마우스 골수 단핵구를 추적 생체

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 두 개의 광자 이미징을 사용하여 살아있는 쥐의 두개골 골수에서 단핵구 이동을 시각화하는 것입니다. 먼저, 마우스를 마취하고 부패 용액인 반추위 덱스트란을 주입하여 혈관 조직에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 마우스를 맞춤형 금속 지지대에 놓고 두정골 뒤쪽에서 전두골까지의 두피를 제거합니다.

그런 다음 고무 링을 수술용 접착제로 두개골에 직접 바르고 저장고에 액체 식염수로 채웁니다. 마지막으로, 다광자 현미경 검사는 두개골 골수 내에서 시간 경과에 따른 형광 세포 발달을 추적하는 데 사용됩니다. 이 연구는 면역혈액학 분야의 핵심 질문, 예를 들어 정상 상태에서 또는 화학요법 후 단핵구가 동원되는 메커니즘에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

따라서 이 방법은 모듈식 단핵구의 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 사용된 독감 센트 리포터의 특이성에 따라 다른 골수 세포 하위 집합을 연구하는 데 적용할 수도 있습니다. 다음 프로토콜은 티타늄 사파이어 크리스탈 레이저와 결합된 다광자 현미경 및 레이저 출력 제어를 위한 연산 변조기를 사용합니다.

3개의 형광 채널을 동시에 기록할 수 있도록 구성에는 565 나노미터 및 690 나노미터 이색성 미러, 565, 610 나노미터 및 500 550 나노미터 대역 통과 필터, 485 단역 통과 필터가 결합된 3개의 외부 비 DS 스캔 검출기 또는 nd가 포함되어야 합니다. 이 설정에서 2차 고조파 생성 또는 SHG 및 청록색 형광 단백질 또는 CFP는 485 단역 통과 필터 후 NDD에 의해 검출됩니다. CFP는 NDD에 의해서도 감지됩니다.

500 550 대역 통과 필터 및 Rod Domine Dextran 후 NDD에 의해 감지됩니다. 565 610 대역 통과 필터 후 이미징 몇 시간 전에 가열 챔버를 섭씨 32도로 설정했습니다. 이 온도는 실험 내내 마우스를 최적의 체온으로 유지합니다.

여기에 사용된 가열 챔버는 어둡고 시스템의 대물렌즈와 전동 플레이트를 덮고 있습니다. 이는 외부 빛 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다. 시스템을 켜려면 먼저 티타늄 사파이어 레이저를 켠 다음 현미경 시스템의 나머지 부분을 켭니다.

획득 소프트웨어를 실행합니다. 여기에서는 Zeiss Zen 소프트웨어가 사용됩니다. 레이저 파장 범위를 870나노미터로 설정합니다.

그런 다음 녹음에 적합한 NDD를 선택합니다. 이 실험에 사용된 마우스는 맥 블루(Mac blue)라고 불리는 형질전환 마우스로, CSF one 수용체 프로모터의 제어 하에 청록색 형광 단백질을 발현합니다. 권장되는 마취 방법은 이미징 길이에 따라 다르므로 자세한 내용은 함께 제공된 문서를 참조하는 것이 가장 좋습니다.

이 절차의 어려운 점은 T 정맥 주사인데, 정맥을 놓치기 쉽기 때문입니다. 이 경우 대신 후안와 주입을 수행하십시오. 마우스가 마취되면 니퍼를 사용하여 발판을 자극하여 의식을 잃었는지 확인합니다. 다음.

혈관 구조를 염색하려면 200 마이크로 리터의 막대 도민 덱스트란을 꼬리 정맥에 주입하거나 호중구 염색을 위해 주입하십시오. LY 6 GPE가 함유된 식염수 100마이크로리터를 주입합니다. 주사 후 현미경과 마취 가스 흡입기에 맞게 조정된 맞춤형 정위 홀더의 고정 플레이트 사이에 마우스 머리를 놓습니다.

이렇게 하면 호흡 동작이 이미징에 영향을 미치지 않습니다. 고정 플레이트를 조여 귀와 머리 사이의 피부를 늘립니다. 안정성을 확인합니다.

니퍼로 머리를 부드럽게 누르면 머리가 움직이지 않아야 합니다. 그런 다음 동물이 정상적으로 호흡하고 있는지 확인하십시오. 두 광자 이미징을 위해 마우스를 준비하려면 눈을 피하도록 주의하면서 손가락을 사용하여 두피 모발에 70% 에탄올을 바르십시오.

그런 다음 컷아웃이 있는 드레이프를 두어 두피를 노출시킵니다. 그런 다음 멸균 가위와 니퍼를 사용하여 피부를 절개하고 두정골 뒤쪽에서 전두골까지 두피를 완전히 제거합니다. 광범위한 출혈을 방지하기 위해 눈과 귀에서 3mm의 거리를 유지하십시오.

두개골을 덮고 있는 느슨한 결합 조직이나 골막을 제거합니다. 그런 다음 따뜻한 PBS에 적신 종이 타월을 사용하여 그림과 같이 남은 머리카락을 씻어냅니다. 작은 게이지 바늘을 사용하여 직경 10mm의 고무 링의 전체 주변에 수술용 접착제를 바릅니다.

