갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 약리학적 제제에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것입니다. 칼슘의 기초 수준을 추정하고 갓 분리된 사구체 전체의 일부로 podocytes의 개별 채널 활동을 평가합니다. 이것은 먼저 복부 대동맥을 통해 씻어내어 쥐의 신장에서 혈액을 제거함으로써 이루어집니다.

다음으로, 신장을 적출하고 신장 피질을 분리하여 면도날로 다집니다. 세 번째 단계에서, 피질 사구체는 차등 cing에 의해 격리됩니다. 그 후, 분리된 참수된 사구체는 전기생리학적 실험을 받거나 형광 염료를 주입하여 공초점 칼슘 농도 측정을 위해 취할 수 있습니다.

궁극적으로 이러한 절차를 통해 연구자들은 다양한 제제의 적용에 대응하여 세포 내 칼슘 처리의 급격한 변화를 해결하고 단일 이온 채널 수준에서 칼슘 전도도를 평가 및 조작할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전체 고립된 사구체의 일부로 podocytes를 연구할 수 있다는 것입니다. 우리의 제제는 podocytes의 기능적 잠재력을 유지합니다.

그들은 모세혈관에 부착된 상태를 유지하고 실제로 사구체 여과 장치의 주요 부분을 보존할 수 있는 환경에서 항상성에 참여합니다. 이 기술의 의미는 우리의 약리학적 스크리닝을 확장합니다 정상 및 병리학적 상태에서, podocytes에 의한 칼슘 처리 메커니즘은 당뇨병성 신병증, 국소 분절 오메로 경화증 또는 고혈압과 같은 질병에서 신장 합병증의 발병 및 예방에 필수적인 조절 역할을 합니다. 이러한 세포의 칼슘 유입이 쉽게 스크리닝할 수 있는 약물에 대한 반응성을 관찰하는 것은 매우 중요합니다.

이 준비에서 VLA Hunka는 다음 절차에 대해 신장을 세척하는 방법을 시연합니다. 사구체 분리와 V 클램프 전기생리학을 보여드리고, Dr.GaN이 컨포칼 칼슘 이미징을 안내해 드릴 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐를 온도 조절 수술 테이블에 놓고 현미경으로 복부를 정중선으로 절개하여 정맥 CVA와 대동맥을 드러냅니다.

다음으로, 복강 동맥과 상장간막 동맥 및 그 위의 복부 대동맥 주위에 결찰을 삽입합니다. 무뚝뚝하고 신장 동맥 아래의 복부 대동맥을 절개합니다. 그런 다음 주위에 두 개의 합자를 놓되 접합하지 마십시오.

대동맥을 합자 위에 고정하고 아래쪽 실을 묶습니다. 그 후, 클램프 아래에 PBS로 채워진 주사기 펌프에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 대동맥을 카테터화하고 두 번째 결찰로 카테터를 고정합니다. 그런 다음 클램프를 제거하고 접합합니다.

나 장 동맥과 체강 동맥. 대동맥에 미리 냉각된 PBS를 분당 6ml의 속도로 3분 동안 주입합니다. 동시에 신장 정맥 근처의 충치 정맥을 절개하여 압력을 완화합니다.

3분 후 관류를 중지하고 신장을 절제하고 캡슐화합니다. 얼음 위의 PBS 용액에 넣으십시오. 이제 RPMI 1640 배지에서 30ml의 신선한 5%BSA를 준비합니다.

면도날과 가위를 사용하여 양쪽 신장의 피질을 분리한 다음 균질해질 때까지 MIT를 수행합니다. 다음으로, 5%P-S-A-R-P-M-I 용액에 미리 적신 100메쉬 스테인리스강 체를 통해 다진 조직을 밀어 넣습니다. 흐름을 수집하고 140 메쉬 시브를 통과하도록 합니다.

그런 다음 미리 담근 200 메쉬 siv를 사용하여 140 메쉬 체에서 수집 된 흐름을 필터링합니다. 여과액을 버리고 준비된 B-S-A-R-P-M-I 용액 10-15 밀리리터로 상부 체를 세척하고 체 상단에서 사구체를 수집합니다. 다음으로 G 글로머룰리가 함유된 B-S-A-R-P-M-I 용액을 15ml, 2개의 본 아이스에 넣고 사구체 침전물을 튜브 바닥에 최대 20분 동안 둡니다.

이 절차에서는, 분자량, 70, 000에서 150, 000 많은 lysine로 5 x 5 밀리미터 덮개 유리 칩을 입히고 격렬한 판에 말리십시오. 다음으로, 실험 용액을 실온으로 예열하고 패치 클램프 챔버와 피펫을 채우고 사구체 함유 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 약 50마이크로리터를 각 폴리리신 코팅 커버 유리 칩에 도포합니다.

그 후, 사구체가 있는 유리 칩을 패치 클램프 챔버로 이동합니다. Beth 솔루션으로 미리 채워져 있습니다. 1분 동안 분당 3밀리리터의 속도로 챔버를 관류하여 부착되지 않은 사구체를 제거한 후 셀 부착 모드에서 기존 패치 클램프 기록을 수행합니다.

