신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

본 프로토콜에서는 마이크로 조직 공학 신경망(micro-tissue engineered neural networks, micro-TENNs)의 제작 방법을 설명합니다. micro-TENN은 관형 하이드로젤의 루멘 내에서 서로 떨어진 신경 세포군을 가로지르는 길게 정렬된 축삭 다발로 구성된 소형 3차원 구조체입니다. micro-TENN은 뇌 커넥톰의 일반적인 시스템 수준 해부학적 구조, 특히 긴 축삭 다발로 연결된 기능적으로 유사한 신경 세포군을 재현합니다. 뇌 경로의 세포 구조를 모방하여 사전 배양되었기 때문에, micro-TENN은 외상이나 신경퇴행성 질환으로 인해 손실된 신경 회로의 표적 재건 및 신경생물학 연구를 위한 생체 충실도 모델로 응용될 수 있습니다.

이 프로토콜에서 가장 까다로운 부분 중 하나는 뇌로의 최소 침습적 전달을 위해 필수적인 마이크론 규모의 폼 팩터를 다루는 것입니다. 먼저 유리 모세관을 2~2.5cm 길이의 조각으로 수동으로 분쇄한 다음, 각 조각에 침 acupuncture needle 하나씩을 삽입하십시오. DPBS에 희석된 3% agarose 1mL를 빈 페트리 접시 표면에 옮기십시오.

도입된 니들에 모세관을 고정한 후, 관의 한쪽 끝을 액체 아가로스 풀에 접촉시켜 모세관 현상으로 채웁니다. 액체가 더 이상 올라오지 않으면 모세관을 풀에서 꺼내 페트리 접시 표면에 수평으로 놓습니다. 그다음, 엄지와 검지를 관의 양옆에 대고 단단히 잡습니다.

다른 한 손으로 바늘을 빠르게 뽑아내면서, 엄지와 검지로 마이크로 컬럼 자체가 튜브 밖으로 미끄러져 나오지 않도록 고정합니다. 그 다음, 모세관에 30-gauge 바늘을 삽입하여 마이크로 컬럼을 DPBS가 담긴 디쉬 안으로 천천히 밀어냅니다. 미세 핀셋을 사용하여 DPBS에서 빈 디쉬로 마이크로 컬럼 하나를 조심스럽게 옮깁니다.

건조를 방지하기 위해 마이크로피펫을 사용하여 마이크로 컬럼 상단에 DPBS 10 µL를 추가합니다. 실체 현미경 하에서 마이크로 메스로 마이크로 컬럼을 잘라 원하는 길이로 짧게 만듭니다. 그런 다음 정밀 핀셋을 사용하여 다듬어진 마이크로 컬럼을 DBPS가 담긴 다른 페트리 접시로 옮깁니다.

DPBS가 포함된 페트리 접시 내의 마이크로 컬럼을 자외선 램프 아래에서 30분 동안 멸균합니다. 드릴 비트를 사용하여 10cm 페트리 접시 뚜껑에 1cm 간격의 4x4 배열로 4cm 크기의 구멍 16개를 뚫습니다. 화학 흄 후드 내에서 페트리 접시 바닥 부분을 사용하여 PDMS 27g과 경화제 3g을 무게 측정합니다.

마이크로 스패튤라로 저어 시약이 고르게 분산되도록 합니다. 그런 다음 구멍을 뚫은 뚜껑으로 PDMS 경화제를 덮습니다. 호스의 한쪽 끝을 흄 후드의 진공 포트에 연결하고, 반대쪽 끝을 적절한 크기의 깔때기 줄기에 삽입합니다.

1mL 피펫 팁에 1mL 피펫 벌브를 끼워 호스에 넣고, 벌브가 깔때기 줄기와 호스를 밀폐시킬 때까지 호스를 위로 당깁니다. 다음으로, 구멍이 뚫린 배양 접시 뚜껑 위에 깔때기를 올리고 가용한 튼튼한 지지대로 호스를 고정합니다. 진공 밸브를 5분 동안 열어 흡입함으로써 기포를 표면으로 끌어올립니다.

5분 후, 밸브를 닫고 깔때기를 제거한 다음, 남아 있는 기포를 제거하기 위해 페트리 접시를 흄 후드 표면에 몇 번 가볍게 칩니다. 12-웰 배양 플레이트의 각 웰에 피라미드형 웰 3D 프린팅 몰드를 피라미드 끝이 위를 향하도록 배치합니다. 그런 다음 플레이트의 각 웰이 가득 찰 때까지 몰드 위에 PDMS 경화제를 붓습니다.

덮개가 덮인 플레이트를 60°C 오븐에 1시간 동안 넣어 건조시킵니다. 오토클레이브로 PDMS 어레이를 멸균한 후, 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 멸균된 12-well 플레이트의 각 웰에 마이크로웰 어레이를 하나씩 삽입합니다. 신경 세포 응집체를 형성하기 위해, 마이크로피펫을 사용하여 PDMS 어레이의 각 마이크로웰에 세포 현탁액 12 µL를 첨가합니다.

마이크로웰 바닥에 세포가 응집되도록 플레이트를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 파종된 모든 마이크로웰이 덮이도록 각 PDMS 어레이 상단에 약 2 mL의 배지를 조심스럽게 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 12~24시간 동안 배양합니다.

