각 배아의 Z 깊이를 조정하고 4, 88 및 5, 43 나노미터 레이저를 모두 사용하여 각 배아에서 거의 동일한 평면을 목표로 삼습니다. 사전 사진 변환 이미지를 획득합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경 소프트웨어를 구성하여 적절한 이미징 조건으로 이전에 정의된 각 위치를 이미지화합니다.

10분 또는 20분 또는 5시간마다 사진을 변환하고, 융합 단백질을 10 x 대물렌즈로 전환하고, 약 300-400 나노미터 필터로 수은 램프의 자외선에 배아 그룹을 노출시켜 100% 출력으로 2분 동안 노출시킵니다. Z축을 따라 초점을 이동하여 사진 변환 후 균일한 사진 변환을 촉진합니다. 즉시 25 x 또는 40 x 대물렌즈로 다시 전환하고 이전에 정의된 위치가 여전히 정확한지 확인합니다.

사진 변환 중에 접시가 이동하면 배아의 위치를 재정의하십시오. 이미징 시간 코스를 시작하고 5시간 동안 실행하도록 합니다. 각 배아에 대한 사진 변환과 이미징 시작 사이에 경과된 시간을 기록하십시오.

때때로 실험을 확인하고 Danielle의 매체 수준을 모니터링하고 필요한 경우 더 추가합니다. 먼저 각 배아의 시간 경과 데이터 세트를 육안으로 검사합니다. 이미징 중에 사망한 배아에서 크게 이동했거나, 사진 변환 신호 수준이 매우 낮거나, 이상하게 보이고 이동 및 분열을 멈춘 세포 영역이 포함된 배아에서 데이터 세트를 폐기합니다.

PI F DAP는 Python 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 엄격하게 세포 내인 Alexa 4 88 신호를 사용하여 마스크를 생성합니다. 세포 내 및 세포 외 광 변환 신호를 분리하려면 해당 적색 채널 이미지에 마스크를 적용하여 세포 내 픽셀이 고려되지 않도록 합니다. 평균 세포 내 강도를 측정하기 위해 평균 세포 외 강도를 계산할 때, 마스크를 반전시키고, 생성된 마스킹된 이미지를 표시하고, 이를 육안으로 검사하고, 마스크가 세포 내 공간과 세포 외 공간을 정확하게 구분하지 못하는 데이터 세트를 폐기합니다.

PI F DAP을 사용하여 각 이미지에 대한 평균 세포 외 및 세포 내 형광 강도를 계산합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 여기에 표시된 대로 형광 데이터를 맞추고 세포외 및 세포 내 단백질을 계산합니다. 반감기는 클리어런스 비율에서 타우됩니다.

콘스탄스 K 사근(Constance K squint)은 제브라피시 배발생(embryogenesis) 과정에서 미배엽 유전자의 발현을 유도하는 분비 단백질입니다. 이 실험에서 배아는 Alexa 4 88 dextran 및 mRNA 인코딩 사근 DENDRA 2를 공동 주입하고 F DAP 분석을 실시했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 세포 외 광 변환 신호 강도는 시간이 지남에 따라 감소합니다.

PI F dap를 사용하여 23개 배아의 세포 외 강도 프로파일을 생성하고 데이터에 1차 정리 모델을 장착했습니다. 결과는 평균 반감기 타우가 116분임을 나타냅니다. 유사한 강도 프로파일과 단백질.

반감기는 이미징 사이의 간격이 10분 또는 20분일 때 얻어졌습니다. 사진 표백 또는 부주의한 사진 변환이 강도 변화에 크게 기여하지 않았음을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 사진 변환 후 형광 감쇠를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

in vivo 측정. 살아있는 제브라피시 배아에서 광 컨버터블 융합 단백질의 반감기.