Name: 켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 켈빈 프로브 힘 현미경(KPFM)을 사용하여 박테리아의 표면 전위를 측정하는 방법을. 이 기술은 미생물의 기질 부착 및 세포막 전하 변화를 나노스케일에서 정밀하게 분석하여 재료 설계와 미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자는 이 연구에 자금을 지원해 준 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada), 온타리오 연구 혁신부(Ontario Ministry of Research and Innovation), 캐나다 혁신 재단(Canada Foundation for Innovation)에 진심으로 감사를 표합니다.

유리와 문화 1. 준비 <ol><li> 이 실험을 진행하기 전에, 5 %의 양의 혈액 한천 (SBA) MRSA 성장에 대 한 번호판을 준비합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 SBA 판을 품어. 이 시간이 지나면, 단일, 잘 절연 식민지 액체 미디어에 이후의 예방 접종에 사용되는 존재해야한다. 2 개월 - 스토어 1 4 ° C에서 단일 콜로니와 SBA 판을 줄무늬. 참고 : 양의 혈액 한천 플레이트 (20) 사이에 들어있는 미리 만들어진 팩에 와서 - 제조 업체에 따라 25 판, 일반적으로 V 양의 피 / w 5 %의 추가와 트립신 간장 한천베이스로 구성되어 있습니다. </li><li> 1 % 포도당과 0.1 % NaCl로 보충 트립신 간장 국물 (TSB)의 500 mL로한다. 이 후, 수집이 유리 테스트 튜브를 청소합니다. 오토 클레이브 뚜껑 테스트 튜브를 사용할 수없는 경우, 모자로 알루미늄 호일을 사용합니다. 오토 클레이브 TSB 1 ML의 피펫 팁 상자와 함께 테스트 튜브입니다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에서 또는 빵 근처버너 욕실, 피펫 이전에 5 ml의 멸균 시험관에 TSB를 멸균. 충분한 시간을 보장하기 위해주의는 TSB을 수 있도록 주어진 및 테스트 튜브는 실온으로 냉각되고있다. 이전에 줄무늬가 5 % SBA 판에서, 6 ml의 TSB 배지에 단일 콜로니를 접종. 하나는 MRSA를 포함하고, 제 2 테스트 튜브 불임을 보장하기 위해 음성 대조군으로 사용한다. </li><li> 접종 TSB 테스트 튜브를 타고 37 ° C에서 24 시간 동안 200 rpm에서 상호 인큐베이터에 배치합니다. 더 성장 제어 시험관에 발생하지해야하는 동안이 시간 후에는 미생물 성장 MRSA 시험관에서 명백하다. </li><li> 신선한 TSB의 6 ml의에 24 시간 문화와 피펫 1 mL를 취하여. 200rpm으로 6 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 피펫 1.5 ml의 미세 원심 튜브에 6 시간 하위 문화 1 ㎖. 850 x g에서 3 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 탈 H 2 O의 1 ml의 펠렛을 다시 중단 원심 분리기, 반복, 다시 일시 중지합니다. </li></ol><ol><li> 스테인레스 스틸과 골드 AFM 샘플 디스크 (20mm 각각 10mm 직경)을 가지고 탈 H 2 O 5 ml의 각면을 청소 집게로 지배적 인 손에 샘플 디스크를 잡고 샘플 디스크의 각면에 5 mL를 피펫에 버금 딸림음 손을 사용합니다. 1 분 동안 초음파 처리 한 다음, 탈 H 2 O 20 ㎖를 넣은 비커에 양측 도시 샘플 디스크를 세척 한 후. </li><li> 초음파 사용 집게 후 비커에서 샘플 디스크를 제거합니다. 그들은 종이 타월에 페트리 접시의 가장자리에 60 ° 각도로 기울어 있도록 디스크를 넣습니다. 건조 디스크를 덮도록 페트리 접시 뚜껑을 사용한다. 디스크가 계속 진행하기 전에 완전히 건조 시키십시오. 8 시간 - 건조 시간 (4) 사이를 변화 할 수있다. </li><li> 일단 건조, 페트리 접시에 샘플 디스크를 배치하는 집게를 사용합니다. <ol><li> 선택적으로, (임의의 재료 샘플 디스크의 표면을 기능화예를 들면, 콜라겐, 히알루 론산,은 나노 입자 등)를 포함한다. </li><li> 이 실험을 위해, 도포하는 폴리 L 리신 기판 표면을 사용한다. 들면 폴리 -L- 리신 기능화 피펫 200 - 샘플 디스크에 (H 2 O)에서 0.1 % 폴리 -L- 리신의 400 μL, 및 페트리 접시를 실온에서 1 시간 동안 배양하자. </li><li> 1 시간 후, 샘플 디스크를 보유하고 탈 H 2 O의 1 ml로 씻어 집게를 사용 단계 2.2에 설명 된대로 종이 수건 건조 보자. </li></ol></li><li> 배 세척 다시 중단 세포를 가지고 200 판 - 생물 안전 캐비닛 내부 샘플 디스크에 400 μl를. 