Name: Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 배우세요 초해상도 및 주사전자현미경 상관관계 분석을 이용한 제브라피시 망막 단백질 정밀 위치추적 방법을 통해 망막 발달과 세포 소기관 연구에 활용할 수 있는 고해상도 영상 기술을 익히세요.

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이온 및 RGB 자금: PZ00P3 142404/1, PZ00P3 163979 스위스 국립 과학 재단 Ambizione-점수 부여.

모든 실험 ARVO 문을 따라 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 수행 했다 및 지방 기관에 의해 승인 했다.
 1. 준비 Ultrathin 섹션의 실리콘 웨이퍼 <ol><li>샘플 고정 <ol><li>0.1%도, 0.1 m M cacodylate 버퍼에 4% 포름알데히드를 포함 된 통 솔루션 준비. 
		참고: 주의! 도, 포 름 알 데히드 및 cacodylate 버퍼에 작업할 때 주의 사용 하 여 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 증기 두건에서 일.</li>
		<li>안락사 5 일 게시 수정 (5 dpf) zebrafish 애벌레 tricaine (에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate, PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7)에서 0.4 %w / v)와 앞에서 설명한 15.</li>
		<li>얼음에 미리 냉장된 통 솔루션에 집중 하 여 애벌레를 수정. 머리를 제거 하 고 부드러운 락 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>트리밍 1 %agarose 베드 플레이트에 냉장된 통 솔루션의 미세 집게와 (쌍안경) 아래 서 메스를 사용 하 여 눈 주위 조직에 의해 눈을 해 부. 신선한 냉장된 사전 정착 액 튜브 눈 전송.</li>
		<li>각 세척 실 온 (RT)에서 5 분 동안 PBS (인산 염 버퍼 염 분, pH 7.4)에 두 번 세척.</li>
	</ol></li> <li>젤라틴 침투와 장착 <ol><li>워밍업-15 mL 지역 식품 브랜드 젤라틴 12 %w / v 샌드위치 (인산 염 버퍼, 0.1 m M pH 7.4)에 40 ° C. PBS를 제거 하 고 눈을 들어 있는 튜브에 젤라틴 해결책을 추가 하십시오. 부드럽게 젤라틴 침투 샘플 및 부드러운 떨고와 thermoblock 또는 물 욕조에 40 ° C에서 10-30 분 동안 품 어 튜브 누릅니다.</li>
		<li>채우기 12 m m x 5 m m x 3 m m 실리콘 또는 폴 리 에틸렌 40 ° C 물 욕조에 따뜻한 젤라틴으로 금형을 포함 하는 평면. 추가 곰 팡이를 피 펫을 사용 하 여 당 두 눈, 제대로 해 부 바늘을 사용 하 여 눈 아래 그들을 정렬 시키고 젤라틴 1 분 동안 실내 온도에 아래로 냉각 하 고 20 분에 4 ° C에서 강화</li>
		<li>다시 잘라 면도날을 사용 하 여 블록 당 한쪽 눈에 맞게 눈 아래 젤라틴 블록.</li>
		<li>얼음에 샌드위치에 2.3 M 자당 포함 된 젤라틴 눈 전송. 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>Exchange 새로운 2.3 M 자당 솔루션 및 4 ° C 또는-20 ° C에 게가이 단계 후 샘플 단면에 대 한 준비가 또는 개월에 몇 주 동안-20 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>다시 cryo-핀에 전송 하기 전에 눈의 거의 크기에 젤라틴 블록을 잘라. 액체 질소 및 곳을 알아내는-ultramicrotome 이전에 동결.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>cryo ultramicrotome에 다이아몬드 칼으로-120 ° C에서 잘라 110 nm 두께-섹션.</li>
