Name: 실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 LCG 소프트웨어를 사용한 피질 신경원의 동적 클램프 기법으로, 쥐 체감각 피질 슬라이스에서 패치 클램프 기록을 수행하고 자동 전기생리학 프로토콜을 적용하여 시냅스 사건을 시뮬레이션합니다.

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플랑드르 연구 재단 FWO(계약 번호 12C9112N to DL), 유럽연합 집행위원회의 제7차 프레임워크 프로그램(Marie Curie Network "C7", 계약 번호 238214; ICT 미래 신흥 기술 "계몽" 프로젝트, 계약 번호 306502), 벨기에 과학 정책 사무소에서 시작한 대학 간 유치 폴란드 프로그램(계약 번호 IUAP-VII/20) 및 앤트워프 대학교에 감사드립니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 추천 앤트워프 대학의 생명 과학학과의 윤리위원회의 가이드 라인을 준수합니다. 이 프로토콜은 승인 인도적 안락사 기술에 의해 수득 청소년의 Wistar 쥐의 뇌 외식로부터 비 감지 물질의 제조를 필요로한다. 1. 장비 준비 <ol><li> 설치 및 데이터 수집 및 자극 시스템을 구성. <ol><li> 신호를 기록 및 전기 생리 학적 증폭기에 아날로그 제어 전압을 보낼 Comedi 지원 데이터 획득 (DAQ) 카드를 장착 한 퍼스널 컴퓨터 (PC)를 사용한다. 참고 : 자세한 내용은 http://www.comedi.org를 방문하십시오 Comedi 가장 일반적인 제조업체의 DAQ 카드의 다수를 지원하는 리눅스 모듈과 라이브러리입니다. </li><li> 컴퓨터 제어 패치 클램프 증폭기가 사용중인 경우, 상기 증폭기에 전용 한 외에 초 PC를 채용제어 할 수 있습니다. 주 : 후자는 통상적 인 운영 체제를 실행할 수 있지만, 별도의 PC는 특별한 운영 시스템을 이용하여 실시간으로 작동 될 것이다. 전용 PC에 원격 데스크톱 애플리케이션에 의해 연결하는 동안 이러한 조건 하에서는, 여분의 PC에 연결된 단일 모니터, 마우스 및 키보드를 사용하는 것이 편리하다. </li><li> http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso에서 LCG와 실시간 리눅스 운영 체제를 포함하는 라이브 CD의 ISO 이미지를 사전 설치 다운로드하여 빈 CD 또는 USB 스틱 &quot;에 구워서 . </li><li> 단순히 DAQ 카드를 포함하는 PC의 드라이브에 CD를 삽입하고 시작합니다. 또는 Linux 운영 체제 (예를 들어, 데비안이나 우분투)를 실행하는 PC에서 온라인 소스 저장소에서 LCG를 설치합니다. 설치 절차에 대한 자세한 내용은 온라인 설명서를 참조하십시오. 매뉴얼은 http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf에서 온라인으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 라이브 CD로 부팅 : 생S 자동으로 완벽하게 구성된 시스템을로드합니다. 이를 위해, 컴퓨터 CD-ROM ​​드라이브에 LCG 라이브 CD를 넣고 CD로부터 컴퓨터를 부팅; 부팅 메뉴가 나타나면 즉시 실시간 커널 (기본 옵션)을 선택하고 시스템이 초기화 될 때까지 기다립니다. </li><li> 명령 프롬프트에 입력하여 DAQ 카드를 보정 : sudo는 comedi_calibrate 또는 sudo는 comedi_soft_calibrate 데이터 수집 보드는 각각의 하드웨어 또는 소프트웨어 교정, (기판에 대한 정보를 획득하기 위해 명령 sudo는 comedi_board_info를 사용)를 지원하는지 여부에 따라. </li><li> 적절한 아날로그 - 디지털 및 디지털 - 아날로그 변환 계수를 설정 이것은 셀룰러 전기 생리 학적 증폭기의 사용 설명서를 갖는 액세스를 필요로하며, 특히 그 변환 계수에 미치는 사양. </li><li> 환경 변수, 파일 /home/user/.lcg-env에 해당하는 숫자 값을 지정하는 텍스트 편집기를 사용하여 AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. 주 : 이러한 증폭기에 의해 생성 된 입력 (AI) 및 전류 클램프 (CC)와 전압 클램프 (VC) 모드에 대한 출력 (AO) 이득, 및 컴퓨터에 의해 제공되는 전압 명령 및 전류 또는 전압 간의 변환 인자를 대표 각각. </li><li> 선택적으로, 자신의 시스템의 변환 계수를 찾는 (LCG 찾기 컨버전 팩터)가 제공 LCG 스크립트를 사용한다. 