샘플 디스크가 폴리 -L- 리신으로 코팅되는 경우, 실온에서 0.5 시간 동안 배양한다. </li><li> 샘플 디스크 세포의 배양 후, 탈 H 2 O의 1 ml로 부드럽게 샘플 디스크를 씻어 디스크 이미징 전에 밤새 건조 시키십시오. </li></ol> 3. KPFM 이미징 참고 :이 실험을 위해,애질런트 5500 시리즈 ILM-AFM을 사용합니다. <ol><li> AFM을 시작하려면, AFM의 HEB와 MAC III 컨트롤러와 함께 컴퓨터 기기를 켭니다. 오픈 AFM 이미징 소프트웨어 (예를 들어, 애질런트 PicoView). 처음 ACAFM 또는 중 올바른 지정 간헐적 접촉 모드에서 이미징을위한 AFM에를 선택해야합니다. </li><li> 지배적 인 손에 AFM의 집게를 사용하고, 버금 딸림음 손으로 열고 스프링 클립 홀더를 잡고, 머리 조각에 KPFM 캔틸레버를 배치합니다. 취급 (적어도 5500 ILM-AFM)에이 단위로 AFM에 AFM 헤드 피스를 전송 X, Y 및 Z 스캔 지향성을 제어하는​​ 깨지기 쉬운 피에조 크리스탈 유닛을 포함하는 경우주의해야합니다. 참고 :이 경우에 사용 KPFM의 캔틸레버는 Mikromasch 도전 DPE 2.7 N / m의 80 kHz 및 스프링 상수의 평균 공진 주파수와 (저소음) 캔틸레버했다. 이러한 공진 주파수와 스프링 상수 캔틸레버 인해 사용의 용이성에 선정되었다.큰 스프링 상수 및 높은 공진 주파수를 갖는 캔틸레버 또한 이미징에 사용될 수있다. </li><li> 조심스럽게 AFM에 머리 부분을로드하고 (두 개의 와이어가 연결해야하는이 경우 : 레이저 광 무대 리프트 모터) 적절한 선을 연결합니다. </li><li> 캔틸레버의 팁에 레이저를 맞 춥니 다. 일부 장치는 쉽게 정렬 할 수있는 카메라 기능이 포함되어 있습니다. 카메라 기능이 AFM에 존재하지 않는다면, 다음 바와 같이, 캔틸레버 팁 상에 정렬 : <ol><li> 캔틸레버 칩 솟다 레이저를 이동 전면에서 후면 손잡이를 시계 방향으로 돌립니다. 레이저 칩 도달하면 차단됩니다 더 이상 볼 수 없습니다. 만 손잡이를 몇 번 돌립니다. </li><li> 레이저 스폿이 다시 나타날 때까지 시계 반대 방향으로 전후 노브를 돌립니다. 레이저는 칩의 가장자리에 지금이다. </li><li> 캔틸레버에 레이저의 위치를​​ 왼쪽에서 오른쪽으로 노브를 돌립니다. 레이저는 캔틸레버를 통과 그것은 사라지고 난을 다시 나타납니다N을 연속으로 빠르게. 레이저 스폿은 포토 다이오드 단위 나중에 앉을 것이다 젖빛 유리 커버에서 볼 수 있어야합니다. </li><li> 젖빛 유리에 자리가 없어 질 때까지 끝을 향해 캔틸레버 아래로 자리를 이동하는 반 시계 방향으로 전후 노브를 돌립니다. </li><li> 그냥 캔틸레버 팁에 앉아 있도록 레이저의 위치를​​ 지정하기 위해 약간 전후 손잡이를 시계 방향으로 돌립니다. 레이저 스폿은 젖빛 유리에 다시 나타납니다. 주 :이 다이빙 보드 캔틸레버 레이저 위치 결정 방법이다. 삼각형 캔틸레버, 배향 처리가 약간 다르다. </li></ol></li><li> 레이저가 정렬되면, AFM에 샘플을 부착 할 때 캔틸레버와 샘플 사이에 충분한 공간을 확보하기 위해 10 초 동안 &quot;열기&quot;위치에있는 스테이지 리프트 모터를 개최합니다. </li><li> KPFM 샘플 무대에 샘플을 놓습니다. 구리 와이어를 사용하여 샘​​플의 정전기를 제거하십시오. 샘플 단계에 AFM에서 해당 와이어를 연결합니다. 의 연결AFM에 다케. 대부분의 경우에 단계는 자석을 이용하여 제 위치에 유지된다. </li><li> AFM 소프트웨어에서, 조정은 캔틸레버 다음 샘플에 캔틸레버 끝의 접근을 시작한다. 안정화 시간 이하를 10msec로 설정되어 있는지 확인하고, 그 접근 속도는 선단의 손상을 방지하기 위하여는 2.0㎛ / 초를 초과하지 않는다. </li><li> 캔틸레버의 팁이 샘플 표면에 일단 촬상 윈도우 크기 및 최적 이미징 영역을 선택한다. 지형적 촬상 최적화되도록 캔틸레버 세트 포인트와 함께 I 및 P 이득을 최적화. <ol><li> 지형적 촬상 최적화되면 KPFM 모듈 켜 (FM 있거나, AM 모드 여기서, FM 모드를 사용한다). 그것은 KPFM 촬상 5 ㎛의 X는 5㎛ 촬상 창 바깥 매우 어려운 것을 주목해야한다. (- 0.05 라인 / 초 0.02) 또한, 최적의 KPFM 이미징, 느린 검색 속도와 512 X 512 해상도를 사용합니다. </li></ol></li><li> 10 % - FM-KPFM 설정에 대해 (설정을 ACAFM되지 않음), (5) 사이의 드라이브 %로 설정합니다. 캔틸레버 FR 설정2 kHz의 대역폭이 5 kHz로 - 1 사이 equency. 0.3 %로 FM-KPFM 설정에 I와 P 게인을 설정합니다. <ol><li> 신호 대역폭 및 I 및 샘플 표면 사이의 P 이득을 다릅니다. SP 영상을 최적화하기 위해, 상기 신호의 대역폭을 조정하고 P 및 I 이득은 최적의 이미지를 얻었다. 0.35 % - I와 P 이익의 권장 범위는 0.22에서 있습니다. </li></ol></li><li> 프로세스 및 SP는 데이터를 수집 후 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 KPFM 수집 분석한다. </li></ol>