		<li>유선 루프 (물)에 2% 스와 2.3 M 자당 솔루션 (1:1)의 작은 물방울을 포함 하는 섹션을 선택 합니다. 7 x 7 mm 실리콘 웨이퍼에 섹션을 전송. 추가 처리까지 4 ° C에서 섹션 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>방울에 웨이퍼를 거꾸로 배치 하 여 4 개의 상품에 20 분에 대 한 0 ° C에서 PBS로 세척 웨이퍼. PBS는 실내 온도에 2 x 2 분에 세척.</li>
	<li>품 어 3 번, PBS에 0.15% 글리신에 1 분. 1 분 동안 3 배 세척/PBS로 세척. 5 분에 PBG (0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA와 0.2% 젤라틴 타입 B PBS)와 미리 incubate</li>
	<li>토끼 안티-Tom20와 품 (재료의 표 참조) PBG에 (4 µ g/mL) 실 온에서 30 분.</li>
	<li>는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. 반대로 토끼 알 렉 사 647 F(ab&#39;) 2 실시간 품에서 5 분 동안 PBG로 사전 incubate (재료의 표 참조) PBG에 (7.5 µ g/mL) 30 분에 대 한</li>
	<li>는 PBG에 1 분/세척을 위한 6 x를 씻어. PBS에서 3 x 2 분을 씻어. DAPI 함께 품 어 (4 µ g/mL) 10에 대 한 PBS에 PBS에 2 x 2 분 세척 s..</li>
</ol> 3. 슈퍼 해상도 현미경 <ol><li>품 웨이퍼 짧게 (10 s) 글리세롤 (80%)의 1:1 솔루션의 물방울에 그것을 배치 하 고 이미징 버퍼 청소 시스템 (200 m m 인산 염 버퍼 10% 포도 당, 0.5 mg/mL를 포함 하는 산소를 포함 하 여 glucoseoxidase, 40 µ g/mL catalase 15 m m 베타 mercaptoethylamine 염 산 염 (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>글리세롤 (80%)의 1:1 혼합물의 신선한 방울에 유리 하단 (두께 170 ± 5 μ m) 페 트리 접시 (섹션 아래로 향하게) 웨이퍼 전송 및 이미징 (3.1 단계)에서 버퍼.</li>
	<li>피 펫와 모든 면에서 웨이퍼 아래 액체의 대부분을 제거합니다. 페 트리 접시의 바닥에 웨이퍼를 해결 하기 위해 사용 하는 실리콘 줄무늬. 
	참고: 실리콘 줄무늬 2 구성 요소 실리콘 접착제 (3 m m x 12 m m) 밖으로 만들어집니다.</li>
	높은 수 가늠 구멍을 사용 하는 거꾸로 한 현미경에 <li>이미지 섹션 (예: 160 X / 나 1.43; 참조 테이블의 재료) 기름 침수 슈퍼 해상도 전용된 목표. 이미징, 이전 하자 최소화/측면 및 축 드리프트를 줄이기 위해 현미경 온도 equilibrate 샘플.</li>
	<li>관심 영역을 가운데로 하 고 첫 번째 widefield epifluorescence 참조 이미지. 슈퍼 해상도 동작 모드를 변경 합니다. 15 ms에 카메라의 노출 시간을 조정 하 고 설정 (EM) 이득 300 최대 멀티 전자.</li>
	<li>조명 샘플은 642 nm 연속파 레이저 epifluorescence 모드에서 최대 레이저 전력 (~2.8 kW/c m 2에 해당)에서. 최대한 빨리 단일 분자 깜박이 잘 분리 각 프레임에 그래서 확률은 낮은 개별 신호 오버랩, 레이저 파워 ~0.7 kW/c m 2로 설정. 30000 프레임의 최소 인수 epifluorescence 모드에서 raw 이미지를 기록. 
