실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 무료 소프트웨어 툴박스인 LCG를 사용하여 피질 뉴런에서 인비트로(in vitro) 다이내믹 클램프를 수행하는 것입니다. 이를 위해 쥐의 체성감각 피질 절편을 준비하여 파라메탈(parametal) 세포의 패치 클램프 기록을 수행합니다. 두 번째 단계로, 기록된 세포에 일련의 자동화된 전기생리학적 프로토콜을 적용하며, 이를 통해 세포의 표준 특성 분석을 수행하여 이후의 분석 및 세포 유형 간 비교에 활용합니다.

다음으로, 흥분성 및 억제성 시냅스 이벤트의 주입을 시뮬레이션합니다. 생체 내 신피질 뉴런이 경험하는 고전도 상태를 재현하기 위해, 배경 시냅스 주입이 피질 세포의 이득(gain)을 어떻게 조절하는지를 결과에서 보여줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 예를 들어 한 실험 프로토콜의 결과를 다른 프로토콜의 입력값으로 사용하는 방식으로 실험 기록을 더 복잡한 워크플로우에 내장할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 전기생리학적 프로토콜을 표준화하고 데이터 분석을 가속화하며, 실험실 간의 데이터 공유를 위한 기반을 마련하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 원래 in vitro 전체 패치 CLA 기록을 위해 개발되었으나, in vivo 패치, CLA 기록 또는 마이크로어레이 전극을 이용한 기록과 같은 다른 실험 준비 및 프로토콜에도 편리하게 사용할 수 있습니다. 쥐의 뇌를 적출한 후 소뇌를 제거하고 메스를 사용하여 정중선을 따라 두 반구를 분리하십시오. 반구 하나에서 과잉 액체를 제거하고 순간접착제 한 방울을 사용하여 경사 플랫폼에 고정합니다.

그런 다음 뇌 위에 CSF를 몇 방울 빠르게 떨어뜨리고 Vibram 챔버로 옮깁니다. 블레이드를 사용하여 뇌 조직의 앞쪽 2.5~3mm 부분을 제거합니다. 그 후, 절편 표면의 손상을 최소화하기 위해 절단 속도와 빈도를 조절합니다.

다음으로, 두께를 300 micrometers로 설정하고 슬라이싱을 시작합니다. 칼날이 피질을 지나가면, 면도날이나 굽은 바늘을 사용하여 해마 위쪽과 관심 피질 영역의 가장자리를 절개합니다. 그 후, 슬라이스를 36 degrees Celsius의 멀티웰 배양 챔버로 옮깁니다.

본 절차에서는 40배 배율 렌즈를 사용하여 기록 챔버에 슬라이스를 배치합니다. 5층 및 뇌 표면 아래 600~1000 µm 깊이에서 건강한 세포를 찾습니다. 이러한 세포들은 일반적으로 대비가 낮고 외관이 매끄러우며 부어 있지 않은 특징이 있습니다.

건강한 세포를 찾으면, 마이크로 피펫의 3분의 1을 세포 내 용액으로 채웁니다. 그다음, 미리 설정된 Linux 운영 체제의 헤드 스테이지에 피펫을 장착합니다. 명령어를 실행하십시오.

쉘 프롬프트가 나타나면, 데이터 수집 보드가 앰플리파이어를 구동하고 있지 않은지 확인하기 위해 해당 명령어를 입력하십시오. 그런 다음 피펫 홀더에 연결된 시린지의 피스톤을 눌러 30에서 50 millibars의 양압을 가하십시오.

다음으로, 피펫을 절편 위 약 100 micrometers 높이에 위치시킨 후 마이크로 매니퓰레이터의 접근 모드(approach mode)를 사용하여 대상 세포 쪽으로 피펫을 이동시킵니다. 그 후, 전기생리학 증폭기의 피펫 오프셋을 조정하고 전압 클램프 모드에서 10 millivolt 테스트 펄스를 출력합니다. LCG SEAL 테스트 명령을 사용하여 피펫 저항을 모니터링하면서, 시린지 피스톤을 당겨 압력을 10 to 30 millibars로 낮춥니다.

비디오 카메라 모니터의 영상을 관찰하며 세포에 천천히 접근하여 딤플(dimple)이 형성되는지 확인하십시오. 동시에 모니터에 표시되는 전류 파형을 통해 테스트 펄스에 의해 유도된 저항의 증가를 모니터링하십시오. 피펫 저항이 증가하고 세포에 딤플이 형성되면 즉시 압력을 해제하고, 피펫에 약한 음압을 가하여 씰(seal) 형성을 돕습니다.

그동안 유지 전위를 -70 mV로 서서히 낮춥니다. 부드럽게 흡입하여 세포막을 파열시키고 whole-cell configuration을 형성합니다. 그런 다음 세포의 전기적 특성을 분석합니다.

LCGE 코드를 사용하여 생성하였습니다. 다음은 임계값이 -50.5 mV인 5층 피라미드 뉴런 패치 세포의 평균 활동 전위입니다. 이 그림은 과분극 전류에 대한 수동적 반응의 측정 결과를 보여줍니다.

세포의 기본적인 활성 특성을 확인한 결과, 해당 세포는 규칙적으로 스파이킹하는 뉴런이며, 시뮬레이션된 흥분성 시냅스 후 전위를 주입했을 때 적응 현상이 최소한으로 나타남을 알 수 있습니다. 쉘의 명령 프롬프트에 이 명령어를 입력하여 다음 실험이 저장될 디렉토리를 변경하십시오. 증폭기의 기존 하드웨어 컨트롤을 조작하는 대신, 브리지 밸런싱과 커패시턴스 보정을 적용하려면 이 명령어를 실행하여 활성 전극 보정에 필요한 전극 커널을 추정하십시오.

전체 커널은 두 가지 성분, 즉 빠른 전극 커널과 전체 커널에서 관찰되는 지수적 꼬리 부분을 생성하는 더 느린 막 커널의 합입니다. 전자는 피펫의 비매개변수 모델을 구성합니다. 막 커널과 전극 커널을 분리하기 위해 전류를 주입하면, LCG 커널 명령을 통해 빠른 전극 커널을 구성하는 포인트 수를 사용자에게 요청합니다. 그다음, 전극 커널이 지수적 감쇠 꼬리의 끝부분을 포함하도록 숫자를 선택하십시오.

그런 다음 이 명령어를 사용하여 다이내믹 클램프 실험을 수행합니다. 마지막으로 결과를 시각화합니다. 다음은 다이내믹 클램프를 이용한 in vivo 유사 활성의 재현 모습입니다.

빨간색과 파란색 트레이스는 각각 흥분성 및 억제성 시냅스의 시뮬레이션을 나타냅니다. 여기서는 흥분성 또는 억제성 포스트시냅스 전류의 폭격(bombardment)을 받은 L5 피라미드 뉴런에서 기록된 전압 트레이스를 보여줍니다. 해당 세포에 주입된 흥분성, 억제성 및 총 전류가 차트에 표시되어 있습니다.

20회 반복 실험 동안 생성된 스파이크의 래스터 플롯을 통해, 신경세포가 동일한 입력에 대해 매우 신뢰할 수 있고 정밀하게 반응할 수 있음을 알 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 무료로 제공되는 소프트웨어 툴박스 LCG를 사용하여 동적 램프 실험을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 신경 흥분성부터 복잡한 네트워크 상호작용에 이르기까지 다양한 주제를 연구하기 위한 다른 폐쇄 루프 프로토콜로 확장하여 적용할 수 있습니다.