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KPFM 표면 전기적인 데이터를 획득하기위한 신규 한 기술로서 채택되었다. 그것은 일반적으로 화학 전하 분포를 조사하기위한 방법으로 사용되었으며, 최근 마이크로 및 나노 비늘 생물학적 시스템의 연구에 적용되기 시작했다. 수집 된 데이터에서 우리는 미생물이 쉽게 심지어 정적 배양 3 시간 후, 스테인레스 스틸과 금 표면을 청소하는 연결을하지 않은 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다. 폴리 -L- 라이신 기능화 된 표면을 30 분 후에 급격한 미생물 부착을 보였다. 기능화 표면에 미생물의 긴 배양 시간은 샘플 표면, 가난한 지형 이미지에 과밀 세포되었다. 표면 기능화는 스테인레스 스틸과 골드 표면에 대한 긍정적 인 SP에 부정적인 SP에서 변화되었다. 이전의 연구는 일반적으로 미생물 삼투 이온 밸런스 (23)를 유지하기 때문에 셀 주위 음으로 하전 된 이온의 봉쇄에 음의 SP있는 것으로 나타났다. 또한 알려져그램 그램 양성 미생물에서 미생물과 음극에서 테이 코 산 포스페이트 기의 존재는 또한 부정적인의 SP <...

