Name: 갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 신장 사구체 족세포의 단일 채널 활성 및 칼슘 이미징 기법을 활용한 세포 내 칼슘 농도 변화 측정 방법입니다. 이 고효율 분석법은 실시간 칼슘 역학 연구에 활용됩니다.

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저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트, Inc.에) 감사의 말씀을 전합니다. 그레고리 블라스는 원고의 중요한 교정을 인정한다. 이 연구는 (AS에) 1-15-BS-172 및 DVI (에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동을 부여 건강 보조금 HL108880 및 미국 당뇨병 협회 (American Diabetes Association)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

동물 사용 및 복지 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 프로토콜 다음과 같은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수해야합니다. 1. 신장 세척 <ol><li> (그러나 다른 연령과 성별의 다른 균주에 따라 변경 사용할 수 있습니다, 스프 라그 돌리 변형이 제안) 8-12주 세 남성 쥐를 사용합니다. </li><li> IACUC 프로토콜에 의해 허용 된 절차에 따라 동물을 마취; 마취 깊이를 모니터링하고 동물을 검사한다. 수술의 상세한 설명은 1.3에서 수행되는 - 1.8 Ilatovskaya 외에서 찾을 수있다 (7). </li><li> 적절한 마취 후, 온도 조절 수술 테이블에 동물을 배치 (최대 길이 3 인치) 복부의 정중선 절개를하고, 대정맥과 대동맥을 발견. </li><li> 복강 및 상 장간막 동맥과 복부 주위에 합자를 삽입그 위의 대동맥; 결찰하지 않습니다. </li><li> 신장 동맥 아래 복부 대동맥을 해부하고, 주위에 두 개의 합자를 배치하지만, 결찰하지 않는 무딘, 다음 합자 위의 대동맥을 고정하고 밑실 넥타이. </li><li> 클램프 아래 (PBS로 가득 주사기 펌프에 부착) 폴리에틸렌 PE50 튜브와 대동맥을 카테 테르를 꽂다 두 번째 합자와 카테터를 해결; 클램프를 제거 펌프를 켜고 대동맥을 결찰 및 복강 동맥과 장간막. 빠르게 압력을 완화하기 위해 신장 정맥 절개를합니다. </li><li> / 분의 6 ml의 속도로 2 ~ 3 분 동안 프리 - 냉각 PBS로 대동맥 달이다. </li><li> 관류, 소비세를 중지하고 7 신장을 디 캡슐하고, PBS 용액에 얼음에 넣어. IACUC에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 동물을 안락사. </li></ol> 쥐 사구체 2. 분리 <ol><li> RPMI 1640에서 5 % BSA의 신선한 용액 30 ㎖를 준비합니다. </li><li> 면도날과 가위를 사용하여,모두 신장의 피질을 분리 한 다음 균일까지 말하다. 이 절차는 앞에서 설명 하였다 7. </li><li> 100 메쉬 스테인레스 강 체를 통해 이전 단계 동안 다진 조직을 밀어 주걱을 사용하여 (BSA / RPMI 5 % 용액에 미리 침지). 관류 및 중력에 의해이 플로우 스루는 140 메쉬 체를 통과 할 수 있도록 수집. </li><li> , 미리 적신 200 메쉬 체를 사용하여 체 140 메쉬로부터 수집 관류 필터 여과 액을 폐기하고 (10) 자체의 상단 세척 -에 침강 사구체를 수집하기 위해 제조 된 BSA / RPMI 용액 15 ml에 체. </li><li> 최대 20 분 동안 튜브의 하단 사구체 침전물을 15ml의 튜브에 얼음 사구체 함유 BSA / RPMI 용액을 넣고하자. 튜브의 하단에있는 사구체 농축 명확하게 볼 수 있습니다. 튜브에 약 2 mL를 떠나, 초과 솔루션을 제거합니다. </li></ol> 3. 단일 채널 패치 클램프 엘ectrophysiology <ol><li> MW 70,000로 코팅하여 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비 - 150,000 폴리 ʟ 라이신, 건조 할 수 있습니다. 커버 유리 당 물에 0.01 % 멸균 여과 된 용액의 약 30 μl를 사용합니다. </li><li> RT에 대한 실험 솔루션을 따뜻하게하고, 패치 클램프 챔버와 피펫을 입력합니다. TRPC 채널 모니터링의 경우, mM의에서 목욕 솔루션, 사용 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1, 10 HEPES, 2의 MgCl 2, 10 포도당, 산도 7.4; 피펫 : (126)의 NaCl, CaCl2를 1.5, 10 HEPES, 10 포도당; pH가 7.4. <ol><li> 추천 연구 (관련이 없습니다 내생 채널의 활동을 차단하는 피펫 솔루션에 억제제를 추가 있습니다 : 100 μm의 니플 룸산 또는 DIDS이 (칼슘 부활 CL 차단 - 채널), 10 mM의 차 (을 억제하는 큰 컨덕턴스 칼슘 + - 의존적 K + 채널), 10 나노 iberiotoxin (,)를 10 μM 니 카르 디핀 칼슘 부활 K + 채널을 차단하는 (N 형 칼슘을 차단2+ 직접 패치 클램프 실험 전 채널)). </li></ol></li><li> 조심스럽게 사구체 함유 용액을 혼합 한 후 폴리 ʟ 라이신 코팅 커버 유리 칩에 약 50 μl를 적용합니다. 