신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

이 프로토콜은 마이크로 조직 엔지니어링 신경망 또는 마이크로 TENN의 제작을 설명하며, 이는 관형 하이드로겔의 내강 내에서 개별 신경 세포 집단에 걸쳐 있는 길게 정렬된 축삭 관으로 구성된 소형 3차원 구조입니다. Micro-TENN은 뇌 커넥톰의 일반적인 시스템 수준 해부학, 특히 긴 축삭관으로 연결된 기능적으로 유사한 뉴런 그룹을 복제합니다. micro-TENN은 뇌 경로의 세포 구조를 모방하기 위해 미리 성장했기 때문에 외상 또는 신경 퇴행성 질환으로 인해 손실된 신경 회로의 표적 재구성 및 신경생물학 연구를 위한 생체 모델로 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 미크론 스케일 폼 팩터로 작업하는 것인데, 이는 궁극적으로 뇌로의 최소 침습적 전달을 허용하는 데 필요합니다. 먼저 유리 모세관 튜브를 2-2.5cm 조각으로 수동으로 부수고 각 조각에 하나의 침을 삽입합니다. DPBS의 3% 아가로스 1ml를 빈 페트리 접시의 표면으로 옮깁니다.

도입된 바늘에 모세관 튜브를 잡고 튜브의 한쪽 끝을 액체 아가로스 풀과 접촉시켜 모세관 작용으로 채웁니다. 액체가 상승을 멈추면 수영장에서 모세관 튜브를 제거하고 페트리 접시 표면에 수평으로 놓습니다. 그런 다음 엄지와 검지를 튜브의 양쪽에 놓고 단단히 잡습니다.

다른 손을 사용하여 바늘을 빠르게 당겨 빼내고 엄지와 검지는 마이크로 컬럼 자체가 튜브에서 미끄러지는 것을 방지합니다. 그런 다음 30게이지 바늘을 모세관 튜브에 삽입하여 마이크로 컬럼을 DPBS가 들어 있는 접시로 천천히 밀어 넣습니다. 미세한 집게를 사용하여 DPBS에서 하나의 마이크로 컬럼을 빈 접시로 조심스럽게 옮깁니다.

건조를 방지하기 위해 마이크로피펫을 사용하여 10마이크로리터의 DPBS를 마이크로 컬럼 상단에 추가합니다. 실체 현미경 아래에서 작업하는 동안 마이크로 메스로 마이크로 컬럼을 트립하여 원하는 길이로 줄입니다. 그런 다음 미세한 집게를 사용하여 트리밍된 마이크로 컬럼을 DBPS가 포함된 다른 페트리 접시로 옮깁니다.

DPBS가 함유된 페트리 접시의 마이크로 컬럼을 자외선 아래에서 30분 동안 살균합니다. 드릴 비트를 사용하여 16cm 페트리 접시 뚜껑에 1cm 간격으로 4cm 4 x 10 배열로 16개의 구멍을 뚫습니다. 화학 흄 후드 내부에서 페트리 접시의 바닥 부분을 사용하여 PDMS 27g과 경화제 3g의 무게를 잰다.

마이크로 주걱으로 저어 약제를 고르게 분배합니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 뚜껑으로 PDMS 경화제를 덮습니다. 호스의 한쪽 끝을 흄 후드의 진공 포트에 연결하고 다른 쪽 끝을 적절한 크기의 깔때기 줄기에 삽입합니다.

1ml 팁에 1ml 피펫 전구를 호스에 넣고 전구가 호스를 깔때기 줄기에 밀봉할 때까지 호스를 위로 당깁니다. 다음으로, 구멍이 뚫린 접시 뚜껑에 깔때기를 놓고 사용 가능한 견고한 지지대로 호스를 고정합니다. 진공 밸브를 5분 동안 열어 흡입하고 기포를 표면으로 가져옵니다.

5분 후 밸브를 닫고 깔때기를 제거한 다음 페트리 접시를 흄 후드 표면에 몇 번 두드려 남아 있는 기포를 터뜨립니다. 피라미드 모양의 3D 프린팅된 금형을 피라미드가 위를 향하게 하는 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 놓습니다. 그런 다음 플레이트의 각 웰이 채워질 때까지 금형 위에 PDMS 경화제를 붓습니다.

뚜껑을 덮은 접시를 섭씨 60도에서 1시간 동안 오븐에 옮겨 건조시킵니다. 고압증기멸균으로 PDMS 어레이를 멸균하고 생물 안전 캐비닛에서 작업한 후 멸균 12웰 플레이트의 각 웰에 하나의 마이크로 웰 어레이를 삽입합니다. 뉴런 응집체를 형성하려면 마이크로피펫을 사용하여 12마이크로리터의 세포 현탁액을 PDMS 어레이의 각 마이크로 웰에 추가합니다.

플레이트를 200배 g에서 5분 동안 원심분리하여 마이크로 웰 바닥에 있는 세포의 응집을 강제합니다. 그런 다음 각 PDMS 어레이의 상단에 약 2ml의 배양 배지를 조심스럽게 추가하여 파종된 모든 마이크로웰을 덮습니다. 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 플레이트를 5% 이산화탄소로 배양합니다.