바이오 필름이 제거에 완강히 저항하고 질병 전송 및 항생제 내성의 증가 속도로 이어질 수있는 장비 표면과 피부 상처에서 생산되는 바이오 필름은 의료 산업에 대한 문제를 제시한다. 첨부 biofilm 형성의 첫 단계와 가역성 1-3로 인해 가장 중요한 단계이다. 기판 표면 특성을 미생물에 부착 중요한 역할을한다. 이러한 표면 경도, 다공도, 조도 및 소수성과 같은 인자가 미생물 부착을 행하도록 도시되​​었다; 그러나, 미생물의 부착 기판 표면 전위 (SP)의 역할을 조사 연구는 거의 4,5 행해졌 다. 음으로 대전 된 표면은 운모, 실리콘, 및 금 6 바실러스 투 린지 엔시스 포자의 부착을 방지 할 수 있습니다. 세포막 전위의 변화는 세포 부착과 운동성 5,7의 변화를 나타낸다. 그것은 전기 동음 것으로 확인되었습니다ogeneous 표면은 더 쉽게 미생물 부착 5를 촉진한다. 나노 스케일에서 박테리아의 표면 전위를 특성화하는 항 생물 연료 전략의 개발에 도움이 될 수있다하여 각종 세균의 표면에 부착 동역학을 이해하는 신규 한 방법을 제공하고있다. 이러한 전기 영동 광 산란, 제타 전위 및 등전점 결정 박테리아의 전기 역학을 특성화에 사용되는 다른 방법과는 달리, 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 각각의 세포 대신 전체 문화 8-11의 시험을 허용한다. 셀 - 셀 비교하거나 높은 정확도 및 정밀도와 전기적 특성을 생물막하고자 할 때 유용하다. KPFM은 원자력 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM은 스캐닝 터널링 현미경 (STM) (12)의 직접적인 결과로서 개발되었다. STM을 사용하여 첫 번째 게시 된 이미지 1982 년 12 게르트 Binnig와 하인리히 Rorhrer에 의해 수행되었다 </suP&gt;. 이들의 발명은 공기에 전도성 표면에 날카로운 전도성 팁을 스캔 래스터에 의해 원자 구조를 해결 할 수 있었다. 화상 신속 건조 DNA, 단백질 샘플 및 바이러스 12 STM을 사용하려고 생물학 여기 고해상도 이미지를 달성 의미. STM은 전문 프로브 팁 (13)를 사용하여 액체에서 수행 할 수 있습니다. 이 린제이 등., 금 전극 (13)에, 10 mM의 HClO 4 물에 이미지 DNA 분자 STM과 AFM을 사용하여 표시 하였다. KPFM 리간드 (26)와 DNA 및 단백질 분석 (25)와 생체 분자 상호 작용의 표면 전위를 결정 증명되었다. KPFM는 AFM 도전 캔틸레버 팁과 이상적으로 도전 샘플 사이의 접촉 전위차 (CPD)를 측정하여 14, 15 (, 내가 그림 1)를 운영하고 있습니다. 샘플은 반드시 도전 (즉, 생물학적 SAMPL 될 필요가 없습니다ES). 이미징 운모, 유리, 및 긴 비 - 전도성 표면이 얇고 -6,7- 밑바탕 도전 재료가 실리콘 표면으로 (비 도통)에서 수행 될 수있다. CPD는 표면 전위와 동등한 전압과 음의 전자 전하로 나눈 팁 (팁 φ) 및 샘플 (샘플 φ) 간의 일 함수의 차이로서 설명 될 수있다 (- E). 도전성 AFM 팁이 샘플 표면에 근접하게되면 때문에 페르미 에너지에서의 차이 (도 1, II, a) (15)에 정전 기적 ​​힘 (F의 ES)가 생성된다 (거리 (d)에 의해 분리). 이 시점에서, 팁 및 샘플 (E의 V)의 진공 에너지 평형으로 정렬된다. 가까운 시료 표면에 팁을 가져시, 팁과 시료 표면은 평행 판 커패시터 (도 1, II, B 등의 전기 접점과 행위에 와서 </strong&gt;) (14, 15). 이때, 팁과 시료 표면의 페르미 에너지는 정상 상태 평형에 도달 정렬 될 (도 1, II, b). 팁과 시료 표면으로 인해 E의 V의 작업 기능의 차이로 청구됩니다 및 V의 CPD가 형성됩니다. 인해 형성된 V의 CPD에 전기 콘택트 영역에서 F ES가 작용한다. 이 힘은 이후에 (도 1, II, c) 형성된 V의 CPD와 동일한 크기를 갖는 선단에 외부의 DC V의인가를 통해 무효화된다. 이는 DC 전압이 전기 접점의 영역에서 표면 전하를 제거 도포하고, V의 CPD의 F의 ES를 제거하는 데 필요한 V DC의 양은 SA 간의 일 함수의 차이와 같다mple 표면과 팁 (15). 이것은 팁의 일 함수가 공지되어 있고, 그것은 제조자에 의해 제공된다는 것을 주목해야한다. KPFM 모든 방법에서, AC 전압 (V AC, 약 100-500 MV)는 또한 팁과 시료 (14) 사이의 진동 전기력을 발생하기 위해 팁에인가된다. V의 CPD 및 / 또는 F 말이지의 변화를 측정 할 때 더 나은 해상도를 제공합니다. 이와 관련하여, 주파수 또는 전기적 진동의 진폭의 변화는 V DC에 의해 보정하고, 전위 맵을 생성 할 수있는 표면 일 수있다. 이지도의 특정 영역의 데이터는 상기 특정 지형은 대한 전기적 정보를 제공하도록 분석 될 수있다. (1) 리프트 모드, (2), 진폭 변조 (AM) 모드, 및 (3)의 주파수 변조 (FM) 모드 14,16 : KPFM 세 가지 모드에서 동작 할 수있다. 리프트 모드 초기 INC이었다KPFM의 arnation. 리프트 모드 발진 팁 지형 화상을 얻을 표면을 가로 질러 드래그하는 두 단계 방법에 의존한다. 두 번째 패스 팁을위한 샘플 상기 미리 설정된 거리 상승 (10-100 나노 미터) 다시 같은 지역에서 검색합니다. 때문에 AM- 및 FM-KPFM에 비해이 두 단계 방법, 리프트 모드로, 이미지 수집에 대한 가장 긴 시간이 소요됩니다. 멀리 표면으로부터 팁을 올리면 만 장거리 F 말이지 측정되는 것을 보장한다. 