사구체는 약 5 분 동안 연결하자. </li><li> 패치 - 클램프 챔버 욕 용액으로 미리 충전하는 사구체으로 유리 절삭 가루를 이동; 부착 사구체의 제거를 보장하기 위해 1 분 / mL의 3 분의 속도로 관류 챔버. </li><li> 세포 부착 모드 7에서 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 유리 피펫 (7 - 10 MΩ 피펫 저항) 피펫 부드러운 흡입 (고립 사구체의 표면에 발 세포 부착 피펫을 적용하여 발 세포 막 사이에 고 저항 시일을 형성하기에,도 2에 도시 왼쪽). </li><li> 세포 부착 된 측정을 위해 팔 극 베셀 필터에 의해 300 Hz에서 전류를 낮은 패스. </li><li> 유6 시간 - SE는 최대 4에 대한 패치 클램프 실험에서 사구체를 격리합니다. 얼음에 주식 사구체의 비율을 유지합니다. </li></ol> 족 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 4 비례 공 초점 형광 측정 <ol><li> 원뿔 튜브 0.5 ml의 (2.5에서 설명) 사구체 분획 500 μl를 넣고 칼슘 염료의 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전를 추가합니다. 2 mM의과 (DMSO에 용해 -20 ° C에서 저장,)은 Fura 레드, AM 및 FLUO-4, 오전, 각각의 1 mM의 재고 농도를 사용하여 사구체 분획 500 ㎕를 각 염료의 2.5 μl를 사용합니다. 즉시 염료 첨가 후 알루미늄 호일로 커버 튜브. </li><li> 실온에서 1 시간에 적어도 20 분까지를위한 회전하는 통에 장소 튜브. 주 : 약리 제제는이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><li> , 커버 글라스를 준비 폴리 ʟ 라이신로를 커버하고 70 ℃로 가열 플레이트 세트를 사용하여 건조 할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 염료 로딩 COMPLET되면E는, 폴리 리신 코팅 ʟ 커버 슬립을 함유 용액 사구체 100 μL를 적용하고 약 5 분 동안 표면에 충실하자. 촬상 챔버 내로 사구체 부착 된 커버를 장착하고 욕 용액 (() mm 단위 함유 :의 MgCl 2 (145)의 NaCl, 4.5 KCl을, 2, 10 HEPES, pH가 7.35)으로 관류 3 ㎖의 속도 / 분 제거 사구체 부착하고 나머지 염료. </li><li> 488 nm의 여기 파장과 방출 필터 (각각 FLUO-4의 Fura 레드에 대한 25분의 525과 25분의 650 nm의)에 공 초점 레이저 주사 현미경을 설정합니다. 원하는 주파수와 해상도 이미징 소프트웨어를 설정합니다. </li><li> 시야에서 사구체를 찾아 다음 형광 신호의 검출을 켭니다. 신호의 포화를 피하기 위해 각각의 염료에 대해 레이저의 강도를 조정한다. 직접 유리에 부착 된 족 세포에 초점면을 선택합니다. 이는 약물에 반응 사구체의 수축에 의한 영향을 최소화신청. 선택의 사구체가 아니라 유리에 연결되어 있는지 다시 확인; </li><li> 선택의 초점면을 이미징 시작, (높은 해상도 이미지에 대한 60X / NA 1.4 또는 유사한 대물 렌즈를 사용합니다. 빠른 칼슘 과도 변화를 시각화하기 위해 4 초에서 설정 한 주파수로 512 X 512 이미지를 가지고) 관심의 약물을 적용 하고 응답을 기록합니다. <ol><li> (사구체 족 세포의 표면 상에 이미징을 보장하기 위해 가능한 한 유리 표면에 가까운) 원하는 초점면을 선택한다. Fluo4 및 FuraRed 채널에 형광의 강도를 확인하고, 사구체 분명히 시야에서 볼 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 영상을 시작합니다. 어떤 약물의 응용 프로그램을하기 전에, 기본 형광 기록 적어도 1 분은 신호가 (이 갑작스런 스파이크가 없거나 신호의 페이딩) 안정적인지 확인합니다. </li><li> 마이크로 피펫의 도움으로 원하는 약물을 적용; 주의 및 약물이 잘 확산 할 수 있었다 확인하고 glomer에 도달ulus. 필요한 경우, 상기 선택된 초점면을 감시하고 있기 때문에 약물 애플리케이션의 초점이 이동되지 않았다는 것을 확인 부드럽게 욕 용액을 섞는다. </li><li> Fluo4 및 FuraRed 신호에 대한 형광 강도의 변화를 기록한다. 