	참고: 이러한 모든 매개이 변수 및 밀도 라벨 다른 표본에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>원시 데이터 로부터 재구성 이벤트 목록 (raw 이미지에 각 단일 분자 깜박임의 지역화) 생성을 클릭 하 여 30 광자 (샘플에 따라 조정 될 필요가)의 검출 임계값을 사용 하 여 &#34; 평가 &#34;에 &#39; t-시리즈 분석 &#39;에서 &#39; 도구 &#39;.</li>
	<li>가우스 피팅 16 4의 렌더링 픽셀 크기를 적용 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 시각화를 클릭 하 여 nm &#34; 이미지 만들기 &#34;에 &#39; 이벤트 목록 처리 패널 &#39;에서 &#39; 도구. &#39; 
	참고: 슈퍼 해결된 이미지 생성에 대 한이 연구에 사용 된 시스템의 통합된 소프트웨어 도구 채택 되었다. 그러나, 어떤 다른 단일 분자 기반 시스템에 설명된 슈퍼 해상도 이미지를 수행할 수 및 데이터는 오픈 소스 소프트웨어 도구와 뇌우 17로 처리 될 수.</li>
</ol> 4. 플래티넘 Shadowing <ol><li>실리콘 줄무늬를 제거 하 고 배양 접시에서 그것을 해제 하는 웨이퍼의 가장자리 가까운 PBS의 한 방울을 추가. 웨이퍼에 PBS, 2 x 2 분 5 분 2 분 2 배 세척 / PBS에 씻어 게시물 PBS에 0.1%도 함께 그것을 해결 하는 다음 씻어.</li>
	<li>품 5에 대해 두 번 웨이퍼 분/얼음 물에 스 2%의 1 방울에 부 화 원심 분리기 튜브에 웨이퍼를 삽입 하 고 원심 14100 x g에서 90 미 탑재 그것에 실시 하는 탄소 시멘트와 sem의 알루미늄 스텁.</li>
	<li>2 ~ 10의 레이어를 추가 전자를 사용 하 여 8 ° 회전 섀도잉 의해 샘플에 백 금/탄소 nm 빔 증발 장치 설정: 1.55 k v, 55 0.3 nm/s, 및 8 °, 회전 레벨 4의 각도에서 mA.</li>
</ol> 5. 스캐닝 전자 현미경 <ol><li>스캔 이미지 섹션 전자 microscope 1.5 k v, 2 mm 작업 거리와 렌즈 2 차 전자 검출기는 in.</li>
</ol> 6. 빛과 전자 현미경 이미지의 맞춤 <ol><li>오픈 두 종류의 이미지를 클릭 하 여 피지 18 &#34; 파일 | 오픈 &#34;. 클릭 하 여 캔버스 크기 조정 &#34; 이미지 | 조정 | 캔버스 크기 &#34;를 클릭 하 여 두 이미지 스택을를와 &#34; 이미지 | 스택 | 이미지 스택 &#34;. Tiff 파일 형식으로 스택에 저장.</li>
	<li>피지에서 클릭 하 여 새로운 TrackEM2 19 인터페이스를 열고 &#34; 파일 | 새로 만들기 | TrackEM2 (새로운) &#34;. 검은 창에 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 선택 하 여 두 이미지 스택 가져오기 &#34; 가져오기 스택 &#34;.</li>
	<li>맞춤 빛 현미경 이미지 랜드마크 이미지에 오른쪽 마우스 클릭을 사용 하 고 선택 하 여 수동으로 전자 현미경 이미지를 &#34; 정렬 | 랜드마크와 수동으로 레이어를 정렬 &#34;.
	랜드마크를 추가할 <ol><li>선택 선택 도구 (검은색 화살표). 참고로 핵의 형태를 사용 하 여 두 이미지 (보충 그림 1)에서 동일한 가장자리를 선택. (최소 3 포인트 선택 해야) 하는 몇 가지 포인트를 추가 합니다. 오른쪽 마우스를 클릭 하 고 선택 하 여 정렬 된 유사 모델 적용 &#34; 변환을 적용 | 관계 모델 &#34;.</li>
	</ol></li> <li>레이어 투명도 변경 (보충 그림 1 참조)는 정렬의 품질을 평가 하기 위해.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 방법은 결합 슈퍼 해결된 단백질 지역화 컨텍스트 정보는 세포 기관이에 단백질의 정확한 위치를 결정 합니다. 여기 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 처럼 다른 세포에 그것의 관계의 외부 막 또는 애벌레 zebrafish 망막에 포토 리셉터의 외부 세그먼트에 Tom20의 표현을 시각화 하는 실험의 완료 보여 줍니다.