참고에 의해 계산 된 값 LCG 찾기 컨버전 팩터는 일부 경우에 절단 된 수치 일 필요 또는 변환 계수의 정확한 값을 반영하도록 반올림 추측이다. </li><li> 사용하려면, LCG을-변환 요인을 찾아 종종 해당 headstage에 앰프 구입 &#39;모델 세포&#39;를 연결하여 시작합니다. 그런 다음, 라이브 CD를 실행하고 쉘 프롬프트에서 다음 명령을 입력하는 리눅스 시스템의 터미널을 엽니 다 LCg을 찾기 변환 요인을 -i의 $ HOME / .lcg-ENV -o $ 홈 / .lcg-ENV 참고 : 두 경우 모두 (즉, 수동 /home/user/.lcg-env 또는 LCG 찾기 변환 요인의 사용 수정), 가까이는 변경 사항을 적용하기 위해 터미널을 엽니 다. </li><li> 여러 headstages 사용하는 경우, 모든 채널에 동일한 값으로 환산 계수를 설정; 가능하지 않은 경우,보다 사용자의 요구에 맞게 구성 파일을 생성하기 위해 LCG 자극치 얼마나 여러 환산 계수를 사용하는 방법을 이해하기 위해 LCG 온라인 매뉴얼을 참조. </li></ol></li></ol> 체성 감각 피질에서 급성 뇌 조각 2. 준비 <ol><li> 전기 생리학을위한 솔루션의 준비. <ol><li> (125)의 NaCl, 2.5의 KCl (mm 단위)을 혼합하여 인공 세리 - 척수 (ACSF)를 준비 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를, 25 포도당, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2. 을 줄이기 위해 10 배 재고 솔루션을 준비실험 당일 준비 시간. 한 조각의 제조 및 다른 기록에 사용되는 어느 2 L를 준비한다. </li><li> 절차의 시작에 앞서 적어도 30 분 동안 95 % O 2 및 5 % CO 2 ACSF 적신. </li><li> 현재 클램프 녹음을 위해, (mm 단위)를 포함하는 세포 내 솔루션 (ICS)를 사용하여 115 K-글루코 네이트, (20)의 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-㎎, 0.3 나 2 -GTP, 10 2 -phosphocreatine 나. 얼음 용액을 준비하고 피펫 막힘의 위험을 제거하기 위해 녹화의 시작에 앞서이를 필터링. </li></ol></li><li> 뇌 추출. <ol><li> 4 % 이소 플루 란 유도 챔버에 동물을 배치 동물을 마취하고 신속 단두대 또는 대형 가위를 사용하여 참살. </li><li> 중간 선을 따라 피부를 잘라 그것은 귀에 밀어 넣습니다. </li><li> 가위의 벌금 쌍을 사용하여 중간 선을 따라 두개골을 잘라. 토륨 최대한 가까운 블레이드 유지E면은 하부 뇌 손상을 최소화하기 위해. , 핀셋 한 쌍의 두개골을 열고 시신경과 뇌간을 절단하고 부드럽게 얼음처럼 차가운 ACSF의 뇌를 드롭 주걱을 사용합니다. </li><li> 소뇌와 메스 (블레이드 24)와 두 개의 반구를 분리합니다. </li><li> 두 반구 중 하나에서 여분의 물을 제거하고 superglue 한 방울을 사용하여 경사 플랫폼에 접착제. 빨리 뇌 위에 ACSF 몇 방울을 추가하고 vibratome 챔버로 옮긴다. 주 : 시상 조각을 제조 할 때, 플랫폼의 각도 슬라이싱 절차 중에 피라미드 세포의 돌기의 손상을 방지하는 것이 중요하다. </li></ol></li><li> 조각의 준비. <ol><li> 뇌를 통해 블레이드를 배치 및 제 2.5 폐기 - 3mm를. 반면 슬라이싱 절차에 필요한 시간을 최소화하는 동시에 조각의 표면에 대한 손상을 제한하는 속도 및 주파수를 조정한다. </li><li> 300 μ 두께로 설정M과 슬라이스를 시작합니다. 날이 피질을지나 간 후, 면도날 또는 해마 이상 관심의 대뇌 피질 영역의 가장자리에서 절단 할 수있는 구부러진 바늘을 사용합니다. </li><li> 34 ° C - 멀티 웰 배양 챔버에서 슬라이스 (32)에서 유지 놓는다. </li><li> 블레이드를 후퇴 5 점까지 2.3.2과 2.3.3를 반복 - 8 조각이 절단된다. 가장 일반적으로 슬라이스 혈관 표면에 평행 한 것들이다. </li><li> 마지막 슬라이스 챔버에 배치 된 후 30 분 동안 인큐베이션 슬라이스. </li></ol></li></ol> 레이어 5 피라미드 뉴런 3. 패치 클램프 녹음 <ol><li> 녹화 실에서 조각을 놓고 건강한 세포를 검색합니다. 