신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

다음 실험의 전반적인 목표는 신경 발달 장애의 모델로서 Grailed two knockout 마우스에서 공간 학습에 따른 해마 인산화의 변화를 감지하는 것입니다. 이것은 먼저 Morris 물 미로에서 야생형과 성배에서 두 마리의 녹아웃 마우스를 테스트하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 마우스의 뇌를 제거하고 야생형 마우스와 녹아웃 마우스의 슬라이스를 바이옴 절단으로 준비합니다.

다음으로, 야생형 마우스와 녹아웃 마우스의 뇌 절편을 면역조직화학을 위해 처리하고 해마의 인산화 변화를 감지하는 데 사용합니다. 그 결과, 면역조직화학 염색에 대한 광학 현미경 시각화를 기반으로 한 야생형과 성배 2마리의 녹아웃 마우스 간의 해마 RC 인산화의 차이를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 Maurice 물 미로와 같은 해마 의존 특수 학습 과제 후에 활성화되는 해마 뉴런의 특정 하위 집합을 식별할 수 있습니다.

우리는 자폐 스펙트럼 장애에 대한 마우스 모델인 2등급 녹아웃 마우스의 분자 결핍을 강조하는 분자 캐스케이드를 조사하기로 결정했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 추가했습니다. 시작하려면 Morris Water Mae와 같은 공간 학습 과제에서 다양한 관심 배경을 가진 마우스를 훈련시킵니다. 훈련 기간이 끝날 때 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 훈련 요법을 따르고, 생쥐를 안락사시킨 다음 뇌를 고정하고 제거합니다.

절차를 계속할 준비가 되면 메스를 사용하여 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 뇌의 나머지 부분을 비브라토의 홀더 플레이트에 똑바로 붙입니다. 뇌를 등쪽 해마 전체에 걸쳐 20-40미크론 두께의 연속된 부분으로 자릅니다.

각 슬라이스를 1밀리리터의 0.1몰 PBS로 채워진 24웰 플레이트의 한 웰로 옮기고, 각 마우스에 대해 3-5개의 등쪽 해마 절편을 각각 500마이크로리터의 0.1몰 PBS를 포함하는 24개의 다중 웰 플레이트의 웰로 이동합니다. 각 웰에 포함된 단면을 500마이크로리터의 0.1몰 PBS로 잘 세척하고, 달리 언급되지 않는 한 부드러운 교반으로 실온에서 모든 세척 및 배양을 수행합니다. 흄 후드 아래에서 내인성 과산화효소 활성을 소멸시키기 위해 20분 동안 0.1몰 PBS에 40% 메탄올, 1% 과산화수소 단면을 배양합니다.

0.1몰 PBS에서 3회 더 세척한 후 절편이 배양되는 동안 5분 동안 0.2% Triton X 100의 500마이크로리터에서 절편을 배양하여 절편을 투과하고 전체 실험을 위한 충분한 차단 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 투과성 용액을 제거하고 각각에 100마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다. 한 시간 동안 섹션을 잘 배양하십시오.

다음으로, 차단 완충액을 제거하고 인산화된 세포외 조절 키나아제로 섹션을 덮습니다. 1차 항체는 차단 완충액에서 1에서 500으로 희석되었습니다. 0.1 어금니 PBS에서 5분 동안 절편을 3회 세척한 후 다음날 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 밤새 절편을 배양합니다.

각각은 배양 중 실온에서 1시간 동안 차단 완충액에 1 내지 250으로 희석된 비오틴 접합 2차 항체로 절편을 배양합니다. Aden과 비오틴 복합체가 형성될 수 있는 충분한 시간을 확보하기 위해 사용 최소 30분 전에 A BC 시약을 준비합니다. 0.1 몰 PBS로 절편을 3회 더 세척한 후 A, b, C 시약을 첨가하고 45분 동안 샘플과 함께 배양합니다.

PBS에서 다음 세 번 세척 세트 동안 제조업체의 사양에 따라 흄 후드에서 DAB 작업 용액을 준비하고 플레이트에 DAB 작업 용액을 분취합니다. 그런 다음 DAB 작업 용액이 포함된 웰로 섹션을 옮기고 플레이트를 천천히 소용돌이쳐 섹션에 섹션이 용액에 최대한 노출될 수 있도록 합니다. 적절한 신호가 발생할 때까지 현미경에서 DAB 반응을 모니터링합니다.

약 2-5분 후에 0.1 몰 PBS로 조직을 세척하여 원하는 색상 강도로 반응을 멈춥니다. PBS에서 세 번 더 세척한 후 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 장착하고 실온에서 최소 3-4시간 동안 건조시킵니다. 공기 건조되면 흄 후드에서 슬라이드를 전사하고 통합 에탄올 용액을 각각 2분 동안 순차적으로 배치하여 섹션을 탈수한 다음 5분 동안 100% 자일렌에서 슬라이드를 청소합니다.

장착 매체를 사용하여 슬라이드를 덮고 미끄러뜨린 다음 밤새 흄 후드에 그대로 두어 슬라이드를 건조시키고 카메라와 20 x 대물 렌즈가 장착된 명시야 현미경으로 옮깁니다. 등쪽 해마 이미지를 포함하는 200배 배율로 각 섹션에서 여러 개의 명시야 이미지를 획득합니다. 각 동물에서 3-5 개의 섹션.

여기에 표시된 것은 야생형 마우스와 인산화로 염색된 Grailed two knockout 마우스의 등쪽 하마 campi 영역의 단면입니다. 세포외(extracellular)는 학습 의존성 뉴런 활성화에 대한 신뢰할 수 있는 분자 판독을 조절했습니다. 이 두 쥐는 모두 고전적인 해마 의존 공간 학습 과제 요법인 제사 전에 Morris 물 미로를 거쳤습니다.

테스트 마지막 날, Grailed 두 녹아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 상당한 공간 학습 결핍을 보였습니다. 생쥐의 뇌 절편을 분석하기 위해, 해마의 다양한 영역에 걸쳐 양성 세포의 총 수를 계산했습니다. CA 3 파라미터 레이어에서 야생형 마우스는 녹아웃 마우스보다 면적당 훨씬 더 많은 인산화된 RK 양성 세포를 가지고 있었습니다.

정반대의 결과는 hili 및 granule cell layer 또는 GCL에서 발견되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인지 결함을 특징으로 하는 신경 발달 장애의 유전적 및 약리학적 마우스 모델의 해마에서 뇌 절편에 대한 phos 제형을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 또한 다른 뇌 영역의 irk force 공식화 변화를 연구하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 Maurice Water 미로와 다른 인지 행동 작업을 따르는 데 사용할 수 있습니다.

DIA 벤진으로 작업하는 것은 극도로 탈영병이 될 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보호구를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.