Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

이 현미경 검사 방법의 전반적인 목표는 초해상도 및 주사 전자 현미경 이미지를 상관시켜 유충 제브라피시 망막의 다양한 세포 내 소기관과 관련하여 단백질 발현을 정확하게 국소화하는 것입니다. 이 방법은 돌연변이의 단백질 오국소화 연구와 같은 망막 발달 및 세포 경로 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초해상도와 주사 전자 현미경을 결합하여 샘플의 구조적 맥락 내에서 매우 정확한 단백질 국소화 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다.

실리콘 웨이퍼에 Tokuyasu 단면을 수집하면 취급이 상당히 용이하며 대비를 위해 백금 음영을 사용하면 샘플의 좋은 지형을 얻을 수 있습니다. 따라서 이 방법은 유충 제브라피시 망막 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것의 주요 이점 중 하나는 마우스 조직에서 단백질 발현 식별과 같은 다른 많은 생물학적 시스템에도 적용할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 고정된 제브라피시 유충에서 눈을 해부한 후 PBS에 15%의 현지 식품 브랜드 젤라틴 12ml를 섭씨 40도에서 워밍업합니다. 그런 다음 눈관에서 PBS를 흡인하고 젤라틴 용액을 첨가합니다. 젤라틴이 샘플에 침투하도록 튜브를 부드럽게 두드리고 섭씨 40도에서 10-30분 동안 온도 블록에서 부드럽게 흔들어 주거나 수조에서 배양합니다.

섭씨 40도의 수조에서 12 x 5 x 3mm 실리콘 또는 폴리에틸렌 플랫 임베딩 몰드를 따뜻한 젤라틴으로 채웁니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 금형당 두 개의 눈을 추가하고 쌍안경 아래에 해부 바늘을 사용하여 적절하게 정렬합니다. 젤라틴을 실온에서 1분 동안 식힌 후 섭씨 4도에서 20분 동안 굳힙니다.

쌍안경 아래에서 면도날을 사용하여 젤라틴 블록을 블록당 하나의 눈에 맞게 다시 다듬습니다. 젤라틴이 삽입된 눈을 얼음 위의 PBS에서 2.3 어금니 자당으로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그런 다음 샘플을 새로운 2.3 몰 자당 용액으로 교환합니다. 그리고 조직을 섭씨 4도 또는 영하 20도에서 보관하여 최대 몇 개월까지 보관할 수 있습니다. 젤라틴 블록을 크라이오 핀으로 옮기기 전에 거의 눈 크기로 다시 다듬습니다.

그런 다음 블록을 액체 질소로 동결하고 초저온 초박 절편기로 옮깁니다. 초저온 초박 절편기에 다이아몬드 나이프를 사용하여 섭씨 영하 120도에서 110나노미터 두께의 절편을 자릅니다. 2% 메틸셀룰로오스 방울과 2.3몰 자당 용액을 포함하는 유선 루프가 있는 단면을 선택합니다.

그런 다음 섹션을 7 x 7mm 실리콘 웨이퍼로 옮깁니다. 웨이퍼를 세척하려면 4방울을 피펫으로 분사하고 웨이퍼를 방울 위에 거꾸로 놓습니다. 20분 동안 섭씨 0도에서 방울의 웨이퍼를 배양합니다.

그런 다음 웨이퍼를 PBS에서 실온에서 각각 2분씩 두 번 세척합니다. PBS의 0.15%글리신에서 샘플을 각각 1분 동안 3회 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세척당 1분 동안 샘플을 세 번 세척합니다.

PBG로 조직을 5분 동안 사전 배양합니다. 다음으로 PBG의 rabbit anti-Tom20을 섹션에 추가합니다. 그리고 웨이퍼를 실온에서 30분 동안 배양합니다.

PBG를 사용하면 세척할 때마다 1분 동안 티슈를 6번 세척합니다. 그런 다음 PBG로 샘플을 실온에서 5분 동안 사전 배양합니다. PBG에서 PBG를 Alexa 647 anti-rabbit 2가 Fab fragments로 교체하고 30분 동안 배양합니다.

세척할 때마다 1분 동안 PBG로 샘플을 6번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 웨이퍼를 2분 동안 세 번 세척합니다. 웨이퍼에 DAPI 및 PBS를 추가하고 10초 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS를 사용하여 각각 2분씩 두 번 샘플을 세척합니다. 웨이퍼를 80% 글리세롤의 일대일 용액과 산소 제거 시스템이 포함된 이미징 버퍼의 한 방울에 놓고 잠시 배양합니다. 웨이퍼 쪽이 아래를 향하게 하여 80% 글리세롤과 이미징 버퍼의 일대일 혼합물을 유리 바닥 페트리 접시에 새로 떨어뜨립니다.

모든 면에서 피펫을 사용하여 웨이퍼 아래에 있는 대부분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 실리콘 줄무늬를 사용하여 웨이퍼를 페트리 접시 바닥에 고정합니다. 장착된 섹션을 높은 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 도립 현미경에 놓습니다.

이미징하기 전에 측면 및 축 방향 드리프트를 최소화하거나 줄이기 위해 샘플을 현미경 온도와 평형을 이루도록 합니다. 관심 영역을 중앙에 배치하고 광시야 epifluorescence 참조 이미지를 획득합니다. 초해상도 작동 모드로 변경합니다.