Tokuyasu 곳을 알아내는-단면 잘 보존 된 섹션을 얻으려면 몇 가지 훈련이 필요 합니다. 그러나,이 방법은 시연된 성공21많은 실험실에서 고용입니다. 실리콘 웨이퍼는 섹션의 이전은 매우 간단 하 고 아무 특별 한 고려가 필요 하다. 이미지 버퍼에 글리세롤 사용 섹션의 건조를 피하기 위해 매우 중요 한 단계입니다. 최고 해상도 영상에 대 한 최상의 결과 얻을 수 있습니다 때 웨이퍼 페 트리 접시의 유리 바닥 매우 가깝습니다. 실리콘 줄무늬가이 위치에 웨이퍼를 유지 하는 데 도움이. 특별 한 주의 섹션의 손상을 방지 하기 위해 줄무늬를 제거 하는 동안 촬영 했다.
곳을 알아내는-섹션, 약 100의 두께 nm, Z 차원에서 광학 해상도 보다 얇은 또한 용이 하 게 상호이 방법의 정확도 슈퍼 해상도 현미경 신호가 얇은 층에서 오고 있다 고는 스캐닝 전자 현미경 신호는 샘플의 지형을 표시 합니다. 이 메서드는 멀티 컬러 이미징 또한 결합 수 있습니다. 그러나, 특별 한 주의 기울여야 합니다 샘플 같은 조건 (예: 이미지 버퍼) 몇 군데 수 및 크로스 토크를 방지 한다.
방법의 한 가지 한계는 그것의 2 차원 접근, 이후 직렬 섹션 (약 3 ~ 7 웨이퍼 당)의 제한 된 수만 수집할 수 있습니다. 따라서, 프로젝트 분석을 다루는 이상 하지 않을 것 이다. 그러나, 그것은 샘플의 간단한 단면에 의해 단백질 표정 모든 종류의 조직에서 검출에 적용 될 수 있는 방법입니다. 우리 같은 uranyl 아세테이트 또는 리드 시트르산 고전 조 영제의 사용 하지 않고 메서드를 제공합니다. 플래티넘 섀도잉 의해 대비 매우 유익한 지형 대조를 제공 하지만 경우에 따라 막 해결 하기 어려운. 이, 예를 들어 작은 소포에 있는 단백질의 식을 결정 하려면 프로젝트에 대 한 문제를 포즈 수 있습니다.
Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션에 따라 우리의 프로토콜 표준 장비를 사용 하 여 슈퍼 해상도 스캐닝 전자 현미경에서 상호 결과 얻을. 실리콘 웨이퍼에 대 한 섹션의 컬렉션 및 대비에 대 한 백 금을 사용 하 여 간단한 단계를 제공 하는 안정성과 재현성 샘플 준비에 있습니다.

단백질 및 세포의 다른 구획을 그들의 관계의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법 그들의 기능 및 가능한 상호 작용을 이해 하는 필수적인 도구는. 슈퍼 해상도 현미경 전자 현미경과 함께에서1등 정보 제공합니다. 바닥 상태 고갈 현미경 개별 분자 반환 (GSDIM)에 의해 다음 다양 한 유기와 유전으로 인코딩된 fluorophores2 와 호환 하는 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 이며 20 최대 가로 해상도 달성 한다 nm 3. 표준 회절 제한 현미경 보다 높은 해상도로 방법의 상관 관계4,,56의 정확도 향상 시킵니다. 단백질 표정 특정 subcellular 구획의 가장 좋은 상관 관계를 달성 하기 위하여 불확실성7 빛과 전자 현미경 검사 법에 대 한 동일한 ultrathin 섹션의 사용의 볼륨을 줄일 것이 좋습니다. 다른 단면 방법 중에서 Tokuyasu 곳을 알아내는-섹션 프로토콜 탈수 또는 수 지 포함 필요 하지 않습니다 또한, 많은 epitopes의 antigenicity 보존 그리고, 좋은 조직 열 대권 외의8을 제공 합니다. 여러 가지 방법을 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인)4,5,,910에서이 섹션의 적용을 설명 했다.
Zebrafish 망막 시각적 개발 및 척추에 걸쳐 매우 보존된 구조와 기능을 부여 하는 인간 질병 메커니즘 연구에 귀중 한 모델입니다. 특히, 망막 대뇌 디스플레이 포유류 대뇌, 기저 냅, apico-basally 길쭉한 핵과와 동일한 아키텍처 멤브레인의 구성 더 꼭대기 내부 세그먼트 외부 세그먼트에서 미토 콘 드리 아의 클러스터링 가장 꼭대기 위치11디스크. 다양 한 세포질 구획에 단백질 지역화는 제 브라 사이 보존 하 고 인간, 인간 질병 관련 단백질12,13의 생물학 기능의 조사를 허용 합니다.