이 세포는 일반적으로 낮은 반면, 매끄러운 외관이 부어 없습니다. </li><li> 뇌의 표면에서 약 600 μm의 1,000에 위치하고, 40X 배율 렌즈와 현미경 슬라이스를 검사하고 층 (5)에서 세포를 검색합니다. </li&gt; <li> 적절한 세포가 발견되면, ICS와 마이크로 피펫의 부하 삼분하고 headstage에 넣습니다. </li><li> 라이브 CD 또는 사전 구성된 리눅스 운영 체제를 실행하는 개인용 컴퓨터에서 명령 쉘 (예를 들어, bash는)이 실행되고 프롬프트에서 명령 LCG 제로. 이것은 DAQ 보드 증폭기를 구동되지 않는 것을 보장한다. </li><li> (30) 적용 - 현미경의 도움으로, 피펫 홀더에 튜브에 의해 연결되어있는 일반적인 주사기의 피스톤을 눌러 긍정적 인 압력의 50 밀리바을, 슬라이스 위의 피펫을 약 100 ㎛를 놓습니다. 참고 : 바람직하게는 미세 조작기의 접근 모드를 사용하여, 표적 세포에 직접 경로를 할 수있는 위치에 피펫을 놓습니다. </li><li> 컨트롤에 전기 생리학 증폭기 연기, 오프셋 피펫 및 출력 전압 클램프 모드에서 테스트 펄스 (10 MV)를 조정한다. </li><li> 철수 30 밀리바 (피펫의 크기에 따라) - (10)에 압력을 감소주사기의 피스톤; 부드럽게 세포 접근과 비디오 카메라 모니터에 화상을 관찰함으로써 딤플의 형성을 확인. 항상 저항의 증가에 대한 테스트 펄스 모니터, 전기 생리학 증폭기에 연결된 오실로스코프에 표시 전류 파형을 보면서 (또는 당신 피펫 저항을 모니터링하는 명령 LCG 밀봉 테스트를 사용할 수있다). </li><li> 압력을 해제하고 피펫 저항의 증가 및 셀에 &quot;딤플&quot;의 형성을 확인할 때 필요하다면 밀봉 형성을 돕기 위해 부드럽게 피펫에 부압을 적용한다. </li><li> 씰 형태이지만, 점차 MV를 -70 유지 가능성을 줄입니다. </li><li> 30 pA를 - 기가 옴 밀봉을 얻을되면, 홀딩 전류가 0 사이에 있는지 확인하십시오. 멤브레인을 깰 전체 셀 구성을 설정하는 부압 (흡입)의 짧은 펄스를 적용합니다. 또는, (전압의 강하고 짧은 펄스를 삽입 할 수 <em&gt; 즉, 사용 준비 및 유리 피펫에 따라 막을 파열) 증폭기에 &#39;ZAP&#39;명령을 사용하거나 매우 부정적 셀에서 유지. </li><li> 현재 클램프 모드로 전환하고 휴식 막 잠재력이 건강한 세포의 전형적인 있는지 확인합니다. 글루 콘산 칼륨 계 용액을 사용하여 피라미드 피질 뉴런의 경우,이 값은 일반적으로 사이 -65 -75 MV이다. </li></ol> 신경 세포의 전기 응답 특성의 4. 반자동 특성 <ol><li> 사용자의 데이터를 저장할 디렉토리를 작성하십시오. 스크립트가 날짜를 기준으로 폴더를 생성 라이브 LCG CD에 포함이 고용을하기 위해. 명령 프롬프트에서 그것을 사용하려면 CD ~ / 실험 LCG가 작성-실험 폴더는 PSP, in_vivo_like을 -s 이것은 그 셀에 대한 데이터가 저장 될 폴더 (및 하위 폴더 &#39;in_vivo_like&#39; &#39;PSP&#39;등) 생성하고이 단말기에 자사의 이름을 인쇄합니다창문; 그러한 피펫 저항이 스크립트를 사용하는 세포의 종류에 따라 추가 정보를 저장하는 것도 가능하다. </li><li> 명령을 사용하여 새로 만든 폴더로 디렉토리를 변경 CD ~ / &lt;폴더 이름&gt; 폴더 이름은 20140331A01에서와 같이 명령의 LCG-- 실험 - 폴더를 생성하고 현재 날짜의 타임 스탬프를해야합니다 (즉, 년 - 월 - 일)에 의해 표시되는 것입니다. </li><li> 증폭기는 클램프 전류 모드로 동작하도록 설정되어 케이블이 연결되고, 상기 증폭기의 외부 전압 명령이 존재하는 경우, 활성화되어 있는지 확인. </li><li> 명령 LCG-ecodeat에게 명령 프롬프트를 입력합니다. 이 셀의 기본 응답 특성을 특성화하는 데 사용되는 일련의 명령 (즉 LCG-AP, LCG-VI, LCG-램프, LCG 타우와 LCG-단계)를 호출합니다. LCG-ecode는 사용자가 두 개의 매개 변수를 지정하는 것이 필요하다 : 단일 셀에서 스파이크를 유발하기 위해 사용되는 전류의 MS-1 긴 펄스의 진폭 및 RAM 전류의 최대 진폭을P는 rheobase을 찾는 셀에 주입. 다음 명령 구문을 사용합니다 : LCG-ecode --pulse 진폭 X --ramp 진폭 Y 각각 한 MS-긴 펄스 전류의 지속적인 주입에 응답하여 셀 불을하기에 충분한 값 X와 (PA)에서의 Y와 선택. 주 :이 프로토콜은 전극 활성 보정 (AEC) (15)를 사용하기 위해 &#39;전극 커널&#39;의 수치 추정을 수행 필요. 노이즈 전류 주입은 커널을 추정하는데 사용되며, 사용자는 커널을 이루는 샘플 개수를 확인하는 메시지가 표시된다. 전극 커널의 의미와 방법 커널 샘플의 수를 선택하는 방법에 대한 자세한 정보는 15을 참조하십시오. </li></ol> 시뮬레이션 시냅스 및 생체 -like 배경 작업의 시뮬레이션을 통해 컨덕턴스 5. 