녹음이 신호가 고원 수준에 도달 또는 피크에 도달 한 후베이스 라인으로 복귀 할 때까지 대기하여 충분히 긴 있는지 확인합니다. 필요한 경우 솔루션의 변경 또는 다른 약물의 추가를 수행합니다. </li><li> 녹음을 중지하고 소프트웨어의 기본 형식으로 파일을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 칼슘 측정 5. 이미지 분석 <ol><li> 기본 ND2 형식으로 이미지를 가져 오기 할 수 있습니다 ND 유틸리티 플러그인을 갖춘 ImageJ에 열려있는 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다. </li><li> 이미지 시퀀스를 가져옵니다; 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오. </li><li> O에 ImageJ에 소프트웨어의 분석 → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자 경로를 따라펜 투자 수익 (ROI) 관리자 창. 타원형 선택 도구 및 투자 수익 (ROI) 관리자의 &quot;추가 (T)&quot;기능을 사용하여 관심 (족 세포)의 여러 지역을 선택합니다. ROI 마지막으로, 배경 영역을 선택; (저장 → 기타) 선택된 ROI를 저장합니다. </li><li> 분석을 위해 선택된 채널을 포함하는 윈도우를 강조. , 투자 수익 (ROI) 관리자에서 멀티 측정 기능 → 이상을 사용 튀어 나올 대화에서 &quot;하나의 행 조각 당&quot;상자를 표시 한 다음 확인을 클릭합니다. 선택 집합 측정 → 메뉴 옵션의 결과에 입력 &quot;회색 평균치&quot;와 표시되는 각 ROI에 대한 화소 강도 값을 계산 : 결과는 결과 창에서 설정 될 수 형식으로 표시 될 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 별도의 컬럼에서 결과 창. </li><li> 바람직한 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (FLUO-4의 Fura 레드)에 대한 ROI 측정 강도 값을 복사; 각 DAT에서 빼기 배경 강도 값점. </li><li> 각 시점의 Fura 들어 레드 채널 FLUO-4의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각각의 투자 수익 (ROI)에 대한 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간 변경. 선택 사구체에 대한 평균 / SE 값을 계산합니다. 참고 : 시간 ​​열은 4.5에서 선택한 영상 주파수에 따라 설정해야합니다. </li></ol> FLUO-4 형광 신호를 이용하여 제 세포 내 칼슘 농도 계산 <ol><li> 사구체의 샘플을 가지고 4.7 단계로 실험 프로토콜을 수행합니다. 배경 형광의 기록 후에 조 용액 및 기록 형광 강도 증가 (10 μM이어야 화장실 실내에 최종 농도) 이오 노마 이신을 추가한다. 강도가 최대에 도달하고 붕괴가 시작되면, MnCl 2 추가 8 형광을 켄칭 (최종 농도 5 mM의이어야). </li><li> 6.1에서 얻어진 데이터를 분석한다. 수득 FLUO-4 ROI 신호 세기 값이있어서 복사선호하는 분석 소프트웨어에 의해 5.1-5.5에 설명 된 프로토콜. </li><li> 수식을 이용하여 ROI에 대응 발 세포에서 (㎚)에서 세포 내 칼슘 농도를 계산한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> K d를 FLUO-4 (345 ㎚)에 대한 일정한 소정 해리이고, F는 (기준)에 대한 칼슘 농도를 산출하는 평가시기에서의 세기는이고, F 최소 및 F 최대의 강도 값이며 (이오 노마 이신 신청 후) 및 (MnCl 2) 형광의 담금질 후의 칼슘 최대 하중 점의 각각 (도 3 참조). </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 방법은 설치류 사구체의 족 세포에 의한 칼슘 처리의 분석을 위해 수 있습니다. 이 기술은 패치 클램프 단일 채널 전기 생리학 및 형광 비율 계량 공 초점 영상의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 그러나, 두 방식은 자신에, 별도로 사용할 수있다. 제안 된 프로토콜은 1) 신장 플러시 등 여러 상대적으로 간단한 단계를 가지고있다; 2) 차동 체질에 의한 사구체의 분리; 3) 패치 클램프 전기 생리학 실험을 수행, 또는 세포 내 칼슘의 변화의 비율 계량 공 촛점 이미징을위한 형광 칼슘 라벨 염료와 사구체의 배양. 사구체 Gloy에 기초하여 수정 된 프로토콜을 분리하려면 외. (5)를 사용 하였다. 차동 체질의 현재 기술의 주요 장점은 복잡하고 시간 소모적 인 단계를 필요로하지 않는, 따라서 보우만 캡슐 스트리핑 사구체 발생하고 있다는수동 캡슐화의. 격리 된 부분에서 사구체의 대부분이 디 캡슐 레이트, 그러나 연구원도 캡슐화 사구...

