2014년 11월 28일
여기에서는 고해상도 나노 스케일 표면 전위 맵을 생성하기 위한 도구로 Kelvin 프로브 힘 현미경을 사용하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 도구는 기질 표면에 대한 미생물의 결합 능력에 대한 표면 전위의 역할을 평가하기 위해 적용되었습니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 재료 기질에 부착된 후 세포막 전하의 변화를 관찰하는 것입니다. 이것은 영양이 풍부한 배지에서 미생물을 배양하여 수를 증가시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 미생물이 부착할 물질 표면은 최적의 미생물 부착 속도를 위해 청소되고 기능화됩니다.
그런 다음 미생물을 다양한 재료 기판에 도금하여 켈빈 프로브 힘 현미경 또는 KPFM 이미징을 허용합니다. 결과는 물질 기질 유형과 고유한 전하가 세포막 전하 및 세포 부착의 변화에서 볼 수 있듯이 세포 활성에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 전기영동, 광 산란 및 등전점 측정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 KPFM을 통해 전체 배양 또는 군체 대신 개별 세포 및 생물막의 전하를 검사할 수 있다는 것입니다.
이는 세포 대 세포뿐만 아니라 생물막 전기적 특성을 높은 정확도와 정밀도로 비교하고자 할 때 유용합니다. 먼저 5%양의 혈액 한천 플레이트를 준비하고, 준비된 플레이트에 MRSA 박테리아를 줄무늬로 표시하고, 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 잘 격리된 단일 콜로니를 생성합니다. 포도당 1%와 염화나트륨 0.1%를 보충한 삼부작 콩 육수 500ml와 깨끗한 유리 시험관 2개, 1밀리리터 피펫 1상자를 만듭니다.
배지와 시험관을 생물 안전 캐비닛 아래 또는 빵과 버너 근처에서 식힌 후 TSB 6ml를 각 시험관에 피펫으로 주입합니다. 미리 준비된 양 혈액 한천 플레이트 중 하나를 사용하여 MRSA의 단일 콜로니를 튜브 중 하나에 접종합니다. 두 번째 튜브를 음성 대조군으로 사용하여 무균성을 보장하고 상호 인큐베이터에서 튜브를 섭씨 37도 및 200RPM에서 24시간 동안 배양합니다.
MRSA 튜브는 성장을 보여야 하거나 대조 시험관에서 아무 것도 자라지 않아야 합니다. 다음으로, 24시간 배양액에서 1ml를 사용하여 6ml의 신선한 트립틱 콩 육수를 접종하고 섭씨 37도, 200RPM에서 다시 6시간 동안 배양하여 하위 배양을 만듭니다. 그런 다음 배양액 1ml를 afus 튜브에 피펫으로 넣고 850배 G로 3분 동안 원심분리합니다.
supinate를 제거하고 탈 이온수를 사용하여 주로 사용하는 손에 집게로 펠릿을 두 번 씻습니다. 20mm 스테인리스 스틸, FM 샘플 디스크를 잡고 5ml의 탈이온수를 사용하여 각 면을 청소합니다. 깨끗한 디스크를 탈이온수 비이커에 넣고 초음파 처리 후 1분 동안 초음파 처리합니다.
집게를 사용하여 s를 제거하십시오.amp비커에서 디스크를 제거하고 종이 타월에 열린 페트리 접시의 가장자리에 대해 약 60도 각도로 기울입니다. 완전히 말리려면 접시 뚜껑을 사용하여 건조 디스크를 덮습니다. 건조되면 디스크를 페트리 접시에 옮겨 디스크 표면을 기능화합니다. 0.1% 폴리올 라이신 200-400마이크로리터를 생물 안전 캐비닛의 디스크에 피펫으로 넣고 겸자를 사용하여 디스크를 고정하기 위해 1시간 동안 실온을 배양합니다.
이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 탈이온수를 사용하여 씻으십시오. 다음 플레이트, 200 - 400 마이크로리터의 재현탁 세포를 코팅된 샘플 디스크 위에 두 번 세척합니다. 실내 온도를 30분 동안 배양한 후 1ml의 탈이온수를 사용하여 디스크를 부드럽게 세척합니다.
Kelvin Probe Force 현미경 이미징을 수행하기 위해 이미징하기 전에 디스크를 밤새 건조시킵니다. 원자력 현미경 또는 AFM, HEB 및 MAC 3 컨트롤러와 함께 컴퓨터를 켭니다. Ulence P ovu 개요와 같은 FM 이미징 소프트웨어를 엽니다.
A-C-A-F-M 또는 간헐적 접촉 모드에서의 이미징을 위한 올바른 지정을 선택합니다. 주로 사용하는 손에 FM 집게를 사용하고 다른 손에는 스프링이 장착된 클립 홀더를 열어 놓고 A-K-P-F-M 캔틸레버를 헤드피스에 조심스럽게 넣습니다. 헤드피스를 A FM에 조심스럽게 로드하고 레이저 광과 스테이지 리프트 모터 와이어를 연결합니다.
그런 다음 레이저를 캔틸레버 끝에 맞춥니다. 레이저를 캔틸레버 끝에 정렬합니다. 앞뒤로 손잡이를 시계 방향으로 몇 번 돌려 캔틸레버 칩 위에 있는 레이저를 이동합니다.