카메라의 노출 시간을 15밀리초로 조정하고 전자 곱셈 이득을 최대값 300으로 설정합니다. 다음으로, 최대 레이저 출력에서 642 나노미터 레이저로 에피형광 모드에서 샘플을 조명합니다. 각 프레임에서 단일 분자 깜박임이 잘 분리되어 개별 신호가 겹칠 확률이 낮아지면 레이저 출력을 거의 1/3로 줄입니다.

epifluorescence에 있는 익지않는 이미지를 30, 000의 구조의 최소한을 취득해서 기록하십시오. 원시 데이터의 Tools(도구)에서 t-Series Analysis(t-시리즈 분석)는 30 광자의 검출 임계값을 사용합니다. Evaluate(평가)를 클릭하여 현지화 이벤트 목록을 생성합니다.

Tools의 Eventlist Processing 패널에서 Create Image를 클릭하여 4나노미터의 렌더링 픽셀 크기를 적용하여 가우스 피팅에 의한 초고해상도 이미지를 시각화합니다. 실리콘 줄무늬를 제거하고 웨이퍼 가장자리 가까이에 PBS 한 방울을 추가하여 페트리 접시에서 들어 올립니다. PBS를 사용하여 웨이퍼를 각각 2분씩 두 번 세척한 후 PBS에 0.1%글루타르알데히드를 사용하여 5분 동안 후수정하십시오.

그런 다음 PBS에서 세척할 때마다 2분 동안 샘플을 다시 두 번 세척합니다. 얼음 위의 물에 2% 메틸셀룰로오스 한 방울을 떨어뜨려 웨이퍼를 배양당 5분 동안 두 번 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 원심 분리기 튜브에 삽입하고 14, 100 회 g에서 90 초 동안 원심 분리하십시오.

스핀 후 전도성 탄소 시멘트를 사용하여 SEM 알루미늄 스터브에 웨이퍼를 장착합니다. 전자빔 증착 장치를 사용하여 다음 설정으로 회전 음영을 통해 샘플에 2-10나노미터의 백금 탄소 층을 추가합니다. 1.5kV, 2mm 작동 거리의 주사 전자 현미경 및 렌즈 내 2차 전자 검출기를 사용한 이미지 섹션.

Fiji를 사용하여 파일, 열기를 클릭하여 광 및 전자 현미경 이미지를 모두 엽니다. Image(이미지), Adjust(조정), Canvas Size(캔버스 크기)를 클릭하여 캔버스 크기를 조정합니다. 그런 다음 이미지(Image), 스택(Stacks), 이미지를 스택할 이미지(Images to Stack)를 클릭하여 두 이미지를 모두 스택으로 가져옵니다.

피지에서 파일, 새로 만들기, EM2 새로 만들기를 클릭하여 새 트랙 EM2 인터페이스를 엽니다. 검은색 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Import stack을 선택하여 두 이미지가 모두 포함된 스택을 가져옵니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Align, Align layer manually with landmarks를 선택하여 광학 현미경 이미지를 랜드마크가 있는 전자 현미경 이미지에 수동으로 정렬합니다.

선택 도구를 선택하여 랜드마크를 추가합니다. 핵의 모양을 참조로 사용하여 두 이미지에서 동일한 가장자리를 선택하고 여러 점을 추가합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 아핀 모델로 정렬을 적용하고 Apply transform, Affine Model을 선택합니다.

마지막으로 도면층 투명도를 변경하여 정렬의 품질을 평가합니다. 이 패널은 수정 후 5일간의 제브라피시 망막 절편의 저배율 광시야 이미지를 보여줍니다. 동일한 영역이 주사 전자 현미경으로 여기에 표시됩니다.

이 고배율 이미지는 Tom20이 미토콘드리아에서 클러스터와 함께 빨간색으로 염색된 것을 보여줍니다. Tom20의 발현은 GSDIM 현미경으로 감지된 바와 같습니다. 이 이미지에서 동일한 섹션은 상관 초해상도와 주사 전자 현미경을 결합합니다.

Tom20 염색은 미토콘드리아의 외막에 있는 미토콘드리아 클러스터 내에서 나타납니다. 핵의 형광 DAPI 신호는 SEM 이미지의 지형과 일치합니다. 이 SEM 이미지는 GSDIM 이미지의 Tom20 염색에 대한 컨텍스트를 제공합니다.

미토콘드리아 크리스테(Mitochondrial cristae)가 명확하게 보이며, Tom20 염색은 미토콘드리아의 외막에 국한되어 있습니다. 광 수용체의 바깥쪽 세그먼트의 막은 명확하게 분해되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 라벨링 및 이미징 매개변수를 최대한 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

최적으로 라벨링된 샘플만이 초고해상도에 적합합니다. 샘플은 라벨링 절차 중 어떤 경우에도 건조되어서는 안 됩니다. 이 절차는 면역형광을 이중 표지하는 것으로 확장될 수 있으며, 따라서 특정 구조 내에서 두 개의 서로 다른 단백질을 국소화할 수 있습니다.

더 복잡한 샘플의 경우, 이미지의 정확한 정렬을 얻기 위해 기준 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초고해상도 정밀도로 복잡한 조직 샘플에서 세포의 서로 다른 소기관과 관련하여 단백질을 국소화하기 위한 상관 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.