또한, 지형과 표면 전위 측정 사이의 크로스 토크가 증가 측면 해상도와 감도의 비용으로 분리된다. AM-KPFM 동시에 샘플 지형 및 표면 전위 (일회 주사) (14)를 측정하기 위해 듀얼 주파수를 이용하여 가로 해상도와 감도를 향상시킨다. AM 모드에서, 캔틸레버를 기계적 통상 5 %의 제 1 공진 주파수 이하, 발진 (F 0), 전기적 진동 (t두 번째 공진 주파수 (F 1)에서 V AC) hrough. F에 의한 ES 및 V의 변화에 CPD F (1)의 진폭의 변화는, 표면 전위의 측정 데이터를 제공하면서 지형 데이터의 생성 F 0 리드의 진폭의 변화. F 0과 캔틸레버의 F 하나는 크로스 토크가 최소화된다 (14) 신호 및 상당한 주파수 에너지에 의해 분리된다. AFM의 머리 전자 상자 (HEB)는 모두 지형을 제공하고 한 번의 스캔에서 동시에 잠재적 인 데이터를 표면에 두 개의 신호를 분리한다. FM-KPFM 생물학적 표면 (14)에 해상도도 더 이상 AM-KPFM을 향상시킨다. FM-KPFM는 정전기력 구배가 아닌 정전기 힘 (F 말이지) (15)의 변화를 측정하는 것을에서 AM-KPFM 다르게 작동합니다. AM 모드와 마찬가지로, FM 모드는 듀얼 주파수와 자장을 이용하여전자 통과 주사기구는 지형적 구하는 동시에 잠재적 인 데이터 (14)를 표면. FM 모드에서 외팔보 기계적 F 0으로 진동 전기적 낮은 주파수에서 발진하는 수정 (MOD F 전형적 1-5 kHz로). 정전 기적 ​​상호 작용시, 0와 f 모드 믹스 f를 0 ± F 형 모드 F 측 대역을 생성한다. 이러한 측 파대 정전기력의 변화에 매우 민감하고, AFM의 HEB 통해 F 0으로부터 분리 될 수있다. FM-KPFM는 정전기력 구배의 변화를 측정하기 때문에, 팁 선단 형상 및 그 유지 보수 / 무결성. 전체 표면 전위 해상도 (14), (15)에서 중요한 역할을 AM을 사용하여 잠재적 인 해상도를 표면 및 FM 모드는 횡 방향으로 1 nm 범위의 14 아르 -16. 그것은 KPFM 촬상에가 (비 - 극성 액체에서 수행 될 수 있고, 최근에, 저 이온 (&lt;10 mM)을 극성 액체에서 수행되는 것으로 도시되어 있음을 주목해야한다그러한 한 MilliQ 물로서 DC 바이어스의인가를 미연에 방지, 바이어스 피드백을 필요로하지 않는 개방 루프 KPFM 모드); 그러나, KPFM 영상은 아직 극성 솔루션 17-20에서 살아있는 세포에서 수행되어야한다. 액체에 SP 영상과 관련된 추가 과제 솔루션은 일반적으로 유지하는 세포에 사용되는 (즉, 인산염 완충 생리 식염수) 패러데이 반응, 바이어스 유도 충전 역학, 이온 확산 / 재배포 (20)로 이어질 것 모바일 이온의 높은 농도를 가지고있다. 따라서,이 실험에서, 측정은 주위 조건 하에서 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 스틸 및 금 표면 상에 건조시키고, MRSA 죽은 세포로부터 취해졌다. 이미지는 이전에 건조 또는 표면 (20)에 고정 된 생체 시료에 공기 또는 진공 상태에서 수행 할 수있다. 습한 환경은 표면 (6)의 촬상 KPFM에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이 연구에서는 FM-KPFM 고용AFM은 및 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 금 표면에 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 (MRSA)의 부착에 SP의 역할을 조사한다. MRSA는 최근 인해 다수의 β - 락탐 항생제와 세 팔로 스포린 (21)에 자사의 자연 선택 저항에 다제 내성 (MDR) &quot;슈퍼 벌레&quot;등의 상태를 얻고있다. MRSA 감염은 반코마이신 또는 장기간 치료 (22)로서 사용될 수 없다 따라서 인간에서 높은 독성 수준을 가지며, 옥사 졸리 디논 등의 가혹한 항균제의 사용에 이르는 지금 치료하기 더 어려운 곤란하고 강력하다. 스테인레스 스틸은 자사의 의료 관련성과 골드 비교 금속으로 사용되었다 등 피하 주사 바늘, bedpans, 문 손잡이, 싱크대,의 재료로 많이 사용으로 인해 선택되었다. FM-KPFM 미생물 막 SP가 기판에 부착시 변경되는 경우 검사를 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>5500ILM 원자력 현미경</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM 금속 표본 디스크</td><td>TED PELLA, INC.</td><td># 16219</td><td>스테인레스 스틸 샘플 디스크</td></tr><tr><td>DPE (저잡음) 전도성 SPM 프로브</td><td>Mikromasch</td> <td>#HQ : DPE-XSC11</td><td>칩 당 4 개의 Pt 코팅 캔틸레버가 있습니다. 우리는 실험을 위해 캔틸레버 B를 사용했습니다.</td></tr><tr><td>PELCO 골드 코팅 AFM/STM 금속 시편 디스크</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>금 시료 디스크</td></tr><tr><td>PicoView 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM 원자력 현미경 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Pico Image 소프트웨어(Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM 원자력 현미경 사후 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 고속 마이크로 원심분리기</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>배지에서 세포(펠릿)를 분리하기 위해 세포 세척 단계에 사용되는 원심분리기</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agart with 5% Sheep Blood</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>미리 만들어진 플레이트</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD#</td><td>257107</td><td>건조 분말 형태로 제공됩니다. 용기에 오는 방법에 대한 지침.</td></tr></tbody></table>