주입 <ol><li> 시뮬레이션 흥분성 시냅스 후 전위의 주입 <ol><li>당신은 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 다음 실험을 절약 할 디렉토리로 변경 CD의 PSP / 01 </li><li> 현재 디렉토리에 LCG 구성 파일을 복사하고 (이 예제 구성 파일이 소스 코드와 라이브 CD에 포함되어 있습니다) 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 (이 예에서는 나노) 텍스트 편집기에서 엽니 다 : CP ~ / 지역 / SRC / LCG / 구성 / epsp.xml 나노 epsp.xml 주 :이 단순히 서로 연결 다른 기관과 텍스트 파일이다. 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하십시오. </li><li> 필요한 편집 inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor이 파일의 outputConversionFactor는 사용자의 설정과 일치하도록합니다. </li><li> COM을 실행하여 &#39;단일 전극 동적 클램프를 수행하기 위해 LCG에 의해 사용 된 방법&#39;전극 활성 보정을 수행하기 위해 필요한 전극 커널을 계산MAND LCG 커널 이 커널에서 점의 수를 입력하라는 메시지가 표시됩니다. 전극 커널 지수 감쇠 꼬리의 끝 부분을 덮도록 다시 번호를 선택한다. </li><li> 명령을 사용하여 동적 클램프 실험을 수행 -c epsp.xml을 LCG는-실험 </li><li> 파일리스트 및 명령을 사용하여 결과를 시각화 LS -l 마지막 -f LCG-플롯 파일 </li></ol></li><li> 시뮬레이션 억제 시냅스 후 전위의 주입 <ol><li> 폴더를 생성하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여에 epsp.xml 파일을 복사 : MKDIR ../02 CP epsp.xml ../02/ipsp.xml CD ../02 </li><li> 텍스트 편집기를 이용하여 구성 파일을 편집 반전 시냅스 전위를 변경하고 다음에 모델 시냅스 Exp2Synapse 상수의 상승 및 감쇠 시간 : 매개 변수&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;tauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10E-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;매개 변수&gt; 텍스트 편집기를 종료합니다. </li><li> 전극 커널을 계산하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 5.1에서와 같이 실험을 수행 : LCG 커널 -c ipsp.xml을 LCG는-실험 </li><li> 파일을 나열하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 그 결과를 시각화 : LS -l LCG-플롯 파일 -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> 생체 -like 배경 활성의 시뮬레이션 : <ol><li> 이전 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 그림과 같이, 다음과 같은 실험을 저장할 디렉토리로 변경 CD ../../in_vivo_like/01 </li><li> LCG 소스 디렉토리에서, 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 구성 파일을 복사합니다 CP ~ / 지역 / SRC / LCG / 구성 / in_vivo_like.xml 나노 in_vivo_like.xml <li> 5.1.3에 기술 된 바와 같이, 사용자의 설정에 DAQ 구성 매개 변수를 조정하고 편집기를 종료합니다. </li><li> 전극 커널을 계산하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 5.1에서와 같이 실험을 수행 : LCG 커널 10 -i 3 -n -c in_vivo_like.xml을 LCG는-실험 -N &#39;10&#39;및 &#39;-i 3&#39;스위치 자극 세 초 간격으로 10 회 반복되어야한다는 것을 나타낸다. </li><li> 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 사용하여 원시 흔적을 시각화 : LCG-플롯 파일 -f 모든 </li></ol></li></ol>