여기 선물이 애벌레 zebrafish 상호 슈퍼 해상도 빛과 전자 현미경에 의해 미토 콘 드리 아 외부 막 단백질 Tom20의 지역화를 해결 하기 위해 망막 샘플을 준비 하는 프로토콜. 방법은 실리콘 웨이퍼에 수집 하는 곳을 알아내는-섹션에 기반 하 고 금의 얇은 층의 적용 후 생산 대비 지형 정보 취득. 이 단계는 사용, 재현성, 및 실험을 완료 하는 시간의 용이성 측면에서 분명 기술 개선. 우리는 최근에 마우스 조직14핵 숨 구멍 및 미토 콘 드리 아 단백질을 검출 하기 위하여 방법의 적용을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 EM 등급</td><td>EMS, USA#</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>카코딜레이트</td><td>머크</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마-알드리치</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>아가로스, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>플랫 임베딩 몰드</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>지역 식품 브랜드 젤라틴</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 B형</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Si-Mat 실리콘 재료</td><td></td><td>유형: P/붕소; 방향 < 111> 켜기; 성장 방법: CZ; 저항력: 1-30 옴/cm; 표면 : 광택; 레이저 컷 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>유선 루프 "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 스트라이프</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr> 포도당 산화<tr><td>효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>베타-메르캅토에틸아민 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>안티-톰20</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, 스위스</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 페트리 접시</td><td>Ibidi, 독일</td><td>u-Dish 35mm, 높은 유리 바닥, #81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM 알루미늄 스텁</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>전도성 탄소 시멘트 Leit-C</td><td>Plano, 독일</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF 대물렌즈</td>, <td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>, <td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - ZEISS Auriga 40</td>, <td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

우리는 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법을 조합 하 고 스캐닝 전자 현미경 애벌레 zebrafish 망막에 단백질 subcellular 지 방화를 조사 하는 방법을 제시. 슈퍼 해상도 가벼운 현미경의 하위 회절 한계 해상도 기능 상관된 데이터의 정확도 향상 수 있습니다. 간단히, 110 나노미터 두꺼운 곳을 알아내는-섹션 실리콘 웨이퍼에 전송 되 고, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경에 의해 몇 군데는 면역 형광 염색 법, 후. 그 후, 섹션 스와 백 금 영상 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 이전 그림자에 보존 됩니다. 이러한 두 현미경 형식에서 이미지 쉽게 오픈 소스 소프트웨어 조직 랜드마크를 사용 하 여 병합 됩니다. 여기는 애벌레 zebrafish 망막에 대 한 적응된 방법에 설명합니다. 그러나,이 방법은 또한 조직 및 생물의 다른 종류에 적용 됩니다. 이 상관 관계에 의해 얻은 보완 정보는 세포 막과 관계 있는 미토 콘 드리 아 단백질의 표현과 cristae 미토 콘 드리 아 뿐만 아니라 셀의 다른 구획으로의 해결할 수 설명 합니다.