레이저가 칩에 도달하면 차단되어 더 이상 보이지 않습니다. 그런 다음 레이저 스폿이 다시 나타날 때까지 앞에서 뒤로 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 레이저는 이제 칩의 가장자리에 있습니다.
왼쪽에서 오른쪽 노브를 돌려 캔틸레버에 레이저를 배치합니다. 레이저가 캔틸레버를 통과하면 빠르게 사라졌다가 다시 나타납니다. 레이저 스폿은 나중에 포토 다이오드 장치가 놓일 젖빛 유리 덮개에서 볼 수 있어야 합니다.
앞뒤로 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌려 젖빛 유리의 점이 사라질 때까지 캔틸레버 아래로 끝을 향해 지점을 이동합니다. 이제 앞에서 뒤로 손잡이를 시계 방향으로 약간만 돌려 레이저가 캔틸레버 팁에만 놓이도록 배치하면 레이저 스폿이 젖빛 유리에 다시 나타납니다. 레이저가 정렬되면 스테이지 리프트 모터를 10초 동안 열린 위치로 유지하여 캔틸레버와 샘플 사이에 충분한 공간을 확보합니다.
샘플을 첨부할 때ampA FM에 이제 s를 배치하십시오.ampKPFM 스테이지. 구리선을 사용하여 s를 접지하십시오.ample 및 A FM에서 s로 적절한 전선을 연결하십시오.amp르 스테이지. 그런 다음 스테이지를 A FM 소프트웨어의 A FM에 연결합니다.
설정 시간이 10밀리초 이하이고 접근 속도가 초당 2미크론을 초과하지 않는지 확인하십시오. 팁 손상을 방지하려면 캔틸레버를 조정하고 캔틸레버 팁을 샘플 쪽으로 움직이기 시작합니다. 캔틸레버 팁이 샘플 표면에 도달하면 이미징 창 크기와 이상적인 이미징 영역을 선택하고 캔틸레버 설정점과 함께 eye 및 P gain을 최적화하여 지형 이미징이 최적화되도록 합니다.
지형 이미징이 최적화되면 FM 모드에서 KPFM 모듈을 켭니다. 이미징 창을 5개의 12 x 5 12 해상도 또는 느린 스캔 속도로 5미크론 x 5미크론으로 설정합니다. FM KPFM 설정의 경우 드라이브를 5에서 10% 사이로 설정합니다.드라이브 주파수를 2킬로헤르츠의 대역폭으로 1에서 5킬로헤르츠 사이로 설정합니다.
F-M-K-P-F-M에 대한 철 NP 게인을 0.3%로 설정합니다.KPFM 이미지를 획득한 후 포스트 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 이 비디오 데모에 설명된 설정을 사용하여 SP 데이터를 수집합니다. KPFM 이미지는 스테인리스강 및 금 표면 모두에 있는 15개의 MRSA 셀에서 촬영되었습니다. 수집된 이미지 유형은 다음과 같습니다.
KPFM은 이중 주파수를 사용하여 작동하기 때문에 세포 표면의 지형 이미지와 전기 데이터를 동시에 수집했습니다. 표면 전위의 작은 변화를 보다 쉽게 식별할 수 있도록 표면 전위 맵에 열 필터를 적용했습니다. 이 그래프에서는 미생물 멤브레인 표면 전위를 결정하기 위해 이미지를 분석한 다음 다른 기질의 성장을 비교하는 데 사용했습니다.
베어 스테인리스강과 베어 골드 기판의 표면 전위 스캔은 전체적으로 음의 표면 전위를 보여주었습니다. 폴리올, 라이신으로 코팅된 스테인리스강과 금 디스크는 모두 양의 표면 전위로의 전환을 나타냈습니다. MRSA 세포막 전위는 스테인리스강과 금 표면 사이에서 다양했습니다.
스테인리스강은 음의 표면 전위를 보인 금 기질의 MRSA 세포에 비해 세포에 대해 훨씬 더 큰 양의 멤브레인 표면 전위를 나타냅니다. KPFM의 전체 기능을 보여주기 위해 스테인리스강의 MRSA에 대한 스텝 높이 그래프의 예가 여기에 나와 있습니다. 이것은 기질 표면과 미생물 막 사이의 표면 전위의 차이를 보여줍니다.
이 비디오를 시청한 후에는 Kelvin 프로브 힘 현미경을 사용하여 다양한 재료 기판 표면에서 미생물 세포 부착 및 활성에 대한 전하의 영향을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
이 연구는 켈빈 프로브 힘 현미경(KPFM)을 사용하여 고해상도 나노 규모의 표면 전위 지도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 표면 전위가 다양한 기판 표면에 미생물의 결합 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용됩니다.
Kelvin probe force microscopy (KPFM) enables nanoscale measurement of microbial membrane surface potential, providing critical insights into electrostatic interactions that govern bacterial adhesion to biomaterials. This capability supports target validation in anti-infective development by de-risking mechanistic hypotheses about surface-mediated pathogenesis. The technique offers predictive value for screening antimicrobial coatings and implant materials by quantifying cell-surface charge dynamics at single-cell resolution.
KPFM integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, particularly for anti-infective programs targeting microbial adhesion.