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이 텍스트 실시간 구현에 대한 전체 프로토콜에서, 폐쇄 루프 단일 세포 전기 생리 실험은 패치 클램프 기술과 LCG라는 최근에 개발 된 소프트웨어 도구를 사용하여, 기술되었다. 레코딩의 품질을 최적화하기 위해 그 녹화 설정이 적절하게 접지 된 프리 실드 진동 인 것이 중요하다 :이 셀, 안정적이고 지속적인 전체 세포 접근을 보장 함께 자극 프로토콜의 전체 부분을 자동화 가능성있는 실험의 처리량을 극대화 할 수 있습니다. LCG가 제시되어 적용될 수있는 두 가지 경우, 즉 신경 세포의 활성의 입력 - 출력 관계의 빠른 계산을 포함하여 전기 생리 학적 특성 (도 1)의 측면에서 전지의 특성 및 생체 -like의 레크리에이션 뇌 슬라이스 활동 (그림 2). SUCH 응용 프로그램은 어떻게 서로 다른 프로토콜을 구성하는 방법 보여 LCG의 가장 눈에 띄는 기능 중 일부를 강조 : 그 명령 줄 인터페이스 프로...

<html> 최근, 셀룰러 전기 생리학 현대 폐쇄 루프 프로토콜 전압 및 전류 클램프 실험에 이용 전통적인 개방 루프 패러다임에서 진화했다. 가장 잘 알려진 폐 루프 기술은 아마도 신경 세포막 전압 (8)를 결정하기 위해 인공 전압 관문 이온 채널의 합성 주입 활성화 동적 클램프 6,7이며, 비 결정적가 플리커 효과 심층 연구 이온 신경 응답 역학 9 채널뿐만 아니라, 시냅스 백그라운드 작업 (10)와 같은 vivo-에서 실제의 체외에서 휴양. 제안 된 다른 폐쇄 루프 패러다임은 세포 메커니즘을 기본 신경 흥분을 조사하기 위해, 4,12 클램프 반응 클램프 (11), 생체 자기 유지 지속적인 활동의 세대에서 공부하고, 응답을 포함한다. &quot;ontent&gt; 다음은 급성 뇌 조각 수행 전체 셀 패치 클램프 기록의 맥락에서 폐 루프 전기 생리 다양한 프로토콜을 적용 할 수있는 강력한 구조를 설명한다. 우리는 패치 클램프 기록을 이용하여 체세포 멤브레인 전압을 기록하는 방법을 보여 청소년 쥐의 체 감각 피질과에서 피라미드 뉴런에 LCG, 이론적 신경 생물학 및 Neuroengineering의 실험실에서 개발 된 명령 줄 기반 소프트웨어 도구를 사용하여 세 가지 다른 폐 루프 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 간단히 설명 프로토콜은 능동 및 수동 막 특성의 큰 집합의 특성에 대한 관련 현재 클램프 자극 파형의 시리즈의 첫 번째 자동 주입입니다. 이러한 자극 파형의 정형화 된 일련의 응답 특성면에서 세포의 전기 생리 학적 표현형을 캡처하도록 제안되어왔다. 셀의 전자 코드로 알려진 (예를 들어, 참조 &amp; #160; 13,14)는, 예컨대 전기 응답의 컬렉션 객관적 그들의 전기적 특성에 기초하여 신경 세포를 분류하기 위해 여러 실험실에서 사용된다. 이 비례 적분 미분 (PID) 제어기에 의하여 발화 속도의 폐 루프, 실시간 제어를 포함 혁신 기술에 의해 고정 된 입력 - 출력 전송 관계 (FI 곡선)의 분석을 포함 , 체외 준비 (10)과, 컴퓨터 시뮬레이션 가상의 GABA 성 interneuron의 수단으로이 동시에 기록 피라미드 뉴런의 실시간 세 번째 인공 관련하여 사실적인 생체 -like 배경 시냅스 활동의 두 번째 휴양. 또한, LCG는 단일 전극을 사용하여 동적 클램프 프로토콜을 구현 허용 전극 활성 보정 (AEC) (15)로 알려진 기술을 구현한다. 이 원하지 않는 효과를 보정 할 수 있습니다 (rtifacts) 세포가 자극을 전달하기 위해 사용될 때 발생하는 기록 전극. 방법은 기록 회로의 등가 전기 특성의 비모수 추정치에 기초한다. 이 논문에서 설명 된 기술 및 실험 프로토콜 용이 종래 개방 루프 전압 및 전류 클램프 실험에 적용 할 수 있고, 생체 내에서 그러한 세포 외 17,18 4,16와 같은 다른 제제 또는 세포 내 레코딩로 확장 될 수있다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학에 대한 설정의주의 조립체 안정된 고품질 레코딩을위한 매우 중요한 단계이다. 다음에 우리는 실험 장치는 실험에 이미 사용할 수 있다고 가정하고, LCG의 사용을 설명하기에 우리의 관심을 집중한다. 독자는 최적화 및 디버깅에 대한 자세한 팁은 19-22로 지적되고있다.