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

표면 전위는 기판 표면 위해 미생물의 밀착성 지배적 역할을 간과 물리적 특성이다. 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 나노 스케일에서 표면 사이의 접촉 전위차를 측정하는 원자 힘 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM KPFM와의 조합은, 표면 전위와 같은 박테리아 세포와 같은 생물학적 샘플의 지형도의 동시 생성을 허용한다. 여기서, 우리는 스테인레스 스틸과 같은 의학적으로 중요한 금 표면에 부착 미생물 표면 전위의 영향을 조사하기 KPFM를 이용한다. 표면 잠재적 인지도는 다른 재료 기판에 미생물 막에 대한 표면 전위의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 스텝 높이 그래프는 기판 표면과 미생물 사이의 경계 부분에서의 표면 전위의 차이를 표시하기 위해 생성 하였다. 세포막 표면 전위의 변화는 변화와 연결되어있다세포 대사 및 운동성의. 따라서 KPFM 각종 기재 표면에 접착시 미생물 막 표면 전위의 변화를 조사하기 위해 사용될 수있는 강력한 도구를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는를 사용 KPFM 스테인리스 스틸 및 골드 개별 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 세포의 표면 전위를 특성화하는 과정을 보여준다.

KPFM를 이용하여 SP를 측정하는 능력은 시료 표면과 캔틸레버 팁 모두 어느 정도 도전성 있다는 원리에 의존한다. 스테인레스 스틸과 골드는 MRSA가 부착 된에 전도성 표면을 행동했다. KPFM 이미지는 512 X 512 해상도 양면에 15 MRSA 세포의 촬영, 5 × 5 μm의 10 × 10 μm의 범위 스캔 영역으로 하였다. 스캔 라인은 0.02 / 초 내지 0.05 줄 / 초의 범위의 선 속도로 행했다. 512 데이터 포인트는 스캔 라인과 512 라인 당 수집에 따라서, 스캔 시간은 2.84 시간에서 7.11 시간였다. 수집 된 영상의 형식은도 2에서 볼 수있다. KPFM 듀얼 주파수를 이용하여 동작하고, 같은 지형 이미지 동시에 표면의 전기적 특성에 관한 데이터와 함께 수집된다. 열 필터는보다 쉽게 표면 전위 (그림 2)의 작은 변화를 식별하기 위해지도를 (SP)에 적용되었다. SP지도의 데이터 w분석 후 이미지 처리 소프트웨어로 평균 표면 전위 및 표준 ...

여기에서는 고해상도 나노 스케일 표면 전위 맵을 생성하기 위한 도구로 Kelvin 프로브 힘 현미경을 사용하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 도구는 기질 표면에 대한 미생물의 결합 능력에 대한 표면 전위의 역할을 평가하기 위해 적용되었습니다.

