켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 재료 기판에 부착된 후 세포막 전하의 변화를 관찰하는 것입니다. 이는 영양 풍부 배지에서 미생물을 배양하여 개체 수를 늘림으로써 달성됩니다. 다음으로, 미생물이 부착될 재료 표면을 세척하고 최적의 미생물 부착률을 위해 기능화합니다.

그 후, 켈빈 프로브 힘 현미경(Kelvin probe force microscopy) 또는 KPFM 이미징이 가능하도록 미생물을 다양한 재료 기질 위에 도말합니다. 분석 결과, 재료 기질의 종류와 고유 전하가 세포막 전하 및 세포 부착의 변화에서 나타나듯 세포 활성에 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다. 전기영동, 광산란 및 등전점 결정과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, KPFM을 통해 배양액이나 콜로니 전체가 아닌 개별 세포 및 바이오필름의 전하를 조사할 수 있다는 점입니다.

이는 세포 간 및 바이오필름의 전기적 특성을 높은 정확도와 정밀도로 비교하고자 할 때 유용합니다. 우선, 5% 양혈 한천 배지를 준비하고 준비된 배지에 MRSA 박테리아를 스트리킹한 후, 37 °C에서 24시간 동안 배양하여 단일 격리 콜로니를 생성합니다. 1% glucose와 0.1% sodium chloride가 첨가된 triptych soy broth 500 mL를 제조하고, 깨끗한 유리 시험관 두 개와 1 mL 피펫 팁 한 박스와 함께 오토클레이브 멸균합니다.

배지와 시험관을 생물안전작업대 내 또는 번센 버너 근처에서 식힌 후, 각 시험관에 TSB 6 mL를 피펫으로 분주합니다. 이전에 준비한 양 혈액 한천 배지 플레이트 중 하나를 사용하여, MRSA의 단일 콜로니를 시험관 하나에 접종합니다. 두 번째 시험관은 멸균 상태를 확인하기 위한 음성 대조군으로 사용합니다. 시험관을 교반 배양기에 넣고 37 °C, 200 RPM 조건에서 24시간 동안 배양합니다.

MRSA 튜브에서는 균의 성장이 관찰되어야 하며, 대조군 시험 튜브에서는 아무것도 성장하지 않아야 합니다. 다음으로, 24시간 배양액에서 1 mL를 취해 6 mL의 신선한 tryptic soy broth에 접종하여 하위 배양을 생성하고, 37 °C, 200 RPM에서 6시간 동안 추가로 배양합니다. 그 후, 배양액 1 mL를 afus 튜브에 피펫으로 옮기고 850 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고, 우세손으로 핀셋을 사용하여 펠릿을 탈이온수로 2회 세척합니다. 20mm 스테인리스 스틸 FM 샘플 디스크를 잡고, 각 면을 5mL의 탈이온수로 세척합니다. 세척된 디스크를 탈이온수가 담긴 비커에 넣고 1분 동안 초음파 처리합니다.

포셉을 사용하여 비커에서 샘플 디스크를 꺼내어, 종이 타월 위에 놓인 개방된 페트리 접시 가장자리에 약 60도 각도로 기울여 세웁니다. 완전히 건조시키려면 접시의 뚜껑으로 건조 중인 디스크를 덮어줍니다. 건조가 완료되면, 디스크 표면을 기능화하기 위해 디스크를 페트리 접시로 옮깁니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 포셉으로 디스크를 고정한 상태로 0.1% polyol lysine 200~400 µL를 디스크 위에 피펫으로 분주하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

이 비디오의 앞부분에서 시연한 것과 같이 탈이온수로 세척하십시오. 다음으로, 두 번 세척하여 재현탁된 세포 200~400 µL를 코팅된 샘플 디스크에 분주하십시오. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 1 mL의 탈이온수를 사용하여 디스크를 조심스럽게 세척하십시오.

Kelvin Probe Force 현미경 이미징을 수행하기 전, 디스크를 하룻밤 동안 건조하십시오. 컴퓨터와 함께 원자력 현미경(AFM), HEB 및 MAC three 컨트롤러의 전원을 켭니다. Ulence P ovu overview와 같은 AFM 이미징 소프트웨어를 실행하십시오.

간헐적 접촉 모드(intermittent contact mode) 영상을 위한 A-C-A-F-M 또는 정확한 명칭을 선택하십시오. 주로 사용하는 손으로 FM 포셉을 사용하고 다른 손으로 스프링 하중 클립 홀더를 열어둔 상태에서 A-K-P-F-M 캔틸레버를 헤드피스에 조심스럽게 장착하십시오. 헤드피스를 A FM에 조심스럽게 장착하고 레이저 광원 및 스테이지 리프트 모터 전선을 연결하십시오.