<table><tbody><tr><td>조직 슬라이서</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1.5/0.84mm OD/ID, 필라멘트</td></tr><tr><td>포함 진동 차단 테이블</td><td>TMC</td><td>20 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>DMLFS</td><td>40X Immersion Objective</td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>컴퓨터 제어</td></tr><tr><td>데이터 수집 카드</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Comedi Linux Drivers</td></tr><tr><td>지원 데스크탑 컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 Tower</td><td>OS : 실시간 Linux</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td>, <td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>R4와 함께 사용, 펌프 헤드 (F117606),</td></tr> <tr><td>온도 컨트롤러</td>, <td>다중 채널 시스템</td>, <td>TC02</td>, <td>PH01, 관류, 캐뉼라</td></tr><tr><td>, 압력계</td>, <td>Testo, 510</td>, <td></td><td>옵션</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>, Memmert,</td><td>WB14</td><td></td></tr>, <tr><td>NaCl</td>, <td>Sigma</td>, <td>71376</td>, <td>ACSF,</td></tr><tr><td>KCl</td>, <td>Sigma</td>, <td>P9541</td>, <td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-글루코네이</td>트 <td>시그마</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>시그마</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>시그마</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-포스포크레아틴</td><td>시그마</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

실험은 신경 자극 시스템의 응답에 대한 실시간에 의존인가 개발 및 신규 적용 종종 복잡한 폐쇄 - 루프 프로토콜에 대한 관심이 증가 목격된다. 최근 애플리케이션 optogenetics 3을 사용 피질 스트로크 다음 발작 제어 생쥐 1 및 지브라 피쉬 2 모두 모터 반응 연구를위한 가상 현실 시스템의 구현에 이르기까지 다양. 폐쇄 루프 기술의 주요 장점은 직접 액세스 할 수없는 또는 동시에 실험 처리량을 최대화하면서, 이러한 신경 흥분성 4 및 신뢰성 등 여러 변수에 의존하는 더 높은 차원의 특성을 프로빙하는 능력에있다. 이 기여 및 세포 전기 생리학의 맥락에서, 우리는 피라미드 대뇌 피질의 뉴런, REC의 응답 특성의 연구에 폐쇄 루프 다양한 프로토콜을 적용하는 방법에 대해 설명합니다청소년 쥐의 체 감각 피질에서 급성 뇌 조각에서 패치 클램프 기술로 세포 내 orded. 어떠한 시판 또는 개방 소스 소프트웨어를 효율적으로 여기에 설명 된 실험을 수행하는 데 필요한 모든 기능을 제공하지 같이, LCG 5라는 새로운 소프트웨어 도구는 그 모듈러 구조 컴퓨터 코드의 재사용을 극대화하고 새로운 실험 패러다임의 구현을 용이하게 개발되었다. 자극 파형은 컴팩트 한 메타 설명을 사용하여 지정하고 전체 실험 프로토콜은 텍스트 기반의 구성 파일에 설명되어 있습니다. 또한, LCG는 시험의 반복 실험 프로토콜의 자동화에 적합 명령 줄 인터페이스를 가지고 있습니다.

이전 섹션에서, 우리는 L5 피라미드 세포의 전기 생리 학적 특성을 특성화하는 소프트웨어 툴박스 LCG를 사용하고, 슬라이스 조제에서 생체 -like 시냅스 활성을 다시하는 방법을 설명 하였다. 명령 라인 인터페이스 및 반자동 프로토콜의 사용은 생성 된 데이터의 출력과 품질에 큰 영향을 미칠 수 실험의 재현성과 효율을 선호. 데이터가 일관된 방식으로 저장이기 때문에, 실제로는 특정 목표에 대한 분석을 확장하기 용이하다. (1)는 여섯 별개의 프로토콜을 이용하여 셀의 기본 전기 생리 학적 특성을 특징으로되어있는 실험의 전형적인 결과를 나타낸다. 활동 전위 모양 및 임계치 (도 1a)의 측정 : 짧은 전류 탈분극의 강한 펄스는 평균 활동 전위 모양을 측정하기 위해 주입된다. 스파이크는 임계활동 전위 (24)의 세 번째 도함수의 제 1 피크로 계산. 전압 ...

폐쇄 루프 프로토콜은 현대 전기 생리학에서 점점 더 널리 보급되고 있습니다. 우리는 데스크톱 컴퓨터와 디지털 수집 보드를 사용하여 체외에서 피질 피라미드 뉴런에서 복잡한 전기 생리학적 프로토콜을 수행하는 간단하고 다재다능하며 저렴한 방법을 제시합니다.