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 재료 기판에 부착된 후 세포막 전하의 변화를 관찰하는 것입니다. 이는 영양 풍부 배지에서 미생물을 배양하여 개체 수를 늘림으로써 달성됩니다. 다음으로, 미생물이 부착될 재료 표면을 세척하고 최적의 미생물 부착률을 위해 기능화합니다.그 후, 켈빈 프로브 힘 현미경(Kelvin probe force microscopy) 또는 KPFM 이미징이 가능하도록 미생물을 다양한 재료 기질 위에 도말합니다. 분석 결과, 재료 기질의 종류와 고유 전하가 세포막 전하 및 세포 부착의 변화에서 나타나듯 세포 활성에 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다. 전기영동, 광산란 및 등전점 결정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, KPFM을 통해 배양액이나 콜로니 전체가 아닌 개별 세포 및 바이오필름의 전하를 조사할 수 있다는 점입니다.이는 세포 간 및 바이오필름의 전기적 특성을 높은 정확도와 정밀도로 비교하고자 할 때 유용합니다. 우선, 5% 양혈 한천 배지를 준비하고 준비된 배지에 MRSA 박테리아를 스트리킹한 후, 37 °C에서 24시간 동안 배양하여 단일 격리 콜로니를 생성합니다. 1% glucose와 0.1% sodium chloride가 첨가된 triptych soy broth 500 mL를 제조하고, 깨끗한 유리 시험관 두 개와 1 mL 피펫 팁 한 박스와 함께 오토클레이브 멸균합니다.배지와 시험관을 생물안전작업대 내 또는 번센 버너 근처에서 식힌 후, 각 시험관에 TSB 6 mL를 피펫으로 분주합니다. 이전에 준비한 양 혈액 한천 배지 플레이트 중 하나를 사용하여, MRSA의 단일 콜로니를 시험관 하나에 접종합니다. 두 번째 시험관은 멸균 상태를 확인하기 위한 음성 대조군으로 사용합니다. 시험관을 교반 배양기에 넣고 37 °C, 200 RPM 조건에서 24시간 동안 배양합니다.MRSA 튜브에서는 균의 성장이 관찰되어야 하며, 대조군 시험 튜브에서는 아무것도 성장하지 않아야 합니다. 다음으로, 24시간 배양액에서 1 mL를 취해 6 mL의 신선한 tryptic soy broth에 접종하여 하위 배양을 생성하고, 37 °C, 200 RPM에서 6시간 동안 추가로 배양합니다. 그 후, 배양액 1 mL를 afus 튜브에 피펫으로 옮기고 850 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고, 우세손으로 핀셋을 사용하여 펠릿을 탈이온수로 2회 세척합니다. 20mm 스테인리스 스틸 FM 샘플 디스크를 잡고, 각 면을 5mL의 탈이온수로 세척합니다. 세척된 디스크를 탈이온수가 담긴 비커에 넣고 1분 동안 초음파 처리합니다.포셉을 사용하여 비커에서 샘플 디스크를 꺼내어, 종이 타월 위에 놓인 개방된 페트리 접시 가장자리에 약 60도 각도로 기울여 세웁니다. 완전히 건조시키려면 접시의 뚜껑으로 건조 중인 디스크를 덮어줍니다. 건조가 완료되면, 디스크 표면을 기능화하기 위해 디스크를 페트리 접시로 옮깁니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 포셉으로 디스크를 고정한 상태로 0.1% polyol lysine 200~400 µL를 디스크 위에 피펫으로 분주하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.이 비디오의 앞부분에서 시연한 것과 같이 탈이온수로 세척하십시오. 다음으로, 두 번 세척하여 재현탁된 세포 200~400 µL를 코팅된 샘플 디스크에 분주하십시오. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 1 mL의 탈이온수를 사용하여 디스크를 조심스럽게 세척하십시오.Kelvin Probe Force 현미경 이미징을 수행하기 전, 디스크를 하룻밤 동안 건조하십시오. 컴퓨터와 함께 원자력 현미경(AFM), HEB 및 MAC three 컨트롤러의 전원을 켭니다. Ulence P ovu overview와 같은 AFM 이미징 소프트웨어를 실행하십시오.간헐적 접촉 모드(intermittent contact mode) 영상을 위한 A-C-A-F-M 또는 정확한 명칭을 선택하십시오. 주로 사용하는 손으로 FM 포셉을 사용하고 다른 손으로 스프링 하중 클립 홀더를 열어둔 상태에서 A-K-P-F-M 캔틸레버를 헤드피스에 조심스럽게 장착하십시오. 헤드피스를 A FM에 조심스럽게 장착하고 레이저 광원 및 스테이지 리프트 모터 전선을 연결하십시오.그 다음 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬합니다. 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬하려면, 전후 조절 노브를 시계 방향으로 몇 번 돌려 레이저가 캔틸레버 칩 위로 이동하도록 합니다.레이저가 칩에 도달하면, 빛이 차단되어 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이때 전후 조절 노브를 반시계 방향으로 회전시켜 레이저 스폿이 다시 나타나게 하십시오. 이제 레이저가 칩의 가장자리에 위치하게 됩니다.좌우 조절 노브를 돌려 캔틸레버 위에 레이저를 위치시킵니다. 레이저가 캔틸레버 위를 지나갈 때, 레이저 빛이 빠르게 사라졌다 다시 나타나게 됩니다. 레이저 스폿은 나중에 포토다이오드 유닛이 놓이게 될 프로스테드 글라스 커버에서 확인 가능해야 합니다.프로스트 글라스에서 스팟이 사라질 때까지 전후 조절 노브를 시계 반대 방향으로 돌려 캔틸레버의 팁 방향으로 스팟을 이동시킵니다. 이제 레이저가 캔틸레버 팁의 바로 위에 위치하도록 전후 조절 노브를 시계 방향으로 아주 약간만 돌리면, 프로스트 글라스에 레이저 스팟이 다시 나타납니다. 레이저 정렬이 완료되면, 캔틸레버와 시료 사이에 충분한 공간이 확보되도록 스테이지 리프트 모터를 10초 동안 열림 위치로 유지하십시오.샘플을 A FM에 부착할 때, 샘플을 KPFM 스테이지 위에 놓습니다. 구리선을 사용하여 샘플을 접지하고, A FM에서 샘플 스테이지로 적절한 와이어들을 연결합니다. 그런 다음 A FM 소프트웨어에서 스테이지를 A FM에 연결합니다.정착 시간(setting time)이 10 milliseconds 이하가 되도록 하고, 접근 속도가 2 microns per second를 초과하지 않도록 하십시오. 팁 손상을 방지하기 위해 캔틸레버를 튜닝한 후 캔틸레버 팁을 시료 쪽으로 이동시키기 시작합니다. 캔틸레버 팁이 시료 표면에 도달하면, 이미징 윈도우 크기와 적절한 이미징 영역을 선택하고, 지형 이미징이 최적화될 수 있도록 I 및 P 게인과 캔틸레버 설정값(set point)을 최적화하십시오.지형 이미징이 최적화되면, FM 모드에서 KPFM 모듈을 켭니다. 이미징 창을 5 µm × 5 µm로 설정하고, 해상도를 512 × 512로 하거나 스캔 속도를 느리게 설정하십시오. FM KPFM 설정의 경우, 드라이브를 5~10% 사이로 설정하십시오. 드라이브 주파수는 1~5 kHz 사이로, 대역폭은 2 kHz로 설정하십시오.F-M-K-P-F-M의 iron NP 이득을 0.3%로 설정하십시오. KPFM 이미지를 획득한 후, 후처리 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 이 비디오 시연에 설명된 설정을 사용하여 SP 데이터를 수집하십시오. KPFM 이미지는 스테인리스 스틸과 금 표면 모두에서 15개의 MRSA 세포를 대상으로 촬영되었습니다. 여기에는 수집된 이미지 유형들이 표시되어 있습니다.KPFM은 이중 주파수를 사용하여 작동하므로, 세포 표면의 지형 이미지와 전기적 데이터를 동시에 수집하였습니다. 표면 전위의 미세한 변화를 더 쉽게 식별하기 위해 표면 전위 맵에 열 필터를 적용하였습니다. 이 그래프에서는 이미지를 분석하여 미생물 막의 표면 전위를 결정하였으며, 이후 서로 다른 기질에서의 성장을 비교하는 데 사용하였습니다.베어 스테인리스 스틸 및 베어 금 기판의 표면 전위 스캔 결과, 전반적으로 음의 표면 전위를 나타냈습니다. 폴리올 라이신이 코팅된 스테인리스 스틸과 금 디스크는 모두 양의 표면 전위로의 이동을 보였습니다. MRSA 세포막 전위는 스테인리스 스틸 표면과 금 표면 사이에서 차이를 보였습니다.스테인리스강은 음의 표면 전위를 보인 금 기질 위의 MRSA 세포와 비교하여 세포에 대해 훨씬 더 큰 양의 막 표면 전위를 나타냈습니다. KPFM의 전체적인 성능을 입증하기 위해, 스테인리스강 상의 MRSA에 대한 단차 높이 그래프의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 기질 표면과 미생물 막 사이의 표면 전위 차이를 보여줍니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 켈빈 프로브 힘 현미경(Kelvin probe force microscopy)을 사용하여 다양한 재료 기판 표면에서 전기 전하가 미생물 세포의 부착 및 활성에 미치는 영향을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