Tom20, translocase 미토 콘 드리 아 외 막 복잡 한20, 소 단위 단백질의 표현, 애벌레 zebrafish 망막의 얇은 단면도에서 의해 결정 되었다 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1) 하 고이 정보는 동일한 섹션의 플래티넘 숨기기 후 전자 현미경을 스캐닝 하 여 얻은 지형 신호를 구비. 이러한 상호 데이터 연관 특정 구획, 외부 미토 콘 드리 아 막에 있는 단백질의 지 방화를 확인 하 고, 또한 셀의 다른 세포와 단백질의 관계에 대 한 정보를 제공.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
그림 1: 클레 멘 타인 zebrafish 망막에. A. 낮은 배율 widefield 이미지 부분의 5 dpf zebrafish 망막, 핵 DAPI (녹청)으로 물. B. 동일한 영역의 전자 현미경 스캐닝. C. B. 핵에 프레임의 높은 배율 widefield 이미지 DAPI (녹청)로 얼룩진 고 빨간색으로 나타납니다 Tom20 미토 콘 드 리아 얼룩. 높은 배율에서 같은 섹션의 D. Widefield 이미지. Tom20 식의 미토 콘 드리 아의 클러스터에서입니다. 중 식의 Tom20 (빨간 점) GSDIM 현미경 검사 법에 의해 감지. 핵은 DAPI (녹청)과 스테인드. F. 전자 상호 슈퍼 해상도 결합 하 고 스캐닝 전자 현미경 검사 법으로 동일한 섹션. Tom20 얼룩 (붉은 점) 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막에서 미토 콘 드리 아 클러스터 (M)에 나타납니다. SEM 이미지의 지형과 형광 DAPI 신호 핵 (N)에 해당합니다. G. f.에 프레임의 고배율 이미지 스캐닝 전자 현미경 이미지 GSDIM 이미지 (빨간 점)에 컨텍스트를 제공합니다. 미토 콘 드 리아 cristae 명확 하 게 볼 수 있으며 미토 콘 드리 아의 바깥쪽 막 지역화 Tom20 얼룩. 외부 세그먼트의 막을 대뇌 (OS) 명확 하 게 해결 됩니다. 이미지 픽셀 크기 5 nm 스케일 바: A, B, 및 c: 10 µ m; D: 2 µ m; E와 f: 1 µ m와 g: 0.2 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 빛과 전자 현미경 이미지의 정렬. A. SEM 이미지와 번호가 랜드마크 다른 핵을 따라 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 화면. B. 형광 이미지와 다른 DAPI 따라 번호 랜드마크 (노란색)와 TrackEM2 인터페이스에서 스크린샷 스테인드 핵. 레이어 투명도 변경 하려면 메뉴의 왼쪽된 상단 부분에 슬라이더를 사용할 수 있습니다. 눈금 막대: 1 µ m입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

이 현미경 검사 방법의 전반적인 목표는 초해상도 및 주사 전자 현미경 이미지를 상관시켜 유충 제브라피시 망막의 다양한 세포 내 소기관과 관련하여 단백질 발현을 정확하게 국소화하는 것입니다. 이 방법은 돌연변이의 단백질 오국소화 연구와 같은 망막 발달 및 세포 경로 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초해상도와 주사 전자 현미경을 결합하여 샘플의 구조적 맥락 내에서 매우 정확한 단백질 국소화 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다.실리콘 웨이퍼에 Tokuyasu 단면을 수집하면 취급이 상당히 용이하며 대비를 위해 백금 음영을 사용하면 샘플의 좋은 지형을 얻을 수 있습니다. 따라서 이 방법은 유충 제브라피시 망막 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것의 주요 이점 중 하나는 마우스 조직에서 단백질 발현 식별과 같은 다른 많은 생물학적 시스템에도 적용할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 고정된 제브라피시 유충에서 눈을 해부한 후 PBS에 15%의 현지 식품 브랜드 젤라틴 12ml를 섭씨 40도에서 워밍업합니다. 그런 다음 눈관에서 PBS를 흡인하고 젤라틴 용액을 첨가합니다. 젤라틴이 샘플에 침투하도록 튜브를 부드럽게 두드리고 섭씨 40도에서 10-30분 동안 온도 블록에서 부드럽게 흔들어 주거나 수조에서 배양합니다.섭씨 40도의 수조에서 12 x 5 x 3mm 실리콘 또는 폴리에틸렌 플랫 임베딩 몰드를 따뜻한 젤라틴으로 채웁니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 금형당 두 개의 눈을 추가하고 쌍안경 아래에 해부 바늘을 사용하여 적절하게 정렬합니다. 