신장은 다양한 물질에 대한 항상성 균형을 유지하고 전체의 혈압을 결정하는 방식으로 혈액량을 조절한다. 하이퍼 또는 저혈압에 이르기까지의 신장의 여과, 재 흡수 또는 분비 리드의 장애 또는 동반 병적 인 상태는, 결국 신장 이식을 필요로 무대 신장 질환을 종료합니다. 모세 혈관 내피, 기저막 및 상피 세포의 단세포 층 - - 슬릿 다이어프램 무결성 및 기능 (1)의 유지에 중요한 역할을 족 세포, 신장 필터링 부 (사구체)은 3 개의 층으로 이루어져있다. 투과성 사구체 필터 부전은 단백뇨와 같은 거대 분자의 소변 손실이 발생합니다. 각종 제제는 사구체 여과 장벽의 완전성을 결정 족 세포 및 그들의 발 프로세스의 구조에 영향을 미칠 수있다. 족 세포는 glom의 유지에 관여eruli 여과 기능. 이는 발 세포 부적절한 칼슘 처리가 세포 손상에 이르게하고 병증 2,3- 다양한 형태의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 확립되어있다. 따라서, 발 세포의 기능 연구를위한 수단이 될 것입니다 세포 내 칼슘 농도의 변화를 직접 측정 가능하게하는 모델의 개발. 격리 사구체 이전 알부민 반사 계수의 측정 (4) 및 전체 셀 전기 생리 패치 - 클램프 측정 5,6-에서 적분 셀룰러 전류의 평가를 변경 포함한 수많은 연구에 사용 하였다. 본 논문에서는, 약학 제제의 적용에 응답하여 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 세포 내 칼슘의 기저 레벨을 추정하고, 개별 칼슘 채널의 활성을 평가하기 위해 연구를 허용하는 프로토콜을 기술한다. Ratometric 칼슘 농도 측정 및 패치 클램프 electrophysiology 각각 발 세포 및 채널 활동 내에서 세포 내 칼슘 농도의 변화를 결정하는데 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>DMSO 내 500 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>용액</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>튜브 회전기</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>독일</td></tr><tr><td>Nikon 공초점 현미경 (도립형)</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>레이저 여기 488 nm. 방출 필터 500-550 nm 및 570-620 nm</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>실리콘 화합물</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>기록/관류 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 획득 시스템</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; 시스템</td></tr><tr><td>저역 통과 필터</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 pole Bessel</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>화염/Brown 방식 마이크로피펫 풀러</td></tr><tr><td>마이크로포지</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>일본</td></tr><tr><td>전동 마이크로매니퓰레이터</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>미세진동 격리 테이블</td><td>TMC</td><td></td><td>패러데이 케이지 장착</td></tr><tr><td>다채널 밸브 관류 시스템</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>기록/관류 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Niflumic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>항생제 제외</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% 알부민 용액</td></tr><tr><td>온도 조절 수술대</td><td>MCW core</td><td></td><td>설치류용</td></tr><tr><td>강철 체</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>mesh 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>CD-1용 스크린</td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>주입 펌프 기반 관류 시스템</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane 마취기</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>기타 기본 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (신장 사구체 상피 세포)는 사구체 투과성을 조절하고 사구체 구조를 유지하는 것으로 알려져 있습니다. podocyte 손상이 단백뇨와 발 과정 소실로 이어지기 때문에 다양한 신장 질환의 발병기전에서 이러한 세포의 중요한 역할이 확립되었습니다. 이전에 다양한 내인성 물질이 podocytes의 세포 내 Ca2+ 농도에 극적인 과부하를 일으켜 알부민뇨를 유발할 수 있다고 보고되었으며, 이는 칼슘 전도성 이온 채널을 통해 발생할 가능성이 높습니다. 그러므로, 정상적인 조건과 다양한 병리학적 상태 모두에서 podocytes의 칼슘 취급을 연구하는 것이 중요해 보였습니다. 그러나 사용 가능한 실험적 접근 방식은 배양 및 형질 주입된 세포에 다소 제한되어 있습니다. 그것들은 그러한 연구를 위한 좋은 기본 모델을 나타내지만, 본질적으로 사구체의 고유 환경에서 추출됩니다. 여기에서 우리는 갓 분리된 전체 사구체의 일부로 podocytes를 연구하는 방법론을 설명합니다. 이 제제는 여전히 모세혈관에 붙어있는 podocytes의 기능적 잠재력을 유지합니다. 따라서 podocytes는 사구체 여과 장치의 주요 부분을 보존하는 환경에 남아 있습니다. 본 원고는 1) 비율계량 공초점 형광 현미경의 도움으로 칼슘 농도 변화를 실시간으로 감지하고 2) 갓 분리된 사구체의 podocytes에서 단일 이온 채널 활성을 기록할 수 있는 두 가지 실험적 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이러한 방법론은 사구체의 고유 환경의 장점을 활용하여 연구자가 다양한 제제의 적용에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 처리의 급격한 변화를 해결하고, 세포 내 칼슘의 기초 농도를 측정하고(예: 질병 진행 평가를 위해), 단일 이온 채널 수준에서 칼슘 전도도를 평가 및 조작할 수 있습니다.