CEM 코어 제작을 시작하려면 마이크로 원심분리기 튜브에 Type 1 콜라겐, 라미닌 및 배양 배지를 혼합하고 pH를 7.2에서 7.4로 조정합니다. 그런 다음 CEM이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 멸균 집게를 사용하여 마이크로 컬럼을 옮겨 35mm 또는 60mm 페트리 접시를 비웁니다.

그런 다음 실체 현미경으로 작업하는 동안 1000마이크로리터 팁에 부착된 1000마이크로리터 팁을 사용하여 루멘에서 잔류 DPBS와 기포를 추출합니다. 마이크로피펫에 4-5마이크로리터의 CEM을 빠르게 추출한 다음 마이크로피펫의 끝을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 놓고 루멘을 채우기에 충분한 CEM을 배출합니다. 탈수를 방지하려면 각 마이크로 컬럼 주위에 2마이크로리터의 CEM을 추가합니다.

하이드로겔 CEM 마이크로 컬럼을 섭씨 37도의 페트리 접시에 5% 이산화탄소에서 15분 동안 배양합니다. 배양 직후 세포 파종을 진행하십시오. 약 10-20 마이크로 리터의 배양 배지를 마이크로 컬럼을 고정하는 페트리 접시에서 2 개의 자유 영역으로 이동합니다.

마이크로피펫을 사용하여 신경 세포 응집체를 개별적으로 수집하고 구조체가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 세포 건강을 보존하기 위해 겸자로 응집체를 배양 배지의 작은 풀 중 하나로 이동합니다. 실체 현미경으로 관찰하는 동안 겸자를 사용하여 단방향 마이크로 TENN의 경우 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 골재를 삽입하거나 양방향 아키텍처의 경우 양쪽 끝에 골재를 삽입합니다.

그런 다음 시드된 마이크로 컬럼을 배양 배지의 다른 작은 풀로 이동하여 탈수를 방지하고 골재 건강을 보존합니다. 모든 마이크로 컬럼이 로드되면 응집체가 CEM에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 넣고 45분 동안 배양합니다. 배양 후 실체현미경을 사용하여 응집체가 마이크로 컬럼의 끝에 남아 있는지 확인합니다.

마지막으로, 피펫을 사용하여 micro-TENNs가 들어있는 페트리 접시에 배양 배지를 조심스럽게 주입합니다. 장기 배양을 위해 섭씨 37도의 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 넣으십시오. 이 위상차 이미지는 체외에서 최대 8일까지 단방향 2밀리리터 길이의 micro-TENN을 보여줍니다.

이 이미지에서, 정렬된 축삭관(axonal tracts)이 내강을 가로질러 돌출되는 동안 마이크로 기둥(micro-column)의 극단에 있는 뉴런 응집체(neuronal aggregates)를 볼 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 축삭관은 시험관 내에서 5일까지 마이크로 기둥의 거의 전체 길이를 연장합니다. 5mm 양방향 micro-TENN의 경우, 축삭돌기는 시험관 5일에서 마이크로 컬럼의 길이를 채우고 이 구조는 적어도 시험관 내 10일까지 유지됩니다.

다음 두 이미지는 절차의 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 이미지는 제조 중 DPBS, CEM 또는 배양 배지의 완전한 제거 및/또는 증발로 인해 완전히 탈수된 건조 하이드로겔 마이크로 컬럼을 보여줍니다. 이 이미지는 침술과 모세혈관의 동심원 정렬이 부족하기 때문에 외벽을 감싸고 있는 내강이 있는 마이크로 기둥을 보여줍니다.

마지막으로, 이 컨포칼 이미지는 체외 28일 시점에 Hoechst로 염색된 세포핵이 파란색으로, tudge 1로 표시된 축삭돌기가 빨간색으로, synapsin 1로 녹색으로 표시된 시냅스 전 부톤으로 염색된 양방향 micro-TENN을 보여줍니다. 축삭 관을 따라 있는 응집체로부터의 세포 이동은 제안된 바와 같이 시냅스전 말단의 존재에서 볼 수 있습니다. Micro-TENN은 커넥톰 세포 구조(connectome cytoarchitecture)의 주요 측면을 에뮬레이트하는 독립적이고 해부학적으로 영감을 받은 구조입니다. 따라서 마이크로 TENN은 뇌에 이식될 때 손실된 신경 경로를 대체하는 수단을 제공할 수 있습니다.

이 방법의 중요한 구성 요소에는 종방향 축삭 성장을 허용하는 관형 생체 물질 케이스 체계와 내부를 따라 축삭 관의 끝으로 제한된 세포체의 적절한 세포 구조를 얻을 수 있는 응집체 방법이 포함됩니다. 이러한 방법을 숙달한 후 이 기술의 원리는 특정 응용 프로그램에 따라 다른 세포 표현형 및 생체 재료 구성 요소를 가진 micro-TENN을 구축하는 데 적용될 수 있습니다.