젤라틴을 실온에서 1분 동안 식힌 후 섭씨 4도에서 20분 동안 굳힙니다.쌍안경 아래에서 면도날을 사용하여 젤라틴 블록을 블록당 하나의 눈에 맞게 다시 다듬습니다. 젤라틴이 삽입된 눈을 얼음 위의 PBS에서 2.3 어금니 자당으로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.그런 다음 샘플을 새로운 2.3 몰 자당 용액으로 교환합니다. 그리고 조직을 섭씨 4도 또는 영하 20도에서 보관하여 최대 몇 개월까지 보관할 수 있습니다. 젤라틴 블록을 크라이오 핀으로 옮기기 전에 거의 눈 크기로 다시 다듬습니다.그런 다음 블록을 액체 질소로 동결하고 초저온 초박 절편기로 옮깁니다. 초저온 초박 절편기에 다이아몬드 나이프를 사용하여 섭씨 영하 120도에서 110나노미터 두께의 절편을 자릅니다. 2% 메틸셀룰로오스 방울과 2.3몰 자당 용액을 포함하는 유선 루프가 있는 단면을 선택합니다.그런 다음 섹션을 7 x 7mm 실리콘 웨이퍼로 옮깁니다. 웨이퍼를 세척하려면 4방울을 피펫으로 분사하고 웨이퍼를 방울 위에 거꾸로 놓습니다. 20분 동안 섭씨 0도에서 방울의 웨이퍼를 배양합니다.그런 다음 웨이퍼를 PBS에서 실온에서 각각 2분씩 두 번 세척합니다. PBS의 0.15%글리신에서 샘플을 각각 1분 동안 3회 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세척당 1분 동안 샘플을 세 번 세척합니다.PBG로 조직을 5분 동안 사전 배양합니다. 다음으로 PBG의 rabbit anti-Tom20을 섹션에 추가합니다. 그리고 웨이퍼를 실온에서 30분 동안 배양합니다.PBG를 사용하면 세척할 때마다 1분 동안 티슈를 6번 세척합니다. 그런 다음 PBG로 샘플을 실온에서 5분 동안 사전 배양합니다. PBG에서 PBG를 Alexa 647 anti-rabbit 2가 Fab fragments로 교체하고 30분 동안 배양합니다.세척할 때마다 1분 동안 PBG로 샘플을 6번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 웨이퍼를 2분 동안 세 번 세척합니다. 웨이퍼에 DAPI 및 PBS를 추가하고 10초 동안 배양합니다.그런 다음 PBS를 사용하여 각각 2분씩 두 번 샘플을 세척합니다. 웨이퍼를 80% 글리세롤의 일대일 용액과 산소 제거 시스템이 포함된 이미징 버퍼의 한 방울에 놓고 잠시 배양합니다. 웨이퍼 쪽이 아래를 향하게 하여 80% 글리세롤과 이미징 버퍼의 일대일 혼합물을 유리 바닥 페트리 접시에 새로 떨어뜨립니다.모든 면에서 피펫을 사용하여 웨이퍼 아래에 있는 대부분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 실리콘 줄무늬를 사용하여 웨이퍼를 페트리 접시 바닥에 고정합니다. 장착된 섹션을 높은 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 도립 현미경에 놓습니다.이미징하기 전에 측면 및 축 방향 드리프트를 최소화하거나 줄이기 위해 샘플을 현미경 온도와 평형을 이루도록 합니다. 관심 영역을 중앙에 배치하고 광시야 epifluorescence 참조 이미지를 획득합니다. 초해상도 작동 모드로 변경합니다.카메라의 노출 시간을 15밀리초로 조정하고 전자 곱셈 이득을 최대값 300으로 설정합니다. 다음으로, 최대 레이저 출력에서 642 나노미터 레이저로 에피형광 모드에서 샘플을 조명합니다. 각 프레임에서 단일 분자 깜박임이 잘 분리되어 개별 신호가 겹칠 확률이 낮아지면 레이저 출력을 거의 1/3로 줄입니다.epifluorescence에 있는 익지않는 이미지를 30, 000의 구조의 최소한을 취득해서 기록하십시오. 원시 데이터의 Tools(도구)에서 t-Series Analysis(t-시리즈 분석)는 30 광자의 검출 임계값을 사용합니다. Evaluate(평가)를 클릭하여 현지화 이벤트 목록을 생성합니다.Tools의 Eventlist Processing 패널에서 Create Image를 클릭하여 4나노미터의 렌더링 픽셀 크기를 적용하여 가우스 피팅에 의한 초고해상도 이미지를 시각화합니다. 실리콘 줄무늬를 제거하고 웨이퍼 가장자리 가까이에 PBS 한 방울을 추가하여 페트리 접시에서 들어 올립니다. PBS를 사용하여 웨이퍼를 각각 2분씩 두 번 세척한 후 PBS에 0.1%글루타르알데히드를 사용하여 5분 동안 후수정하십시오.그런 다음 PBS에서 세척할 때마다 2분 동안 샘플을 다시 두 번 세척합니다. 