여기에서는 족 세포에서 칼슘 농도 급성 변화를 측정하는 문제를 해결. 1 갓의 족 세포에서 고해상도 실시간 형광 공 초점 이미지 및 단일 이온 채널 활성 레코딩을 수행하기 위해 설계된 실험 프로토콜의 개략도를 나타낸다 고립 된 쥐 사구체. 쥐를 마취 한 후 간단히, 신장은 피를 취소 PBS로 플러시해야합니다. 그런 다음, 신장 절제와 디 캡슐화하고, 사구체는 차동 체질에 의한 신장 피질에서 분리되어 있습니다. 시료의 일부는 패치 - 클램프 분석을 위해 취해질 수 있으며, 나머지는 형광성 칼슘 염료 FLUO-4 AM과의 Fura 레드로드 될 수 있고, 공 초점 비율 적 칼슘 이미징을 수행하기 위해 AM. 단일 이온 채널 활성의 측정은 전기 생리 사구체 차단 후 즉시 수행 될 수있다. 이온 차의 활동nnels 패치 - 클램프 방법의 세포 부착 및 전체 셀 구성에서 모두 측정 할 수있다. 도시 된 접근법의 타당성을 입증하...

podocytes 내 세포 내 칼슘 수치의 변화는 사구체의 여과 기능을 제어하는 가장 중요한 수단 중 하나입니다. 여기에서는 갓 분리된 사구체의 podocytes에서 실시간 칼슘 처리 및 단일 이온 채널 활성을 검출할 수 있는 high-throughput 접근법에 대해 설명합니다.