이제 각 0.5 밀리리터 원뿔형 튜브에 500 마이크로 리터의 사구체 분획을 넣고 칼슘 염료 순수 적색 오전과 독감 오 4:00 AM을 추가합니다. 다음으로, 튜브를 실온에서 최대 1시간 동안 회전하는 셰이커에 놓습니다. 그런 다음 폴리리신으로 유리 커버 슬립을 준비하고 섭씨 70도의 가열된 플레이트에서 건조시킵니다. 칼슘 로딩이 완료되면 사구체 함유 용액 100마이크로리터를 폴리리신으로 코팅된 커버 슬립에 바르고 약 5분 동안 표면에 붙도록 합니다.

그런 다음 사구체에 부착된 커버 슬립을 이미징 챔버에 장착하고 분당 3ml의 속도로 수조 용액을 관류하여 부착되지 않은 사구체와 남아 있는 염료를 제거합니다. 그런 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 488 나노미터 여기 파장으로 설정합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 원하는 주파수와 해상도로 설정합니다.

다음으로, 명시야에서 사구체를 찾습니다. 그런 다음 형광 신호 감지를 켭니다. 그런 다음 원하는 초점면을 선택하고 flu oh four 및 firo red 채널의 형광 강도를 확인하십시오.

사구체가 명시야에서 명확하게 보이는지 확인하십시오. 그런 다음 독감 oh four 및 furor red 신호에 대한 형광 강도의 변화를 기록합니다. 이미지 시퀀스를 가져오려면 채널을 분할하고 하이퍼 스택 그레이 스케일 모드를 사용합니다.

Image J 소프트웨어에서 분석 도구, ROI 관리자 경로 다음에 있는 ROI 관리자 창을 엽니다. 타원형 선택 도구를 사용하여 하나 이상의 관심 영역을 선택하고 ROI 관리자에서 T 추가 기능을 선택합니다. 그런 다음 배경에서 영역을 선택하고 선택한 ROI를 저장합니다.

그런 다음 대화 상자에서 슬라이스당 한 행 상자를 표시하고 메뉴 옵션 결과에서 확인을 클릭합니다. 측정값을 설정합니다. 평균 회색 값을 선택하고 각 ROI에 대한 픽셀 강도 값을 계산하면 결과 창에서 별도의 열로 표시됩니다.

그런 다음 각 ROI에 대해 각 채널에 대해 측정된 ROI 강도 값을 선호하는 데이터 분석 소프트웨어에 복사하고 각 시점의 각 데이터 포인트에서 배경 강도 값을 뺍니다. 해당 플롯 후 독감 오 4 대 URA 적색 채널의 강도 비율을 계산하고, 각 ROI에 대한 칼슘 과도 현상의 포인트 타임 변화를 계산합니다. 이 이미지는 쥐 사구체 표면의 산화물 본체에 부착된 패치 클램프 피펫을 보여줍니다.

전기생리학적 기록 중에 캡슐화된 사구체의 일부가 이미지의 오른쪽 하단 모서리에서 볼 수 있습니다. 다음은 세포 내 칼슘 농도를 측정하기 위해 podocyte에 부착된 패치로 만든 세포 부착 패치의 트리피와 같은 채널 활동의 대표적인 현재 추적입니다. 사구체는 독감 오 4:00 AM으로 가득 차서 세포 내 칼슘을 표시합니다.

이 비디오는 사구체의 칼슘 유입에 대한 CIN과 염화망간의 영향을 보여줍니다. 이 그래프는 CIN 및 염화망간에 대한 반응으로 단일 포도사이트(podocyte)에서 기록된 독감 oh four 신호 강도의 변화를 정량화합니다. 예상대로 CIN은 최대 형광을 생성하고 염화망간은 염료를 소멸시켜 가장 낮은 형광 강도를 생성합니다.

이러한 약물을 적용하면 연구자는 나중에 세포 내의 정확한 칼슘 농도를 정의할 수 있습니다. 이 비디오는 10마이크로몰 TP가 사구체의 칼슘 농도에 미치는 영향을 보여줍니다. 녹색 독감 O 4 형광이 증가하고 적색 fu 적색 형광이 감소하며, 이는 세포 내 칼슘 농도 증가를 설명합니다.

이 기술은 약물 치료 또는 기타 조작 후 단일 이온 채널 및 개별 세포 수준에서 칼슘 유입의 변화를 모니터링할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 사용 가능한 여러 유전자 변형 설치류 모델을 고려하는 매우 강력한 도구입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자체적으로 함께 사용되는 클램프 실험인 전기 생리학뿐만 아니라 podocytes에서 칼슘 이온 측정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 기술은 정상 및 병리학적 조건에서 포도사이트(podocytes)를 사용한 칼슘 처리 조절에 대한 심층적이고 기계론적인 통찰력을 제공합니다.