그런 다음 다른 PBS에 적신 종이 타월로 고무 링을 두개골에 직접 놓습니다. 링 내부를 마지막으로 한 번 청소하십시오. 따뜻한 PBS를 넣어 두개골을 완전히 잠기게 합니다.

그런 다음 정위 홀더를 대물렌즈 아래에 놓습니다. 마우스가 제자리에 놓이면 직접 투과가 가능한 현미경 접안을 사용하여 두개골을 보고 현미경 시야에 대략적으로 배치합니다. 이미징 소프트웨어 창의 왼쪽 상단에서 Live Acquisition을 클릭합니다.

조직의 실시간 스캔은 소프트웨어의 현미경 방향 제어를 사용하여 창 중앙에 나타납니다. CFP 및 로드 도민 신호가 있는 영역을 찾아 초점을 조정합니다. 그런 다음 레이저 출력을 최소로 설정하여 광 손상을 최소화하면서 최상의 신호 대 잡음비를 얻으십시오.

그런 다음 소프트웨어에서 채널 탭을 클릭하고 각 NDD에 대한 PMT의 게인 파워를 높여 광 표백 및 광 손상을 줄인 다음 해당 탭을 클릭하여 획득 설정을 1.58마이크로초의 픽셀 체류 시간과 1.5 배율의 512 x 512 픽셀의 해상도로 단일 스캔으로 지정합니다. 기록 매개변수가 설정되면 실시간 획득 명령을 클릭하고 조직을 조사하여 실시간으로 모니터링할 원하는 x, y, Z 필드를 선택합니다. 여기서, 혈관 영역과 실질 영역을 모두 포함하는 필드가 선택됩니다.

다음으로 위치 탭에 표시된 필드의 X, Y, Z 좌표를 저장하거나 등록합니다. 추가를 클릭합니다. 최대 3개의 추가 필드에 대해 이 프로세스를 반복하여 관심 있는 모든 좌표를 등록합니다.

좌표는 소프트웨어 지시 옆의 위치 탭에 나타납니다. 3개의 DZ 이미지 스택을 캡처하려면 소프트웨어의 위치 탭에서 이동을 클릭하여 첫 번째 등록된 위치로 이동하고 소프트웨어의 왼쪽 상단 상자에서 Zack을 선택합니다. 이렇게 하면 Z 스택 탭이 열리고 가장 높은 Z 위치로 이동한 다음 그에 따라 레이저 출력이 조정됩니다.

마지막으로 설정을 클릭한 다음 가장 깊은 위치로 이동합니다. 레이저 출력을 조정합니다. 그런 다음 먼저 세트를 클릭합니다.

스택 분석의 두께는 연구된 세포에 맞게 빠르게 조정되어야 합니다. 셀을 이동하면 프랑스어로 빠르게 나가므로 더 두꺼운 스택을 획득해야 합니다. 그런 다음 느리게 움직이는 세포를 획득합니다.

왼쪽 위 상자에서 시계열 명령을 선택하여 시계열 탭을 엽니다.주기 수와 시간 간격을 설정합니다. 여기서 60 사이클 동안 30초마다 하나의 볼륨을 획득합니다.

이는 실시간으로 30분을 나타냅니다. 메인 창에서 타임랩스 이미징을 시작하려면 절차 전반에 걸쳐 실험 시작을 선택하고 동물을 계속 모니터링하여 의식이 없는지 확인합니다. 또한 목표물이 제대로 잠겨 있는지 확인하십시오.

염기서열을 캡처한 후 피펫을 사용하여 따뜻한 PBS를 추가합니다. 그런 다음 두 번째 30분 획득을 시작합니다. 수집 중에 신호가 점진적으로 사라지는 것이 보이면 PBS 누출을 확인하십시오.

필요한 모든 비디오가 녹화되고 인트라 바이탈 이미징으로 골수 생리학을 연구하기 위해 동반 문서에 설명된 대로 데이터 분석을 수행한 후 Mac blue 형질전환 마우스에 200만 개의 Dalton 막대 도민 덱스트란을 주입하고 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화했습니다. 이 비디오에서 볼 수 있듯이, 결과 현미경 사진에서 200만 개의 Dalton 막대 도민 덱스트란으로 염색된 혈관 구조는 빨간색 뼈로 표시되고, 파란색으로 표시된 것은 2차 조화 생성에 의해 시각화됩니다. 시안(cyan)으로 표시된 ECFP 양성 단핵구는 혈관 구조와 뼈 사이의 어두운 영역으로 보이는 실질 틈새(parenchymal niches) 및 혈관 내부에 위치합니다.

개별 세포 궤적을 계산하기 위해 타임 랩스 이미징을 수행했습니다. 이 비디오는 실질 단핵구의 이동 행동을 보여줍니다. ECFP 신호는 청록색이며 각 빨간색 점의 이동 경로는 녹색으로 표시됩니다.

여기에서 혈관 단핵구의 이동 행동을 볼 수 있습니다. 이러한 데이터는 셀의 평균 속도와 평균 제곱 변위를 모두 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 혈관 단핵구는 실질 단핵구에 비해 증가된 변위와 증가된 속도를 모두 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 개발 후 두 개의 사진 이미징을 사용하여 생체 내에서 마우스 골수 단핵구를 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 매우 중요한 조혈 부위를 나타내는 골수에서의 세포 이동 및 상호 작용뿐만 아니라 항원 프라이밍 및 면역학적 기억과 같은 다른 기본 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.