얼음 위의 물에 2% 메틸셀룰로오스 한 방울을 떨어뜨려 웨이퍼를 배양당 5분 동안 두 번 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 원심 분리기 튜브에 삽입하고 14, 100 회 g에서 90 초 동안 원심 분리하십시오.스핀 후 전도성 탄소 시멘트를 사용하여 SEM 알루미늄 스터브에 웨이퍼를 장착합니다. 전자빔 증착 장치를 사용하여 다음 설정으로 회전 음영을 통해 샘플에 2-10나노미터의 백금 탄소 층을 추가합니다. 1.5kV, 2mm 작동 거리의 주사 전자 현미경 및 렌즈 내 2차 전자 검출기를 사용한 이미지 섹션.Fiji를 사용하여 파일, 열기를 클릭하여 광 및 전자 현미경 이미지를 모두 엽니다. Image(이미지), Adjust(조정), Canvas Size(캔버스 크기)를 클릭하여 캔버스 크기를 조정합니다. 그런 다음 이미지(Image), 스택(Stacks), 이미지를 스택할 이미지(Images to Stack)를 클릭하여 두 이미지를 모두 스택으로 가져옵니다.피지에서 파일, 새로 만들기, EM2 새로 만들기를 클릭하여 새 트랙 EM2 인터페이스를 엽니다. 검은색 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Import stack을 선택하여 두 이미지가 모두 포함된 스택을 가져옵니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Align, Align layer manually with landmarks를 선택하여 광학 현미경 이미지를 랜드마크가 있는 전자 현미경 이미지에 수동으로 정렬합니다.선택 도구를 선택하여 랜드마크를 추가합니다. 핵의 모양을 참조로 사용하여 두 이미지에서 동일한 가장자리를 선택하고 여러 점을 추가합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 아핀 모델로 정렬을 적용하고 Apply transform, Affine Model을 선택합니다.마지막으로 도면층 투명도를 변경하여 정렬의 품질을 평가합니다. 이 패널은 수정 후 5일간의 제브라피시 망막 절편의 저배율 광시야 이미지를 보여줍니다. 동일한 영역이 주사 전자 현미경으로 여기에 표시됩니다.이 고배율 이미지는 Tom20이 미토콘드리아에서 클러스터와 함께 빨간색으로 염색된 것을 보여줍니다. Tom20의 발현은 GSDIM 현미경으로 감지된 바와 같습니다. 이 이미지에서 동일한 섹션은 상관 초해상도와 주사 전자 현미경을 결합합니다.Tom20 염색은 미토콘드리아의 외막에 있는 미토콘드리아 클러스터 내에서 나타납니다. 핵의 형광 DAPI 신호는 SEM 이미지의 지형과 일치합니다. 이 SEM 이미지는 GSDIM 이미지의 Tom20 염색에 대한 컨텍스트를 제공합니다.미토콘드리아 크리스테(Mitochondrial cristae)가 명확하게 보이며, Tom20 염색은 미토콘드리아의 외막에 국한되어 있습니다. 광 수용체의 바깥쪽 세그먼트의 막은 명확하게 분해되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 라벨링 및 이미징 매개변수를 최대한 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.최적으로 라벨링된 샘플만이 초고해상도에 적합합니다. 샘플은 라벨링 절차 중 어떤 경우에도 건조되어서는 안 됩니다. 이 절차는 면역형광을 이중 표지하는 것으로 확장될 수 있으며, 따라서 특정 구조 내에서 두 개의 서로 다른 단백질을 국소화할 수 있습니다.더 복잡한 샘플의 경우, 이미지의 정확한 정렬을 얻기 위해 기준 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초고해상도 정밀도로 복잡한 조직 샘플에서 세포의 서로 다른 소기관과 관련하여 단백질을 국소화하기 위한 상관 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

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제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

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제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

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Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

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