갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

본 절차의 전반적인 목표는 약리제에 반응하여 나타나는 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것입니다. 갓 분리한 사구체 전체의 일부로서 족세포의 기저 칼슘 수치를 추정하고 개별 채널 활성을 평가합니다. 이는 먼저 복부 대동맥을 통한 세척으로 쥐 신장의 혈액을 제거함으로써 수행됩니다.

다음으로, 신장을 적출하고 신장 피질을 분리한 후 면도날로 잘게 다집니다. 세 번째 단계에서는 차등 원심분리를 통해 피질 사구체를 분리합니다. 이후, 분리된 무혈관 사구체를 전기생리학적 실험에 사용하거나 형광 염료를 주입하여 공초점 칼슘 농도 측정에 사용할 수 있습니다.

궁극적으로, 이러한 절차를 통해 연구자들은 다양한 약제 처리에 반응하여 세포 내 칼슘 핸들링에서 일어나는 급격한 변화를 분석하고, 단일 이온 채널 수준에서 칼슘 전도도를 평가 및 조절할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 분리된 전체 사구체 일부로서 족세포를 연구할 수 있다는 점입니다. 본 준비법은 족세포의 기능적 잠재력을 유지합니다.

이들은 모세혈관에 부착된 상태를 유지하며, 실제로 사구체 여과 장치의 주요 부분을 보존할 수 있는 환경의 항상성에 참여합니다. 이 기술의 함의는 당뇨성 신증, 국소 분절 사구체 경화증 또는 고혈압과 같은 질환에서 신장 합병증의 발생 및 예방에 있어 족세포의 칼슘 처리 메커니즘이 수행하는 필수적인 조절 역할로 인해, 정상 및 병리 상태에서의 약물 스크리닝 범위를 확장합니다. 따라서 이러한 세포에서 약물에 대한 칼슘 유입의 반응성을 관찰하는 것은 매우 중요하며, 이는 용이하게 스크리닝될 수 있습니다.

본 준비 과정에서 VLA Hunka는 이후 절차를 위해 신장을 세척하는 방법을 시연하겠습니다. 저는 사구체 분리와 V 클램프 전기생리학을 보여줄 것이며, Dr.GaN이 공초점 칼슘 이미징 과정을 안내할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐를 온도 조절 수술대 위에 놓으십시오. 현미경 하에서 복부 중앙을 절개하여 하대정맥(CVA)과 대동맥을 노출시킵니다.

다음으로, 복강동맥과 상장간막동맥, 그리고 그 위쪽의 복부 대동맥 주위에 결찰사를 삽입합니다. 신동맥 아래쪽의 복부 대동맥을 둔성 박리합니다. 그런 다음 그 주위에 결찰사 두 개를 배치하되, 결찰하지는 않습니다.

결찰사 위쪽의 대동맥을 클램프로 고정하고 아래쪽 실을 묶습니다. 그 후, 클램프 아래쪽에서 PBS가 채워진 시린지 펌프에 연결된 폴리에틸렌 튜브로 대동맥에 카테터를 삽입하고, 두 번째 결찰사로 카테터를 고정합니다. 그런 다음 클램프를 제거하고 결찰합니다.

장간막 동맥과 복강 동맥을 측정합니다. 대동맥에 미리 냉각시킨 PBS를 분당 6 mL의 속도로 3분 동안 주입합니다. 동시에, 압력을 완화하기 위해 신정맥 근처의 하대정맥을 절개합니다.

3분 후, 관류를 중단하고 신장을 절제하여 캡슐에 담습니다. 이를 얼음 위에 놓인 PBS 용액에 넣습니다. 이제 RPMI 1640 배지에 신선한 5%BSA 30 milliliters를 준비합니다.

면도날과 가위를 사용하여 양쪽 신장의 피질을 분리한 후, 균질해질 때까지 세절합니다. 다음으로, 5% P-S-A-R-P-M-I 용액에 미리 적셔둔 100 mesh 스테인리스 스틸 체에 세절된 조직을 밀어 넣습니다. 통과한 액체를 수집하여 140 mesh 체에 한 번 더 통과시킵니다.

그 후, 미리 적셔둔 200 mesh 체를 사용하여 140 mesh 체에서 수집된 여과액을 필터링합니다. 여과액은 버리고, 상단 체를 준비된 B-S-A-R-P-M-I 용액 10 to 15 milliliters로 세척하여 체 상단에서 사구체를 수집합니다. 다음으로 사구체가 포함된 B-S-A-R-P-M-I 용액을 15 milliliter 원심분리관에 넣고, 사구체가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 최대 20분 동안 방치합니다.

본 절차에서는 5x5 mm 커버 글라스 칩을 분자량 70,000~150,000의 poly lysine으로 코팅한 후 가열 플레이트 위에서 건조합니다. 다음으로, 실험 용액을 상온으로 데우고 패치 클램프 챔버와 피펫을 채웁니다. 사구체가 포함된 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음, polylysine이 코팅된 각 커버 글라스 칩에 해당 용액을 약 50 µL씩 도포합니다.