라이브 그람 음성 및 그람 양성 세균은 젤라틴 코팅 운모에 고정화 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 액체에 몇 군데 있습니다.

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

출처: Wen, J., Pasman, et. al., Bacillus subtilis 포자의 제르미노솜 및 내막 시각화. J. Vis. Exp. (2019년)이 비디오는 박테리아 포자 내에서 발아 단백질의 조직을 밝히는 3차원 형광 이미지를 획득하기 위해 구조화된 조명 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

박테리아 포자 내막의 발아 단백질 시각화

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동<em&gt; 현장에서</em세균 바이오 필름 물성&gt; 3D 매핑

측정 및 식물, 특히 뿌리와 콩나물, 세균성 접착을 위한 쉬운 방법이이 문서에 설명 되어 있습니다.

공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착

여기, 우리 podosomes 지형 이미지의 자동 분석 영화의 준비에서 규격 필름에 적용 되는 돌출 세력을 평가 하는 데 사용 하는 실험 기법을 상세하게.

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 세균 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하여 나노 스케일 해상도를 달성할 수 있습니다. 둘 다, 세포 외 변화의 매핑 (예를 들어, 세포 분열시) 뿐만 아니라 화학 조성의 비교 연구 (예를 들어, 약물 내성에서 발생) 박테리아의 단일 세포 수준에서 수행 될 수있다.

원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

켈빈 프로브 힘 현미경(KPFM)은 표면 지형과 표면 전위의 차이를 측정하는 반면, 주사 전자 현미경(SEM) 및 관련 분광법은 표면 형태, 구성, 결정도 및 결정학적 방향을 밝힐 수 있습니다. 따라서 SEM과 KPFM의 공동 국소화는 나노 스케일 조성 및 표면 구조가 부식에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

켈빈 프로브 힘 현미경을 다른 현미경 및 분광학과 공동 위치 파악: 합금의 부식 특성화에서 선택된 응용 분야

학습하세요 켈빈 프로브 힘 현미경(KPFM)을 사용하여 박테리아의 표면 전위를 측정하는 방법을. 이 기술은 미생물의 기질 부착 및 세포막 전하 변화를 나노스케일에서 정밀하게 분석하여 재료 설계와 미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

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