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

본 절차의 전반적인 목표는 약리제에 반응하여 나타나는 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것입니다. 갓 분리한 사구체 전체의 일부로서 족세포의 기저 칼슘 수치를 추정하고 개별 채널 활성을 평가합니다. 이는 먼저 복부 대동맥을 통한 세척으로 쥐 신장의 혈액을 제거함으로써 수행됩니다.다음으로, 신장을 적출하고 신장 피질을 분리한 후 면도날로 잘게 다집니다. 세 번째 단계에서는 차등 원심분리를 통해 피질 사구체를 분리합니다. 이후, 분리된 무혈관 사구체를 전기생리학적 실험에 사용하거나 형광 염료를 주입하여 공초점 칼슘 농도 측정에 사용할 수 있습니다.궁극적으로, 이러한 절차를 통해 연구자들은 다양한 약제 처리에 반응하여 세포 내 칼슘 핸들링에서 일어나는 급격한 변화를 분석하고, 단일 이온 채널 수준에서 칼슘 전도도를 평가 및 조절할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 분리된 전체 사구체 일부로서 족세포를 연구할 수 있다는 점입니다. 본 준비법은 족세포의 기능적 잠재력을 유지합니다.이들은 모세혈관에 부착된 상태를 유지하며, 실제로 사구체 여과 장치의 주요 부분을 보존할 수 있는 환경의 항상성에 참여합니다. 이 기술의 함의는 당뇨성 신증, 국소 분절 사구체 경화증 또는 고혈압과 같은 질환에서 신장 합병증의 발생 및 예방에 있어 족세포의 칼슘 처리 메커니즘이 수행하는 필수적인 조절 역할로 인해, 정상 및 병리 상태에서의 약물 스크리닝 범위를 확장합니다. 따라서 이러한 세포에서 약물에 대한 칼슘 유입의 반응성을 관찰하는 것은 매우 중요하며, 이는 용이하게 스크리닝될 수 있습니다.본 준비 과정에서 VLA Hunka는 이후 절차를 위해 신장을 세척하는 방법을 시연하겠습니다. 저는 사구체 분리와 V 클램프 전기생리학을 보여줄 것이며, Dr.GaN이 공초점 칼슘 이미징 과정을 안내할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 쥐를 온도 조절 수술대 위에 놓으십시오. 현미경 하에서 복부 중앙을 절개하여 하대정맥(CVA)과 대동맥을 노출시킵니다.다음으로, 복강동맥과 상장간막동맥, 그리고 그 위쪽의 복부 대동맥 주위에 결찰사를 삽입합니다. 신동맥 아래쪽의 복부 대동맥을 둔성 박리합니다. 그런 다음 그 주위에 결찰사 두 개를 배치하되, 결찰하지는 않습니다.결찰사 위쪽의 대동맥을 클램프로 고정하고 아래쪽 실을 묶습니다. 그 후, 클램프 아래쪽에서 PBS가 채워진 시린지 펌프에 연결된 폴리에틸렌 튜브로 대동맥에 카테터를 삽입하고, 두 번째 결찰사로 카테터를 고정합니다. 그런 다음 클램프를 제거하고 결찰합니다.장간막 동맥과 복강 동맥을 측정합니다. 대동맥에 미리 냉각시킨 PBS를 분당 6 mL의 속도로 3분 동안 주입합니다. 동시에, 압력을 완화하기 위해 신정맥 근처의 하대정맥을 절개합니다.3분 후, 관류를 중단하고 신장을 절제하여 캡슐에 담습니다. 이를 얼음 위에 놓인 PBS 용액에 넣습니다. 이제 RPMI 1640 배지에 신선한 5%BSA 30 milliliters를 준비합니다.면도날과 가위를 사용하여 양쪽 신장의 피질을 분리한 후, 균질해질 때까지 세절합니다. 다음으로, 5% P-S-A-R-P-M-I 용액에 미리 적셔둔 100 mesh 스테인리스 스틸 체에 세절된 조직을 밀어 넣습니다. 통과한 액체를 수집하여 140 mesh 체에 한 번 더 통과시킵니다.그 후, 미리 적셔둔 200 mesh 체를 사용하여 140 mesh 체에서 수집된 여과액을 필터링합니다. 