그 후, 사구체가 포함된 유리 칩을 Beth 용액이 미리 채워진 패치 클램프 챔버로 옮깁니다. 세포 부착 모드(cell attached mode)로 일반적인 패치 클램프 기록을 수행하기 전, 3 mL/min의 속도로 1분 동안 챔버를 관류하여 부착되지 않은 사구체를 제거합니다.

이제 각 0.5 milliliter 원추형 튜브에 사구체 분획 500 microliters를 넣고 칼슘 염료인 pure red am과 flu oh 4:00 AM을 첨가합니다. 다음으로, 튜브를 회전 쉐이커에 올리고 상온에서 최대 1시간 동안 반응시킵니다. 그동안 유리 커버슬립을 polylysine으로 처리하고 70 degrees Celsius의 가열 플레이트 위에서 건조시킵니다. 칼슘 염료의 로딩이 완료되면, polylysine이 코팅된 커버슬립에 사구체가 포함된 용액 100 microliters를 도포하고 약 5분 동안 표면에 부착되도록 둡니다.

그런 다음 사구체가 부착된 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하고, 분당 3 mL의 속도로 배스 용액을 관류하여 부착되지 않은 사구체와 남아 있는 염료를 제거합니다. 이후 공초점 레이저 주사 현미경의 들뜸 파장을 488 nm로 설정합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어에서 원하는 주파수와 해상도를 설정합니다.

다음으로, 명시야(brightfield)에서 사구체를 찾습니다. 이어서 형광 신호 검출 기능을 켭니다. 그 후, 원하는 초점 평면을 선택하고 flu oh four 및 firo red 채널에서 형광 강도를 확인합니다.

명시야(brightfield)에서 사구체가 명확하게 보이는지 확인하십시오. 그 다음 flu oh four 및 furor red 신호의 형광 강도 변화를 기록하십시오. 이미지 시퀀스를 가져오려면 채널을 분리하고 하이퍼스택 그레이스케일(hyper stack gray scale) 모드를 사용하십시오.

Image J 소프트웨어에서 analyze tools, ROI Manager 경로를 통해 ROI manager 창을 엽니다. oval selection 도구와 ROI manager의 add T 기능을 사용하여 하나 이상의 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 그런 다음 배경 영역을 선택하고 선택한 ROI들을 저장합니다.

다음으로, 대화 상자에서 슬라이스당 한 행(one row per slice) 확인란을 선택하고 메뉴 옵션 결과에서 확인을 클릭합니다. 측정 항목을 설정합니다. 평균 회색값(mean gray value)을 선택하면 각 ROI에 대한 픽셀 강도 값이 계산되며, 이는 결과 창에 별도의 열로 표시됩니다.

그 다음 각 ROI에 대해 각 채널에서 측정된 ROI 강도 값을 선호하는 데이터 분석 소프트웨어로 복사하고, 각 시간 지점의 각 데이터 포인트에서 배경 강도 값을 뺍니다. 이후 flu oh four와 URA red 채널의 강도 비율을 계산한 다음, 각 ROI에 대한 칼슘 과도 현상의 시간 경과 변화를 그래프로 나타냅니다. 이 이미지는 쥐 사구체 표면의 산화물 바디에 부착된 패치 클램프 피펫을 보여줍니다.

전기생리학적 기록 중에 이미지의 오른쪽 하단 모서리에서 캡슐화된 사구체의 일부를 확인할 수 있습니다. 여기 세포 부착 패치를 통해 족세포(podocyte)에서 측정된 세포 내 칼슘 농도의 TRP 유사 채널 활성을 나타내는 대표적인 전류 트레이스가 제시되어 있습니다. 세포 내 칼슘을 표지하기 위해 사구체에 Fluo-4 AM을 로딩하였습니다.

이 영상은 사구체 내 칼슘 유입에 미치는 CIN과 염화 망간의 영향을 보여줍니다. 이 그래프는 CIN과 염화 망간에 반응하여 단일 족세포에서 기록된 flu oh four 신호 강도의 변화를 정량화한 것입니다. 예상대로 CIN은 최대 형광을 생성하며, 염화 망간은 염료를 소광시켜 가장 낮은 형광 강도를 나타냅니다.

이러한 약물을 처리하면 연구자가 나중에 세포 내의 정확한 칼슘 농도를 정의할 수 있습니다. 이 영상은 10 µM a TP가 사구체의 칼슘 농도에 미치는 영향을 보여줍니다. 녹색 Fluo-4 형광은 증가하고 적색 FuRed 형광은 감소하며, 이는 세포 내 칼슘 농도의 증가를 나타냅니다.

이 기술은 약물 처리나 기타 조작 후 단일 이온 통로 및 개별 세포 수준에서 칼슘 유입의 변화를 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 사용 가능한 다양한 유전자 변형 설치류 모델을 고려할 때 매우 강력한 도구가 됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단독으로 또는 전기생리학적 전압 클램프 실험과 함께 사용하여 포도사이트에서 칼슘 농도 측정을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 기술들은 정상 및 병리적 상태에서 족세포(podocyte)의 칼슘 처리 조절에 대한 심층적이고 기전적인 통찰을 제공합니다.