CEM 코어 제작을 시작하려면, 마이크로 원심분리 튜브에 Type 1 collagen, laminin 및 배양액을 혼합하고 pH를 7.2에서 7.4로 조정합니다. 그런 다음 CEM이 들어 있는 튜브를 얼음에 둡니다. 멸균 핀셋을 사용하여 마이크로 컬럼을 빈 35 또는 60mm 페트리 접시에 옮깁니다.

그 다음, 실체현미경 하에서 1000 µL 팁에 10 µL 팁을 연결하여 루멘 내의 잔류 DPBS와 공기 방울을 제거합니다. 마이크로피펫으로 4~5 µL의 CEM을 빠르게 흡입한 후, 마이크로피펫 팁을 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에 배치하고 루멘을 채울 수 있을 만큼의 CEM을 분주합니다. 탈수를 방지하기 위해 각 마이크로 컬럼 주변에 2 µL의 CEM을 추가합니다.

하이드로젤 CEM 마이크로 컬럼이 담긴 페트리 접시를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 15분 동안 배양합니다. 배양 직후 세포 시딩을 진행하십시오. 마이크로 컬럼이 들어 있는 페트리 접시의 빈 공간 두 곳에 약 10~20 µL의 배양액을 옮겨 담습니다.

마이크로피펫을 사용하여 신경 세포 응집체를 개별적으로 수집하고, 이를 구조물이 포함된 페트리 접시에 옮깁니다. 세포의 건강 상태를 유지하기 위해 핀셋을 이용하여 응집체를 배양액의 작은 웅덩이 중 하나로 이동시킵니다. 실체현미경으로 관찰하면서, 단방향 micro-TENNs의 경우에는 마이크로 컬럼의 한쪽 끝에, 양방향 구조의 경우에는 양쪽 끝에 핀셋을 사용하여 응집체를 삽입합니다.

그런 다음, 탈수를 방지하고 응집체의 상태를 유지하기 위해 세포가 접종된 마이크로 컬럼을 배지가 담긴 다른 작은 풀로 옮깁니다. 모든 마이크로 컬럼의 로딩이 완료되면, 응집체가 CEM에 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후, 실체현미경을 사용하여 응집체가 마이크로 컬럼의 끝부분에 그대로 남아 있는지 확인합니다.

마지막으로, 피펫을 사용하여 micro-TENNs가 포함된 페트리 접시에 배양액을 조심스럽게 가득 채웁니다. 접시를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 넣어 장기 배양합니다. 이 위상차 현미경 이미지들은 체외(in-vitro)에서 최대 8일 동안 배양된 2 mm 길이의 단방향 micro-TENNs를 보여줍니다.

이 이미지들에서 마이크로 컬럼의 양 끝단에 위치한 신경세포 응집체와 루멘을 가로질러 투사된 정렬된 축삭 다발을 확인하십시오. 여기서 보는 바와 같이, 축삭 다발은 인비트로(in-vitro) 5일 차에 마이크로 컬럼의 거의 전체 길이에 걸쳐 연장됩니다. 5mm 양방향 마이크로-TENN의 경우, 인비트로 5일 차에 축삭 다발이 마이크로 컬럼의 길이를 채우며, 이러한 구조는 적어도 인비트로 10일 차까지 유지됩니다.

다음 두 이미지는 실험 절차상의 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 이미지는 제작 과정 중 DPBS, CEM 또는 배양액이 완전히 제거되거나 증발하여 완전히 탈수된 건조 하이드로겔 마이크로 컬럼을 보여줍니다. 이 이미지는 침 acupuncture needle과 모세관 capillary tube의 동심원 정렬이 이루어지지 않아 루멘이 외벽에 치우쳐 형성된 마이크로 컬럼을 보여줍니다.

마지막으로, 이 공초점 이미지(confocal image)는 인비트로(in-vitro) 28일 차의 양방향 micro-TENN을 보여주며, 세포핵은 파란색 Hoechst로, 축삭은 빨간색 tudge one으로, 그리고 시냅스 전 버튼(pre-synaptic boutons)은 초록색 synapsin 1로 염색되었습니다. 제시된 바와 같이 시냅스 전 말단(pre-synaptic terminals)이 존재하는 상황에서 응집체로부터 축삭 경로를 따라 세포 이동이 일어나는 것을 확인할 수 있습니다. Micro-TENN은 커넥톰 세포 구조(connectome cytoarchitecture)의 핵심적인 측면을 모사하도록 해부학적 영감을 받아 설계된 독립형 구조체입니다. 따라서 micro-TENN은 뇌에 이식되었을 때 손실된 신경 경로를 대체하는 수단이 될 수 있습니다.

이 방법의 핵심 구성 요소에는 축삭의 종방향 성장을 가능하게 하는 관형 생체 재료 외피 방식과, 내부를 따라 축삭 경로의 끝부분에만 세포체가 제한되어 적절한 세포 구조를 얻을 수 있도록 하는 응집 방법이 포함됩니다. 이러한 방법들을 숙달한 후에는 특정 응용 분야에 따라 다른 세포 표현형 및 생체 재료 구성 성분을 사용하여 micro-TENN을 구축하는 데 이 기술의 원리를 적용할 수 있습니다.