여과액은 버리고, 상단 체를 준비된 B-S-A-R-P-M-I 용액 10 to 15 milliliters로 세척하여 체 상단에서 사구체를 수집합니다. 다음으로 사구체가 포함된 B-S-A-R-P-M-I 용액을 15 milliliter 원심분리관에 넣고, 사구체가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 최대 20분 동안 방치합니다.본 절차에서는 5x5 mm 커버 글라스 칩을 분자량 70,000~150,000의 poly lysine으로 코팅한 후 가열 플레이트 위에서 건조합니다. 다음으로, 실험 용액을 상온으로 데우고 패치 클램프 챔버와 피펫을 채웁니다. 사구체가 포함된 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음, polylysine이 코팅된 각 커버 글라스 칩에 해당 용액을 약 50 µL씩 도포합니다.그 후, 사구체가 포함된 유리 칩을 Beth 용액이 미리 채워진 패치 클램프 챔버로 옮깁니다. 세포 부착 모드(cell attached mode)로 일반적인 패치 클램프 기록을 수행하기 전, 3 mL/min의 속도로 1분 동안 챔버를 관류하여 부착되지 않은 사구체를 제거합니다.이제 각 0.5 milliliter 원추형 튜브에 사구체 분획 500 microliters를 넣고 칼슘 염료인 pure red am과 flu oh 4:00 AM을 첨가합니다. 다음으로, 튜브를 회전 쉐이커에 올리고 상온에서 최대 1시간 동안 반응시킵니다. 그동안 유리 커버슬립을 polylysine으로 처리하고 70 degrees Celsius의 가열 플레이트 위에서 건조시킵니다. 칼슘 염료의 로딩이 완료되면, polylysine이 코팅된 커버슬립에 사구체가 포함된 용액 100 microliters를 도포하고 약 5분 동안 표면에 부착되도록 둡니다.그런 다음 사구체가 부착된 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하고, 분당 3 mL의 속도로 배스 용액을 관류하여 부착되지 않은 사구체와 남아 있는 염료를 제거합니다. 이후 공초점 레이저 주사 현미경의 들뜸 파장을 488 nm로 설정합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어에서 원하는 주파수와 해상도를 설정합니다.다음으로, 명시야(brightfield)에서 사구체를 찾습니다. 이어서 형광 신호 검출 기능을 켭니다. 그 후, 원하는 초점 평면을 선택하고 flu oh four 및 firo red 채널에서 형광 강도를 확인합니다.명시야(brightfield)에서 사구체가 명확하게 보이는지 확인하십시오. 그 다음 flu oh four 및 furor red 신호의 형광 강도 변화를 기록하십시오. 이미지 시퀀스를 가져오려면 채널을 분리하고 하이퍼스택 그레이스케일(hyper stack gray scale) 모드를 사용하십시오.Image J 소프트웨어에서 analyze tools, ROI Manager 경로를 통해 ROI manager 창을 엽니다. oval selection 도구와 ROI manager의 add T 기능을 사용하여 하나 이상의 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 그런 다음 배경 영역을 선택하고 선택한 ROI들을 저장합니다.다음으로, 대화 상자에서 슬라이스당 한 행(one row per slice) 확인란을 선택하고 메뉴 옵션 결과에서 확인을 클릭합니다. 측정 항목을 설정합니다. 평균 회색값(mean gray value)을 선택하면 각 ROI에 대한 픽셀 강도 값이 계산되며, 이는 결과 창에 별도의 열로 표시됩니다.