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

다음 실험의 전반적인 목표는 무료 소프트웨어 툴박스인 LCG를 사용하여 피질 뉴런에서 인비트로(in vitro) 다이내믹 클램프를 수행하는 것입니다. 이를 위해 쥐의 체성감각 피질 절편을 준비하여 파라메탈(parametal) 세포의 패치 클램프 기록을 수행합니다. 두 번째 단계로, 기록된 세포에 일련의 자동화된 전기생리학적 프로토콜을 적용하며, 이를 통해 세포의 표준 특성 분석을 수행하여 이후의 분석 및 세포 유형 간 비교에 활용합니다.다음으로, 흥분성 및 억제성 시냅스 이벤트의 주입을 시뮬레이션합니다. 생체 내 신피질 뉴런이 경험하는 고전도 상태를 재현하기 위해, 배경 시냅스 주입이 피질 세포의 이득(gain)을 어떻게 조절하는지를 결과에서 보여줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 예를 들어 한 실험 프로토콜의 결과를 다른 프로토콜의 입력값으로 사용하는 방식으로 실험 기록을 더 복잡한 워크플로우에 내장할 수 있다는 점입니다.이 방법은 전기생리학적 프로토콜을 표준화하고 데이터 분석을 가속화하며, 실험실 간의 데이터 공유를 위한 기반을 마련하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 원래 in vitro 전체 패치 CLA 기록을 위해 개발되었으나, in vivo 패치, CLA 기록 또는 마이크로어레이 전극을 이용한 기록과 같은 다른 실험 준비 및 프로토콜에도 편리하게 사용할 수 있습니다. 쥐의 뇌를 적출한 후 소뇌를 제거하고 메스를 사용하여 정중선을 따라 두 반구를 분리하십시오. 반구 하나에서 과잉 액체를 제거하고 순간접착제 한 방울을 사용하여 경사 플랫폼에 고정합니다.그런 다음 뇌 위에 CSF를 몇 방울 빠르게 떨어뜨리고 Vibram 챔버로 옮깁니다. 블레이드를 사용하여 뇌 조직의 앞쪽 2.5~3mm 부분을 제거합니다. 그 후, 절편 표면의 손상을 최소화하기 위해 절단 속도와 빈도를 조절합니다.다음으로, 두께를 300 micrometers로 설정하고 슬라이싱을 시작합니다. 칼날이 피질을 지나가면, 면도날이나 굽은 바늘을 사용하여 해마 위쪽과 관심 피질 영역의 가장자리를 절개합니다. 그 후, 슬라이스를 36 degrees Celsius의 멀티웰 배양 챔버로 옮깁니다.본 절차에서는 40배 배율 렌즈를 사용하여 기록 챔버에 슬라이스를 배치합니다. 5층 및 뇌 표면 아래 600~1000 µm 깊이에서 건강한 세포를 찾습니다. 이러한 세포들은 일반적으로 대비가 낮고 외관이 매끄러우며 부어 있지 않은 특징이 있습니다.건강한 세포를 찾으면, 마이크로 피펫의 3분의 1을 세포 내 용액으로 채웁니다. 그다음, 미리 설정된 Linux 운영 체제의 헤드 스테이지에 피펫을 장착합니다. 명령어를 실행하십시오.쉘 프롬프트가 나타나면, 데이터 수집 보드가 앰플리파이어를 구동하고 있지 않은지 확인하기 위해 해당 명령어를 입력하십시오. 그런 다음 피펫 홀더에 연결된 시린지의 피스톤을 눌러 30에서 50 millibars의 양압을 가하십시오.다음으로, 피펫을 절편 위 약 100 micrometers 높이에 위치시킨 후 마이크로 매니퓰레이터의 접근 모드(approach mode)를 사용하여 대상 세포 쪽으로 피펫을 이동시킵니다. 그 후, 전기생리학 증폭기의 피펫 오프셋을 조정하고 전압 클램프 모드에서 10 millivolt 테스트 펄스를 출력합니다. LCG SEAL 테스트 명령을 사용하여 피펫 저항을 모니터링하면서, 시린지 피스톤을 당겨 압력을 10 to 30 millibars로 낮춥니다.비디오 카메라 모니터의 영상을 관찰하며 세포에 천천히 접근하여 딤플(dimple)이 형성되는지 확인하십시오. 동시에 모니터에 표시되는 전류 파형을 통해 테스트 펄스에 의해 유도된 저항의 증가를 모니터링하십시오. 피펫 저항이 증가하고 세포에 딤플이 형성되면 즉시 압력을 해제하고, 피펫에 약한 음압을 가하여 씰(seal) 형성을 돕습니다.그동안 유지 전위를 -70 mV로 서서히 낮춥니다. 부드럽게 흡입하여 세포막을 파열시키고 whole-cell configuration을 형성합니다. 그런 다음 세포의 전기적 특성을 분석합니다.LCGE 코드를 사용하여 생성하였습니다. 다음은 임계값이 -50.5 mV인 5층 피라미드 뉴런 패치 세포의 평균 활동 전위입니다. 이 그림은 과분극 전류에 대한 수동적 반응의 측정 결과를 보여줍니다.세포의 기본적인 활성 특성을 확인한 결과, 해당 세포는 규칙적으로 스파이킹하는 뉴런이며, 시뮬레이션된 흥분성 시냅스 후 전위를 주입했을 때 적응 현상이 최소한으로 나타남을 알 수 있습니다. 쉘의 명령 프롬프트에 이 명령어를 입력하여 다음 실험이 저장될 디렉토리를 변경하십시오. 증폭기의 기존 하드웨어 컨트롤을 조작하는 대신, 브리지 밸런싱과 커패시턴스 보정을 적용하려면 이 명령어를 실행하여 활성 전극 보정에 필요한 전극 커널을 추정하십시오.전체 커널은 두 가지 성분, 즉 빠른 전극 커널과 전체 커널에서 관찰되는 지수적 꼬리 부분을 생성하는 더 느린 막 커널의 합입니다. 전자는 피펫의 비매개변수 모델을 구성합니다. 막 커널과 전극 커널을 분리하기 위해 전류를 주입하면, LCG 커널 명령을 통해 빠른 전극 커널을 구성하는 포인트 수를 사용자에게 요청합니다. 그다음, 전극 커널이 지수적 감쇠 꼬리의 끝부분을 포함하도록 숫자를 선택하십시오.그런 다음 이 명령어를 사용하여 다이내믹 클램프 실험을 수행합니다. 마지막으로 결과를 시각화합니다. 다음은 다이내믹 클램프를 이용한 in vivo 유사 활성의 재현 모습입니다.빨간색과 파란색 트레이스는 각각 흥분성 및 억제성 시냅스의 시뮬레이션을 나타냅니다. 여기서는 흥분성 또는 억제성 포스트시냅스 전류의 폭격(bombardment)을 받은 L5 피라미드 뉴런에서 기록된 전압 트레이스를 보여줍니다. 해당 세포에 주입된 흥분성, 억제성 및 총 전류가 차트에 표시되어 있습니다.20회 반복 실험 동안 생성된 스파이크의 래스터 플롯을 통해, 신경세포가 동일한 입력에 대해 매우 신뢰할 수 있고 정밀하게 반응할 수 있음을 알 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 무료로 제공되는 소프트웨어 툴박스 LCG를 사용하여 동적 램프 실험을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 신경 흥분성부터 복잡한 네트워크 상호작용에 이르기까지 다양한 주제를 연구하기 위한 다른 폐쇄 루프 프로토콜로 확장하여 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