그 다음 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬합니다. 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬하려면, 전후 조절 노브를 시계 방향으로 몇 번 돌려 레이저가 캔틸레버 칩 위로 이동하도록 합니다.

레이저가 칩에 도달하면, 빛이 차단되어 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이때 전후 조절 노브를 반시계 방향으로 회전시켜 레이저 스폿이 다시 나타나게 하십시오. 이제 레이저가 칩의 가장자리에 위치하게 됩니다.

좌우 조절 노브를 돌려 캔틸레버 위에 레이저를 위치시킵니다. 레이저가 캔틸레버 위를 지나갈 때, 레이저 빛이 빠르게 사라졌다 다시 나타나게 됩니다. 레이저 스폿은 나중에 포토다이오드 유닛이 놓이게 될 프로스테드 글라스 커버에서 확인 가능해야 합니다.

프로스트 글라스에서 스팟이 사라질 때까지 전후 조절 노브를 시계 반대 방향으로 돌려 캔틸레버의 팁 방향으로 스팟을 이동시킵니다. 이제 레이저가 캔틸레버 팁의 바로 위에 위치하도록 전후 조절 노브를 시계 방향으로 아주 약간만 돌리면, 프로스트 글라스에 레이저 스팟이 다시 나타납니다. 레이저 정렬이 완료되면, 캔틸레버와 시료 사이에 충분한 공간이 확보되도록 스테이지 리프트 모터를 10초 동안 열림 위치로 유지하십시오.

샘플을 A FM에 부착할 때, 샘플을 KPFM 스테이지 위에 놓습니다. 구리선을 사용하여 샘플을 접지하고, A FM에서 샘플 스테이지로 적절한 와이어들을 연결합니다. 그런 다음 A FM 소프트웨어에서 스테이지를 A FM에 연결합니다.

정착 시간(setting time)이 10 milliseconds 이하가 되도록 하고, 접근 속도가 2 microns per second를 초과하지 않도록 하십시오. 팁 손상을 방지하기 위해 캔틸레버를 튜닝한 후 캔틸레버 팁을 시료 쪽으로 이동시키기 시작합니다. 캔틸레버 팁이 시료 표면에 도달하면, 이미징 윈도우 크기와 적절한 이미징 영역을 선택하고, 지형 이미징이 최적화될 수 있도록 I 및 P 게인과 캔틸레버 설정값(set point)을 최적화하십시오.

지형 이미징이 최적화되면, FM 모드에서 KPFM 모듈을 켭니다. 이미징 창을 5 µm × 5 µm로 설정하고, 해상도를 512 × 512로 하거나 스캔 속도를 느리게 설정하십시오. FM KPFM 설정의 경우, 드라이브를 5~10% 사이로 설정하십시오. 드라이브 주파수는 1~5 kHz 사이로, 대역폭은 2 kHz로 설정하십시오.

F-M-K-P-F-M의 iron NP 이득을 0.3%로 설정하십시오. KPFM 이미지를 획득한 후, 후처리 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 이 비디오 시연에 설명된 설정을 사용하여 SP 데이터를 수집하십시오. KPFM 이미지는 스테인리스 스틸과 금 표면 모두에서 15개의 MRSA 세포를 대상으로 촬영되었습니다. 여기에는 수집된 이미지 유형들이 표시되어 있습니다.

KPFM은 이중 주파수를 사용하여 작동하므로, 세포 표면의 지형 이미지와 전기적 데이터를 동시에 수집하였습니다. 표면 전위의 미세한 변화를 더 쉽게 식별하기 위해 표면 전위 맵에 열 필터를 적용하였습니다. 이 그래프에서는 이미지를 분석하여 미생물 막의 표면 전위를 결정하였으며, 이후 서로 다른 기질에서의 성장을 비교하는 데 사용하였습니다.

베어 스테인리스 스틸 및 베어 금 기판의 표면 전위 스캔 결과, 전반적으로 음의 표면 전위를 나타냈습니다. 폴리올 라이신이 코팅된 스테인리스 스틸과 금 디스크는 모두 양의 표면 전위로의 이동을 보였습니다. MRSA 세포막 전위는 스테인리스 스틸 표면과 금 표면 사이에서 차이를 보였습니다.

스테인리스강은 음의 표면 전위를 보인 금 기질 위의 MRSA 세포와 비교하여 세포에 대해 훨씬 더 큰 양의 막 표면 전위를 나타냈습니다. KPFM의 전체적인 성능을 입증하기 위해, 스테인리스강 상의 MRSA에 대한 단차 높이 그래프의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 기질 표면과 미생물 막 사이의 표면 전위 차이를 보여줍니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 켈빈 프로브 힘 현미경(Kelvin probe force microscopy)을 사용하여 다양한 재료 기판 표면에서 전기 전하가 미생물 세포의 부착 및 활성에 미치는 영향을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.