그 다음 각 ROI에 대해 각 채널에서 측정된 ROI 강도 값을 선호하는 데이터 분석 소프트웨어로 복사하고, 각 시간 지점의 각 데이터 포인트에서 배경 강도 값을 뺍니다. 이후 flu oh four와 URA red 채널의 강도 비율을 계산한 다음, 각 ROI에 대한 칼슘 과도 현상의 시간 경과 변화를 그래프로 나타냅니다. 이 이미지는 쥐 사구체 표면의 산화물 바디에 부착된 패치 클램프 피펫을 보여줍니다.전기생리학적 기록 중에 이미지의 오른쪽 하단 모서리에서 캡슐화된 사구체의 일부를 확인할 수 있습니다. 여기 세포 부착 패치를 통해 족세포(podocyte)에서 측정된 세포 내 칼슘 농도의 TRP 유사 채널 활성을 나타내는 대표적인 전류 트레이스가 제시되어 있습니다. 세포 내 칼슘을 표지하기 위해 사구체에 Fluo-4 AM을 로딩하였습니다.이 영상은 사구체 내 칼슘 유입에 미치는 CIN과 염화 망간의 영향을 보여줍니다. 이 그래프는 CIN과 염화 망간에 반응하여 단일 족세포에서 기록된 flu oh four 신호 강도의 변화를 정량화한 것입니다. 예상대로 CIN은 최대 형광을 생성하며, 염화 망간은 염료를 소광시켜 가장 낮은 형광 강도를 나타냅니다.이러한 약물을 처리하면 연구자가 나중에 세포 내의 정확한 칼슘 농도를 정의할 수 있습니다. 이 영상은 10 µM a TP가 사구체의 칼슘 농도에 미치는 영향을 보여줍니다. 녹색 Fluo-4 형광은 증가하고 적색 FuRed 형광은 감소하며, 이는 세포 내 칼슘 농도의 증가를 나타냅니다.이 기술은 약물 처리나 기타 조작 후 단일 이온 통로 및 개별 세포 수준에서 칼슘 유입의 변화를 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 사용 가능한 다양한 유전자 변형 설치류 모델을 고려할 때 매우 강력한 도구가 됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단독으로 또는 전기생리학적 전압 클램프 실험과 함께 사용하여 포도사이트에서 칼슘 농도 측정을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 기술들은 정상 및 병리적 상태에서 족세포(podocyte)의 칼슘 처리 조절에 대한 심층적이고 기전적인 통찰을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

이 프로토콜의 목표는 진동 절면을 사용하여 마우스 신장 골반의 그대로 심박 동기 영역을 분리하는 것입니다. 이러한 섹션은 시투 Ca2+ 이미징에서G박 조정기 세포 및 진동 성 슬라이스의 다른 중간 세포의 일시적인 특성을 해명하는 데 사용할 수 있습니다.

진동 및 이미징 라이브, 진동 절제에 의해 마우스 신장 골반의 그대로 페이스 메이커 영역

제시된 방법은 확장 현미경으로 형광 표지된 세포 단백질의 시각화를 가능하게 하고 전통적인 현미경에 70 nm의 해상도로 이끌어 냅니다.

확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰

세포 칼슘 이미징은 독특한 기능적 시그니처를 제공하는 칼슘 투과성 채널 / 수용체의 발현을 기반으로 개별 세포, 배양 또는 각성 동물의 혼합 집단에서 동적 신호 전달을 연구하는 다목적 방법론입니다.

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

배우세요 신장 사구체 족세포의 단일 채널 활성 및 칼슘 이미징 기법을 활용한 세포 내 칼슘 농도 변화 측정 방법입니다. 이 고효율 분석법은 실시간 칼슘 역학 연구에 활용됩니다.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

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