본 논문에서는 로봇 신체와의 지속적인 상호작용 중에 정보 처리(즉, 코딩 및 디코딩)와 뉴런 어셈블리의 학습을 연구하는 폐쇄 루프 실험을 수행하기 위한 실험적 프레임워크를 제시합니다.

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

이 프로토콜은 신경 활동 패턴에 의해 트리거된 폐쇄 루프 자극을 위한 전기 생리학 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 상이한 자극 장치에 대해 용이하게 수정할 수 있는 샘플 Matlab 코드도 제공된다.

신경 생리학적 실험에서 신경 스파이크 활동을 사용하여 폐쇄 루프 자극을 트리거합니다.

우리는 뇌 전기장 측정 및 관련 바이오마커-대뇌 혈류의 관점에서 두개외 자극에 대한 용량-반응 곡선을 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌에 침습적인 전극 배치를 포함하기 때문에 전신 마취가 필요하며 통제된 호흡보다는 자발적 호흡이 선호됩니다.

두개외 자극 전극의 배치 및 마취된 마우스의 대뇌 혈류 및 두개내 전기장 측정

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여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

동적 클램프 전기생리학은 신경 발화 결함과 이온 채널 기능 장애 사이의 인과 관계를 확립할 수 있습니다. 우리는 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런의 동적 클램프 방법 및 프로토콜을 설명하고 유용한 리소스와 기술적 고려 사항을 언급합니다. 대표적인 연구에서 우리는 반복적인 발화를 구출하기 위해 Tsc1-/- Purkinje 뉴런에 모델링된 나트륨 전도도를 추가합니다.

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배우세요 LCG 소프트웨어를 사용한 피질 신경원의 동적 클램프 기법으로, 쥐 체감각 피질 슬라이스에서 패치 클램프 기록을 수행하고 자동 전기생리학 프로토콜을 적용하여 시냅스 사건을 시뮬레이션합니다.

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